Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
|
1)Fluorescence emission (Trp, Phe, Tyr) 2)Peptide bond absorbance - D205. Good luck. |
|
Уточните, в какой концентрации Вы наносите белок и сколько его садится на сорбент. И самое главное, что за сорбент Вы используете, и каким агентом пользуетесь для иммобилизации белка, от этого зависит способ добычи информации о связавшемся белке. По выданным данным замечу, что, возможно, сорбент не нужно промывать, а мерить прямо концентрацию белка в растворе до реакции и после (исходный объем, умноженный на разность концентраций даст вполне приемлемый результат). Есть тупой, проломный вариант (с высокой чувствительностью), правда сравнительно долгий: сорбент с белком подвергнуть обработке, как при гидролизе белка, и снести на ближайший аминокислотный анализатор. А для спокойствия то же самое проделать с пустым сорбентом. Да, кстати, в предлагаемом мной первом варианте можно использовать и др. методы определения белка (лоури, брэдфорд, с флоурескамином (нужен флуориметр, но метод очень чувствительный)). Они перечислены в порядке возрастания чувствительности это может помочь справиться с низкими концентрациями. (Внимание! Все перечисленные методы имеют свои ограничения и применять их можно не в любом случае.) Успехов. |
|
|
|
Совет 2) Лоури с глютаром скорее всего несовместимы, поэтому лучше в этом случае использовать осаждение белка трихлоруксусной кислотой затем растворение в 0.1М щелочи, а потом Лоури. Это по поводу т.н. дифференциального измерения концентрации. (все остальные варианты, вроде, проходят(если будет избыток глютара, он может маскировать аминогруппы по которым работают брэдфорд и флоурескамин), гидролиз может дать неудобоваримые производные матрицы от желтого до темно коричневого цвета (насколько я знаю Toyopearl делает свои матрицы на основе ПВС, а не ПММА , а ПВС в кислых условиях и при высокой температуре будет деградировать, поэтому я бы использовал солянку концентрацией 10М, но температуру не подымал бы выше 37С и на несколько дней и под азотом обязательно или аргоном.) Есть еще один вариант измерения непосредственно на колонке: промываешь уже готовый(с белком) сорбент бодяжишь это дело в 50% ПЭГе (это чтоб не оседало и рассеивалось меньше) и измеряешь поглощение на 280 и сравниваешь с аналогичной суспензией пустого сорбента(глютар в этом случае не мешает, тк ты уже от него отмылся). Метод не всегда надежен из-за всяких выкрутас сорбента, кроме того в твоем случае могут мешать связи C=N(но возможно обработка боргидридом натрия от этого спасет, если конечно она не входит в методику присоединения белка, тогда этого делать не нужно.(Вместо ПЭГа можно использовать глицерин или ПАА, но без биса конечно, главное чтобы они не поглощали на 280. Дерзайте. |
|
|
|
Chto takoe etot BCA method jelaiushie mogut naiti na http://www.piercenet.com/searchcombined2.cfm - tam mnogo vsego o metode, esli est dostup k burjui'skim jurnalam, to dlia nachala mojno prochest - Smith,P.K. et al. (1985). Mesurement of protein using bicinchoninic acid, Anal.Biochem. 150,pp.76-85. Tam est dannie o neskolkix proteinax, sravnenie BCA s Lowry. Dalee, na prostorah Russii est firma Helicon Ltd. ne dalee kak vchera, ona prislala mne pismeso, o tom, chto ona mojet posposobstvovat v pokupke BCA reagent, daje kakoi'to fail proslali, vot tolko chego ia ne poimu, tak eto togo, kak eta doblestnaia firma nashla menia i moi' e-mail? nu da ladno, vo pervix eto vopros k moderatoru, a vo vtorix, informasia bila iavno v temu... Eta firma imeet WEB-page: www.helicon.ru - pishut chto oni toje vse znaiut o BCA Esli kto stolknetsia s affinity chromatography, to izmerenia protein concentration na polymer beads posle reaksii sviasivania mojno delat s pomoshiu BCA tak: 1) calibrovka - neaktivnie (eto vajno!) beads i bufer s proteinom, BCA smes - vse v odnom flakone, poluchit seriu grafikov absorbans(562nm) ot konsentrasii protein v takoi' razbavlennoi suspenzii dlia raznix kolichestv beads (eto potom oblegchit jizn), staratsia ulojitsia v razbrose <5% dlia 5-40 mkg/ml u menia bilo ~1-3%, ne zabivaite o blank obrazse - on mojet okazatsia ochen interesnim. 2) protein grafted - stroite grafik absrb(562nm) ot amoint beads (teper oni s proteinom), ispolsuia rez. kalibrovki vitaskivaete konsentrasiu protein na beads. Opiat, delaite izmerenia i dlia blank - prigoditsia. Y menia, dlia BSA, poluchalos rashojdenie ~ ot 5-10% s raschetom, osnovannim na priamom izmerenii consentrasii ostavshegosia kolichestva protein v reaksionnom rastvore. p.s. spasibo Avoru |
totosite IP-штамп: frif60/G4Seok гость |
|
totosite IP-штамп: frif60/G4Seok гость |
|
totosite IP-штамп: frif60/G4Seok гость |
|
totosite IP-штамп: frif60/G4Seok гость |
|
totosite IP-штамп: frif60/G4Seok гость |
|
안전놀이 IP-штамп: frsh06k.nw7gc гость |
|
먹튀검증 IP-штамп: frsh06k.nw7gc гость |
|
bondbond Участник |
|
bondbond Участник |
|
watchesbiz Постоянный участник |
|
watchesbiz Постоянный участник |
|
casinosite IP-штамп: frDpn602qZAsw гость |
|
casinocommunity IP-штамп: fr.axAKoZ15UA гость |
|
imbig IP-штамп: fr4rwl6.QZvaA гость |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |