molbiol.ru -> Почему флуоресцируют арх. материал, залитый

> Все форумы > Тематические форумы > Биофизика и матметоды в биологии

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Почему флуоресцируют арх. материал, залитый -- в парафин, и клетки лимфом в культуре --
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

zdmitrij

18.06.2003 19:19

URL #1

Почему флуоресцирует зеленым архивный материал, залитый в парафин и клетки лимфом в культуре, Как от этого избавиться? Мешает смотреть, путаю с меткой FITC, которую пытаюсь внести в этот материал.

AE
Постоянный участник

18.06.2003 21:12

URL #2

То что материал залитый в парафин имеет сильную автофлюоресценцию - это, вроде как, нормально. Потому и используют в таких случаях ферментативную метку, чаше всего ПХ, ЩФ, и пр. А вот почему у вас клетки в культуре светятся не очень понятно (надеюсь они не GFP трансфицированные :-) ). А как в красном диапазоне? Может вам родамин использовать.

18.06.2003 22:25

URL #3

Потому, что в гидрофобной неполярной среде квантовый выход резко растет - поелику нет тушения, и светит даже то, что и в тяжелой воде светить не заставишь - скажем, этидиумбромид из мицелл тритона светить будет не хуже, чем из ДНК. А в зеленом диапазоне до хрена чего светит - флавины, например (вроде, где-то 540 нм)

[Текст переведён с транслита]

AE
Постоянный участник

18.06.2003 22:47

URL #4

to Nec
A тогда как вы объясните, почему сильная автофлюоресценция сохраняется после депарафинирования препаратов? (Впрочем, может быть этот эффект зависит еше и от фиксации, но с препаратами фиксированными жидкостью Буэна это точно выполняется)

L-2M
Постоянный участник

18.06.2003 23:26

URL #5

Есть в клетке столько, друг Горацио,
Что и не снилось нашим мудрецам,
Молекул,
В которых электроны
Под излучением в УФ-диапазоне
На нестабильный уровень выходят.
Впоследствии, низринувшись оттуда,
Они в пути фотоны порождают,
Причем в желто-зеленом часто спектре.

А если серьезно, то у соседей пару лет тому была похожая проблема, но только с живыми клетками. Они у них неспецифически светились зеленым. Проблему решил светофильтр, отсекающий длинноволновую (и, вроде бы, частично самую коротковолновую) часть излучения ртутной лампы, которая, собственно, это неспецифическое свечение и возбуждала. Цифири не помню, но завтра постараюсь спросить.

19.06.2003 16:07

URL #6

Да? а после депарафинирования у вас клетки в чем? не в водном же буфере?

[Текст переведён с транслита]

AE
Постоянный участник

19.06.2003 16:32

URL #7

После депарафинирования срезы были в PBS.

zdmitrij

19.06.2003 18:17

URL #8

Дополнительная информация от автора вопроса.
После депарафинизации в толуоле срез проводился через батарею спиртов, потом отмывался PBS, потом обрабатывался TEN/PROTEINASE BUFFER (состав в цифрах не помню), снова промывался PBS, ПЦРился на стекле (пытаюсь делать ПЦР ин ситу со включением FLUO-12-dUTP в продукт амплификации), потом снова промывался PBS, сушился, иногда красился гематоксилином, иногда нет, потом смотрелся. Зеленым, что характерно светились не все клетки, то есть речь идет не о фоне, а лишь некоторые. Однако, потом оказалось что это и не клетки вовсе, а полости в ткани флуоресцируют (умные люди подсказали). Ради интереса просветил свежий срез без депарафинизации и обработки - такое же свечение! Только светящихся клеток больше и свечение более однородное. Срезы древние, материал 60-х годов, посмотрел по протоколу чем их обрабатывали тогда, просветил все в УФЛ, единственное что немного светилось - это касторовое масло. Может, это его остатки в полостях ткани светятся?

AE
Постоянный участник

19.06.2003 19:40

URL #9

zdmitrij
Как уже сказал, я наблюдал точно такую же картину на препаратах 10 летней давности.
Мне кажется, что, чем разбираться, что там светит в старых препаратах, проще смириться с этим, как с реальностью данной нам в ощушениях, и обойти ее с помощью ферментативных методов. Я не очень большой специалист, но есть же методы с включением DIG и проявлением с анти-DIG-ПХ. На крайняк, попробуйте анти-FITC-ПХ если его проще достать.

19.06.2003 23:13

URL #10

Батенька, дак вы его сушите! Надо вам сказать, что без разницы - парафин или воздух. По отношению к флуорофорам это одно и то же. Можете проверить - на стекло капнуть, скажем, того же флавина да подсушить и сравнить со свечением водного расствора... А про свечение полостей - ну, не знаю... Как вы понимаете, сама полость без флуорофоров светить не может

)))) Ибо врят ли тут будет столь сильное рамановское рассеяние (Хотя у меня как то раз раза в два сильнее свечения метки было. Я тогда с очень малыми количествами работал).

[Текст переведён с транслита]

19.06.2003 23:15

URL #11

Да, а безвоздушная или твердая среда есче лучше - нет столкновений с потенциальными тушителями.

[Текст переведён с транслита]

20.06.2003 03:00

URL #12

Да это правда, в клетках флавины светиат в диапозоне ФИТЦ, мы также обнаружили что клетки уходиасчие в апоптоз в культуре имеют высокии уровень аутофуоресцентсии из-за накопления в них окисленых форм флавинов.

[Текст переведён с транслита]

[Текст переведён с транслита]

20.06.2003 03:37

URL #13

Nec! Ромка, это ты?

20.06.2003 14:26

URL #14

Вроде я

)))

[Текст переведён с транслита]

20.06.2003 22:41

URL #15

"...У нее сто семь косичек
И ручник всегда с собою..."

Судя по бодрому тону, ты процвел

А судя по транслиту - все на том же месте

И фотоника пригодилась.
Удачи тебе!

L-2M
Постоянный участник

22.06.2003 21:06

URL #16

В дополнение к сообщению от 18.06, если это еще кому-то надо... Дополнительные фильтры на входящий пучок - это да, стоит, в основном левая флюоресценция отсекается, но в некоторых особо злобных случаях этого недостаточно и надо ставить фильтр с узкой полосой пропускания перед окуляром (у соседей именно так и было). Какой - зависит от вашего свечения.

watches89
Постоянный участник

23.02.2023 13:47

URL #17

https://medium.com/@omegawatches89/exciting...ne-17c41f48bce4
https://telegra.ph/Tips-For-Buying-Replica-Watches-08-03
https://disqus.com/by/omegawatches89/about/
https://plaza.rakuten.co.jp/omegawatches89/...y/202208040004/
https://omegawatches89.bigcartel.com/product/replica-watches
https://teletype.in/@omegawatches89/p6FG7kdedpw
https://dailygram.com/index.php/blog/116219...eplica-watches/
https://www.craftsforum.co.uk/member/209770-omegawatches89
https://forum.amando.it/members/omegawatches89-165008.html
https://www.academia.edu/88309718/https_www_watchesbiz_co_
https://codepen.io/omegawatches89/pen/KKRbyKj
https://musescore.com/user/54310503/sets/5621730
https://form.jotform.com/223253838439059
https://62e8da780bf7c.site123.me/blog/amazi...-watches-online
https://teletype.in/@omegawatches89/FclnTDwlkB1

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.