Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Serg900 Участник |
Подскажите как можно решить такую проблему. Предположительно есть несколько изоформ белка, которые не разделяются в вестерне (один бенд). Точно известно, что одна изоформа не содержит первый экзон - 13 аа из 450 аа (возможно есть и другие варианты). На уровне транскриптов описание этих изоформ пока тормозится рядом проблем. Что можно сделать с белком, чтобы разделить изоформы на вестерне? |
dk Постоянный участник Россия |
Сообщение было отредактировано dk - 26.01.2017 15:35 |
Serg900 Участник |
(dk @ 26.01.2017 15:35) А градиент концентрации ПААГ они не поможет? В теории, если у Ваших белков МВ разные (за счёт отсутствия экзонов), то должны разделиться. Не понимаю как градиент повлияет на расхождение. Он наоборот позволяет смотреть на геле очень разные по МВ белки |
MMM Постоянный участник |
Но 13 АК - это практически килодальтон такое должно быть видно на Лэмли, если это не аффигенно большой белок. Какая масса у белка?
|
Serg900 Участник |
(MMM @ 26.01.2017 16:12) 1)Нативный форез. 2) ИЭФ изоэлектрофокусирование 3) Уже предложенная двумерка по сути развитие ИЭФ. Но 13 АК - это практически килодальтон такое должно быть видно на Лэмли, если это не аффигенно большой белок. Какая масса у белка? 51 kDa |
Serg900 Участник |
|
Serg900 Участник |
|
MMM Постоянный участник |
|
Serg900 Участник |
(MMM @ 26.01.2017 17:57) А разницы в 1,5 kDa не видно.. |
MMM Постоянный участник |
(Serg900 @ 26.01.2017 17:54) А обработка ферментами, допустим, чтобы получить низкомолекулярные фрагменты, возможна или неперспективно? Возможно, но тут стоит вопрос условий обработки. Чем нативней белок, тем тяжелее он режется, а далеко не каждая протеаза выдерживает денатурирующие условия(обычно используют стойкую стафилококовую V8). А там зависит от сайта гидролиза лучше всего что бы получался фрагмент (со вставкой/без) размером килодальтон так 10-20(получится ли он такой? ) . А затем трициновый форез в 15-18% акриламида для мелких белков.
|
MMM Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
|
MMM Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
|
MMM Постоянный участник |
|
Serg900 Участник |
(MMM @ 26.01.2017 18:20) Вы гоняли в таких условиях белок? Обычно 50кДа на 12% , а не 6%геле гоняют. Если нет, я бы попробовал. А вы как белок смотрите? На блоте, кумаси, серебре? Если на блоте, то красите хемлюминесценцией или красителем? И количество изоформ предполагается примерно одинаковое или какой-то во много раз больше чем другой? Гель 10%. Вестерн блот. Пока смотрел только краской NovaRed. С количеством изоформ не так просто. Первый экзон, вероятно, сигнальный пептид. Так что теоретически может быть два бенда: с отрезанным и не отрезанным пептидом (так ли?). Их количество вероятно должно отличаться. А есть животные (мухи), у которых этот экзон вырезали и у них должен быть теоретически один бенд, так как транскрипт есть. А в итоге везде один бенд на одном уровне в одинаковом количестве Сообщение было отредактировано Serg900 - 27.01.2017 00:57 |
X34 Участник |
|
MMM Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано MMM - 27.01.2017 08:37 |
Serg900 Участник |
|
MMM Постоянный участник |
|
sceptique Постоянный участник временной жизни |
|
MMM Постоянный участник |
(sceptique @ 27.01.2017 12:36) Если Ваш вестенрн сделан на эпитоп из этих 13 а/к (или хотя бы 1 а/к из этих 13 участвует в его формировании) Откуда такие мысли. ТС же не идиот. И вообще как я понял из его пояснений этого самого белка с сгнальным пептидом вообще пока никто не видел. Сообщение было отредактировано MMM - 27.01.2017 12:01 |
sceptique Постоянный участник временной жизни |
2. Белок увидеть нельзя, не покрасив. То, что можно увидеть - это антитела. К чему эти антитела были выработаны и где их эпитоп на поверхности целевого белка - никто не знает. Все видят то, что видят эти антитела и считают себя умными. А зря. 3. Кто-то заметил, что мРНК подвергается альтернативному сплайсингу в определенных условиях. Это очень хорошо, поскольку немного разнообразит картину мира тех, кто пользуется антителами на вестерне считает себя умными. Эти люди сейчас встали в тупик, поскольку надо как-то объяснить и простыми привычными методами детектировать обе изоформы альтернативного сплайсинга, НО!, появляется понимание, что нечем (антитела для вестернов получают обычно против кота в мешке, а не против изоформы). 4. Из грусти ТС про невозможность наработки препаративных количеств белка я так понимаю, что клонировать его, выделять и рефолдить (или хитрить с навешиванием ненативных "секреторных" тагов, которые потом нужно отрезать или экспрессировать в специальных дрожжах, если для активности нужно специфическое гликозилирование) у него нет ни возможности ни желания. Исходя из этих 4 факторов я и прихожу к выводу, что ЕСЛИ эпитоп тех антител, которые раньше красили его белок включает в себя одну из а/к первого экзона, то он ничего и никогда не увидит. Пока те, кто делает эти антитела не почистят достаточно альтернативно-сплайсированного белка и не иммунизируют своих крокодилов, отобрав и почистив для конъюгации новые антитела для нового блота. |
Serg900 Участник |
(sceptique @ 27.01.2017 12:22) 1. Наш субъективизм в части того, кто идиот и кто не идиот, никак не связан с вестерном. 2. Белок увидеть нельзя, не покрасив. То, что можно увидеть - это антитела. К чему эти антитела были выработаны и где их эпитоп на поверхности целевого белка - никто не знает. Все видят то, что видят эти антитела и считают себя умными. А зря. 3. Кто-то заметил, что мРНК подвергается альтернативному сплайсингу в определенных условиях. Это очень хорошо, поскольку немного разнообразит картину мира тех, кто пользуется антителами на вестерне считает себя умными. Эти люди сейчас встали в тупик, поскольку надо как-то объяснить и простыми привычными методами детектировать обе изоформы альтернативного сплайсинга, НО!, появляется понимание, что нечем (антитела для вестернов получают обычно против кота в мешке, а не против изоформы). 4. Из грусти ТС про невозможность наработки препаративных количеств белка я так понимаю, что клонировать его, выделять и рефолдить (или хитрить с навешиванием ненативных "секреторных" тагов, которые потом нужно отрезать или экспрессировать в специальных дрожжах, если для активности нужно специфическое гликозилирование) у него нет ни возможности ни желания. Исходя из этих 4 факторов я и прихожу к выводу, что ЕСЛИ эпитоп тех антител, которые раньше красили его белок включает в себя одну из а/к первого экзона, то он ничего и никогда не увидит. Пока те, кто делает эти антитела не почистят достаточно альтернативно-сплайсированного белка и не иммунизируют своих крокодилов, отобрав и почистив для конъюгации новые антитела для нового блота. Спасибо за Ваши мысли. Я серьезно. Мои антитела к пептиду, который соответствует последовательности на конце второго экзона (предположительно иммуноглобулиновый домен). |
Veshka Постоянный участник Москва |
Хроматофокусирование не предлагаю - очень сложный метод. Но можете почитать свежие работки. |
sceptique Постоянный участник временной жизни |
У ванночкового IEF-Laemmli разрешения может не хватить. Нужно смотреть на то, какие а/к находятся в первом экзоне. Если много триптофанов и другой гидрофобики - можно закалывать смесь и делить на HPLC. Если много кислотных или основных - то взять ионизирующий буфер и провести ионнообменное разделение в денатурирующих условиях. Если в первом экзоне нет ничего особенного и одна хрень типа глицинов, аспарагинов, серинов и аланинов, как и в остальном белке, то можно лишь посоветовать увеличить длину пробега в геле (до полуметра при термостатировании), нарастить/навыделять как можно больше белка и решить проблему в лоб, путём подъёма разрешения электрофореза и замены краски на ту, которая покрасит обе изоформы после их разделения. Сообщение было отредактировано sceptique - 28.01.2017 16:35 |
sceptique Постоянный участник временной жизни |
Сообщение было отредактировано sceptique - 29.01.2017 04:30 |
nigoal123 IP-штамп: frAWeMdOsBSXM гость |
organic traffic from |
vadimchik152a Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |