Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
TXY IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
На гель наношу белковые образцы после осаждения ТХУ. Но, при разделении, образцы расползаются очень сильно вширь. Что делать? Неужели остатки ТХУ так сильно влияют? Спасибо огромное! |
Guest IP-штамп: frWKf2AKRVu2Q гость |
Остатки ТХУ действительно не желательны, но расползание происходит не из-за кислоты. Проверьте протокол фореза со стандартным. При нанесении белка в карман он хорошо садится на его дно или нет??? Модет быть еще проблема в ионной силе: нужна низкая ион. сила. Повышенная конц ионов (особенно Ca) приводит к таким проблемам!!!! А что др белки на форезе так же себя ведут? |
TXY IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
Образцы содятся в лунку хорошо, но при наложении тока - начинают расползаться. Другие образцы (без осаждения) хорошо бегут на том же геле. Видимо, остатки ТХУ Да, а после промывки бидистиллятом, надо крутить или нет, а не потеряются ли белки, которые могут раствориться в воде? Спасибо! |
Oleg Klychnikov Постоянный участник Moscow/Amsterdam->Leiden |
|
Guest IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
|
TXY IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
|
Oleg Klychnikov Постоянный участник Moscow/Amsterdam->Leiden |
помыть раза 2-а холодным 80% ацетоном, с добавление немного гидроксида аммония - так, чтобы просто рН поднять (примерно 2-3 мкл на 15 мл) |
TXY IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
|
Baudelaire Постоянный участник где только можно |
Даже если будет желтым ничего страшного. При прохождении через гель всё будет нормально. |
Guest IP-штамп: frQtbDwjgPMwo гость |
|
Oleg Klychnikov Постоянный участник Moscow/Amsterdam->Leiden |
потом хорошо высушить от спитра - т.к. это немного портит картинку фореза (на спидваке минут 20, или на -20 просто в открытых эппендорфах на ночь) |
Baudelaire Постоянный участник где только можно |
(Oleg Klychnikov @ 22.06.2005 12:26) можно и в спирте, рояли не играет, лучше немного и его защелочить, потом хорошо высушить от спитра - т.к. это немного портит картинку фореза (на спидваке минут 20, или на -20 просто в открытых эппендорфах на ночь) Согласен Олег |
Mac-1 Постоянный участник оттуда |
Попробуйте осаждать просто до 10% ТХУ без ДОХ, и промывать осадок 2 раза 1 мл (если осждали в 1.5 мл пробирках) смесью ацетон + 0.1 N HCl, это помогает в 90% случаев. Дело в том, что ТХУ модифицирует белок - связывается со свободными аминогруппами белка, например в остатках лизина или аргинина. И искажение зон (расширение) происходит за счет высокой ионной силы этого самого ранее связанного ТХУ. Этот метод, чтобы убрать связанный ТХУ, основан на классической схеме очистки синтетических пептидов: после синтеза любой пептид содержит некоторое количество связанного ТФУ в зависимости от числа свободных аминогрупп, что сильно влияет на общий МВ пептида - может увеличить его почти в 2 раза (плюс заметно закисляет раствор при растворении). Вообще-то, есть специальные программы, которые рассчитывают МВ пептидов с учетом связанного ТФУ (в частности такая функция есть у большинства программ для синтеза пептидов), однако проще всего этот связанный ТФУ удалить: после лиофилизации растворить пептид опять в любой разбавленной летучей кислоте (солянка, уксусная), которая вытеснит ТФУ, а затем повторно лиофилизовать, при этом удаляется как сама ТФУ, так и замещающая ее кислота. По сходному методу работает Пирсовский кит для очистки и концентрации образцов для СДС э/ф. Если вы используете ДОХ для повышения выхода вашего белка при осаждении, то гораздо лучше добавлять в его раствор перед осаждением carrier protein примерно 0.1 - 1 мг/мл, я обычно добавляю инсулин или РНКазу (но можно и обычный БСА), выход при этом больше, чем с ДОХ. Также, если образец не настолько разбавлен и вы не хотите перегружать гель ведущим белком, то можете попробовать осаждать смесью ТХУ в ацетоне (с последующей промывкой ацетоном) - это намного эффективнее, чем осаждение только ТХУ с последующей промывкой ацетоном. А если хотите информации побольше - то загляните сюда: http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Pro...cipitation.html
|
Nuken Участник |
|
ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
Afalina Участник |
если хорошо отмыть этанолом от ТХУ (чтобы буфер был синим) или гнать просто желтенькие образцы (не знаю, правда, как они у вас перенесут такое кипячение), то все идет нормально. |
metrim Постоянный участник Москва |
Речь об экзоферментах гидролазах, которые микробы выделяют в культуральную среду. |
MMM Постоянный участник |
|
metrim Постоянный участник Москва |
Какими способами можно снизить диффузию-растворимость белков, не заингибировав при этом их активность? в принципе пусть активность даже вдаое упадет, но хоть какая то сохранится... Субстрат для реакции у меня включен сразу в состав геля. Ферментативные реакции должны будут проводится при рН от 4 до 8.5. |
MMM Постоянный участник |
|
Tom1 Постоянный участник |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |