Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
SkyGen Участник Москва |
Под доступностью мы понимаем цены близкие или равные европейским, собственный склад реактивов и оборудования, доставку за 1-3 дня в любой крупный город России. Иными словами, мы делаем все возможное, чтобы поставить Вам качественную продукцию, недорого и быстро. Мы начали с New England Biolabs и у нас получилось! Мы верим в то, что чтобы быть близким к Вам, недостаточно просто выставлять счета и осуществлять доставку. «Логистических» и «каталожных» компаний много и все они известны. Нам же важно глубоко разобраться в теме и быть поддержкой для Вас. Для этого мы публикуем новости, обзоры и высоко ценим любые замечания и критику. Каждый продукт мы «пропускаем» через себя. Анализируем плюсы и минусы, представляем, как и где он будет работать, консультируемся с Вами. И, как результат, создаем методички, семинары и презентации. Мы стараемся угнаться за Вами в научном познании мира, мы стараемся учиться и расти вместе с Вами. Даже уйдя из науки, мы все равно остались в душе искателями и открывателями. Пусть наша работа будет полезна Вам - и в этом мы видим свою реализацию. Мы являемся официальными дистрибьюторами New England Biolabs, QIAGEN, Agilent Technologies, Oxford Nanopore Technologies, 10x Genomics, Macherey-Nagel, NIMAGEN, IDT, Thermo Scientific, SIGMA-ALDRICH, ChemGenes, Bio Molecular Systems, Gilson. У нас есть сервисная служба. Мы осуществляем обслуживание, калибровку и поверку дозаторов, лабораторных весов и ПЦР-амплификаторов различных производителей, а также занимаемся организацией валидации оборудования IQ/OQ. Сообщение было отредактировано SkyGen - 12.02.2018 15:54 |
SkyGen Участник Москва |
Все большее внимание в последние годы уделяется методам севенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing, NGS), которые благодаря своей высокой производительности постепенно вытесняют другие методики, такие как, например, автоматическое секвенирование по Сэнгеру. В сегодняшнем обзоре мы расскажем, что же представляет собой NGS, и какие продукты компании New England Biolabs помогут решить задачи по секвенированию образцов ДНК и РНК. На первом этапе давайте ответим на вопрос: что такое NGS? Технологии секвенирования NGS основаны на анализе последовательности присоединяемых нуклеотидов в множестве происходящих параллельно реакций амплификации. На сегодняшний день, наиболее распространенными платформами для секвенирования являются Illumina®, 454™, SOLiD™, Ion Torrent&trade. Каждая компания-производитель использует свой собственный подход для детекции присоединяемого нуклеотида. В целом, если вы поставите перед собой задачу провести секвенирование образца с использованием NGS, следующий алгоритм действий, при правильной постановке экспериментов, обеспечит требуемый результат: 1. Выделить образец ДНК/РНК 2. Подготовить образцы для проведения секвенирования: получить библиотеку, годную для дальнейшего секвенирования. Библиотека NGS - это совокупность фрагментов исследуемого образца ДНК/РНК одинаковой длины, при этом каждый из фрагментов модифицирован соответствующим для своего метода образом. 3. Загрузить библиотеку в секвенатор и получить массив данных с информацией о последовательности различных фрагментов библиотеки. 4. Проанализировать полученные данные с использованием программы-сборщика и сформировать последовательность ДНК/РНК целиком. Несмотря на кажущуюся простоту алгоритма анализа, существует огромное количество подводных камней и деталей, которые необходимо учесть при проведении эксперимента. Общие рекомендации при подготовке библиотек ДНК Используйте самые качественные образцы ДНК из доступных. Качество исходного материала напрямую влияет на характеристики полученной библиотеки. Для оценки целостности и степени загрязненности ДНК можно использовать электрофорез. Смазанные полосы или «лестницы» на геле свидетельствуют о повреждении ДНК или о попадании в пробу детергентов или загрязняющих веществ. Наличие РНК можно детектировать внизу геля. С помощью измерения поглощения в УФ также можно оценить чистоту образца. В идеальных пробах соотношение оптического поглощения при 260 и 280 нм должно быть порядка 1,8 – 2,0. Однако на результаты этих измерений может повлиять наличие в пробе РНК или коротких фрагментов ДНК. Очень важно точно оценить исходное количество ДНК, используемое для создания библиотеки. Использование флуоресцентных красителей, специфично связывающихся с двуцепочечных ДНК позволяет измерять количество ДНК намного точнее, чем измерения в УФ (Qubit, Life Technologies). Этот метод позволяет исключить вклад загрязнителей, РНК и коротких фрагментов ДНК. Для очистки ДНК после каждого из этапов пробоподготовки,согласно протоколу NEBNext, рекомендуется воспользоваться AMPure XP® Beads (Beckman Coulter, Inc). Общие рекомендации при подготовке библиотек РНК Очень важно использовать РНК высокого качества. Образцы с частично деградированной РНК могут привезти к низкому выходу, или к получению библиотеки неприемлемого качества. Мы рекомендуем определять индекс целостности выделенной РНК (RIN) на анализаторах Bioanalyzer (Agilent). Образец должен иметь RIN выше 7. Целостность и распределение длин фрагментов РНК может быть проверена электрофоретически в денатурирующем агарозном геле с окраской бромидом этидия. Полосы рибосомальной РНК должны быть четкими. В образцах общей РНК эукариот четкие яркие полосы будут соответствовать 28S и 18S рРНК. Полоса 28S должна быть примерно в два раза более интенсивной, чем полоса 18S рРНК. Соотношение 2:1 является хорошим знаком целостности РНК. Частично деградировавшая РНК будет образовывать на геле смазанные полосы, и соотношение рРНК будет отличаться от 2:1. Полностью деградировавшая РНК на геле выглядит как смазанная зона в низкомолекулярной области геля. Образцы РНК должны быть полностью очищены от ДНК. Рекомендуется обрабатывать выделенную РНК ДНКазой, не имеющей РНКазной активности. Для очистки РНК рекомендуем воспользоваться После приготовления библиотеки очень важно оценить ее качество при помощи Bioanalyzer (Agilent) и количественной ПЦР. Компания New England Biolabs предлагает реактивы NEBNext, обеспечивающие полный цикл подготовки библиотек NGS высокого качества. Вообще, процедура секвенирования NGS доступна не только лабораториям, которые приобрели секвенатор NGS – все больше лабораторий самостоятельно готовят библиотеки NGS и далее отдают их на анализ в центры коллективного пользования. Стоимость секвенирования в пересчете на один нуклеотид падает за счет увеличения производительности. При этом современные приборы позволяют проанализировать за один прогон большее количество образцов, чем требуется отдельной лаборатории или даже небольшому институту. Пробоподготовка для различных платформ NGS Учитывая указанные требования и потребности, компания New England Biolabs (NEB) разработала серию реактивов NEBNext® для NGS на платформах Illumina®, 454™, SOLiD™, Ion Torrent™, предлагаемых мировыми лидерами в области NGS. Реактивы NEBNext® доступны в следующих комплектациях: 1. Наборы реактивов - содержат ферменты, нуклеотиды и буферы, необходимые для проведения всех этапов пробоподготовки.</li> 2. Наборы реактивов в виде готовых смесей содержат те же компоненты, что и наборы реактивов, но их более удобно использовать, что ускоряет процесс пробоподготовки. </li> 3. Модули - содержат компоненты, необходимые для проведения отдельных этапов пробоподготовки, позволяют подстраивать процесс под определенные задачи. </li> В данном обзоре мы по большей части обсуждаем наборы, обеспечивающие полный цикл пробоподготовки. Реактивы NEBNext применяются для создания библиотек ДНК, Chip-Seq библиотек, библиотек мРНК, библиотек малых РНК, экспрессионных библиотек и дальнейшего секвенирования на различных платформах. NEBNext для создания ДНК-библиотек для Illumina Рис.1. Набор NEBNext Все рассматриваемые реактивы прошли функциональную валидацию путём создания библиотек и последующего секвенирования на платформах HiSeq, MiSeq, Genome Analyzer IIx и HiScan компании Illumina. Адаптеры и праймеры поставляются отдельно от наборов NEBNext, это позволяет увеличить количество комбинаций адаптеров, праймеров и реактивов друг с другом. На первом этапе, в случае приготовления библиотек ДНК – необходима фрагментация исходного образца ДНК до определенной длины. Если в вашей лаборатории не используется для фрагментации ультразвук или небулизация, NEB предлагает воспользоваться После анализа полученных фрагментов ДНК, проводится реакция восстановления концов и их фосфорилирования. Далее на 3'-конец прикрепляют аденин, чтобы произошло узнавание адаптеров, которые имеют тимидин на 3'-конце. Далее проводят лигирование к концам полученных фрагментов адаптеров – это в случае Illumina шпилеобразные олигонуклеотиды, последовательность которых будет узнаваться секвенатором. Далее, фрагменты ДНК, составляющие библиотеку, и присоединенные к ним шпилеобразные адаптеры, содержащие урацил в середине, обрабатываются ферментом урацилгликозилазой И наконец, на последнем этапе полученные фрагменты амплифицирует при помощи высокоточной ДНК-полимеразы. При этом, на данном этапе, кроме увеличения количества копий, возможно избавиться от фрагментов, к которым адаптеры не прикрепились на оба конца, а также ввести на концы фрагментов праймеры (в случае мультиплексирования - также индекс праймеры). Праймеры понадобятся при процессе секвенирования. Схема процесса пробоподготовки с использованием NEBNext представлена ниже на Рис.2. Рис.2. Схема пробоподготовки с использованием NEBNext, с мультиплексированием Если перед вами стоит задача секвенирования образцов ДНК - то можно воспользоваться готовыми наборами: например Различия между двумя наборами состоят в том, что набор Ultra оперирует меньшими количествами исходного образца ДНК, а протокол занимает меньшее время. Поэтому набор Ultra рекомендуется начинающим работать с NGS. Для приготовления ChIP-Seq библиотек можно воспользоваться Мы искренне надеемся, что представленная информация будет полезна в вашей ежедневной работе! Во второй части нашего обзора, посвященного NGS секвенированию, мы расскажем о мультиплексировании, продолжим обсуждение пробоподготовку для платформы Illumina, а также подробнее остановимся на реактивах для пробоподготовки на платформах Ion Torrnent, SOLiD, 454/Roche. |
страницы (8): 1 2 3 > » |