molbiol.ru -> Очистка ДНК из геля

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Очистка ДНК из геля -- 60 bp --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Aglaiaa
Участник

03.07.2013 15:44

URL #1

Коллеги, добрый день!

Мне необходимо заклонировать короткий фрагмент ДКН (60bp) в вектор. Это кусочек получится после рестрикции. Планировалось в геле разделить, а затем вырезать кусок геля и желаемый фрагмент почистить. Обычно для этого мы используем Qiagen MiniElute Gel Purification Kit, но, к сожелению, он подходит для фрагментов от 70 bp, а 40 bp уже гарантировано теряются во время очистки. Посоветуйте, пожалуйста, как лучше постутить.

P.S. Я умею выделять из геля не только китом, но меня терзают сомнения, что и во всех прочих случаях этот фрагмент будет теряться.

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

03.07.2013 15:57

URL #2

http://www.lonza.com/products-services/bio...r-recovery.aspx

genseq
Постоянный участник

03.07.2013 16:13

URL #3

Проще синтезировать, чем чистить форезом. Но не дешевле. Если не думать. Но если подумать, то синтезировать дешевле.

R.J. Dio
Постоянный участник

03.07.2013 16:13

URL #4

возьмите кит biosilica.ru, он не теряет коротышки, специально купил себе для таких случаев

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

03.07.2013 16:20

URL #5

(genseq @ 03.07.2013 16:13)

а может его потом на сиквинс Ионом Торрентом ?

Aglaiaa
Участник

03.07.2013 16:34

URL #6

(R.J. Dio @ 03.07.2013 17:13)

возьмите кит biosilica.ru, он не теряет коротышки, специально купил себе для таких случаев

Спасибо, попрубую его использовать.

ship
Постоянный участник
Moscow

03.07.2013 17:44

URL #7

Qiagen QiaexII kit от 40bp чистит. уже 10 лет только им пользуемсяю

Aglaiaa
Участник

03.07.2013 18:31

URL #8

(ship @ 03.07.2013 18:44)

Qiagen QiaexII kit от 40bp чистит. уже 10 лет только им пользуемсяю

Спасибо, только кит ко мне будет долго идти, особенно Qiagen'овский.

RNK
Постоянный участник
СССР

03.07.2013 20:20

URL #9

Растворите кусочек геля с вашей полосой в 60 пн, в 2-4 M гаунидинтиоционате, при нагреве, то есть как обычно делается для очистки на колонках.
Затем надо отфенолить несколько раз, пока вся агароза не уйдет в фенол-хлороформ.

Потом попытаться осадить эту ДНК с этанолом или чем-то другим, спермидином, PEGом.
Агароза , конечно, частично останется, и осадится вместе с ДНК, что поможет осаждению короткой ДНК.

Можно и по-другому, добавить в кусочек геля ТЕ буфера несколько объемов (1-2), инкубировать на 55-65С, чтобы гель немного набух, затем заморозить на -20.
После этого отцентрифугировать на максимальной скорости, и из раствора над осадком будут ваш фрагмент, который можно уже клонировать, без дополнительной очистки.

Поблагодарили (1): Aglaiaa

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

03.07.2013 21:10

URL #10

В китах для элюции из геля или просто для очистки ПЦР продукта теряются (избавляются от) фрагменты ниже 50 пн - так у меня отработано в китах.
Меняя ионную силу и процент спирта в отмывочных растворах можно легко варьировать нижний предел - до 20-30 пн.
Предлагаю использовать пока то что есть в наличии в качестве пробного варианта. Можете контролировать процесс моделируя на Маркере от 50 до 2000 пн, который приложу к киту. Агароза и буфер могут быть любыми. Обращайтесь.

Поблагодарили (2): Aglaiaa, RNK

Aglaiaa
Участник

03.07.2013 21:38

URL #11

RNK, -Ъ-, спасибо!

Я начну с совета от RNK + китом своим, конечно, попробую.

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

04.07.2013 08:47

URL #12

(Aglaiaa @ 03.07.2013 21:38)

RNK, -Ъ-, спасибо!

Я начну с совета от RNK + китом своим, конечно, попробую.

http://pesnifilm.ru/load/ajbolit_66/normal...uot/101-1-0-602

R.J. Dio
Постоянный участник

04.07.2013 10:26

URL #13

(RNK @ 03.07.2013 21:20)

совет очень плохой- агароза в следовых кол-вах останется неизбежно, а она сильно ингибирует ферментативные реакции. особенно лигирование

R.J. Dio
Постоянный участник

04.07.2013 10:28

URL #14

(-Ъ- @ 03.07.2013 22:10)

не факт, что дело только в ионной силе- мне кажется, разные сорбенты по-разному связывают фрагменты разных длин. МСогу ошибаться. В любом случае, даже если дело как раз в ионной силе, пока подберешь нужную, пройдет немало времени, экспертом станешь, как Ъ

vtosha
Постоянный участник

04.07.2013 11:02

URL #15

На ПААГе можно разогнать, а потом выделять из ПААГа.

R.J. Dio
Постоянный участник

04.07.2013 14:03

URL #16

слезы останутся. Зачем изобретать колесо, есть готовые наборы, работает на-ура. Или тут выездное заседание клуба юных (и не очень) изобретателей и рационализаторов?

RNK
Постоянный участник
СССР

04.07.2013 14:28

URL #17

(R.J. Dio @ 04.07.2013 09:26)

Конечно, какое-то количество агарозы останется при очистки ДНК фрагмента из геля, любым методом известным методом: то ли очисткой колонкой, замораживанием-оттаиванием геля, или экстракцией фенолом.
Разве что только электроэлюция позволит хорошо очистить ДНК от агарозы.

Я лично бы очищал бы на колонке, даже если выход не высокий.
Лигирование ингибируется агарозой, но всё зависит от количества и качество агарозы.
Но для успешного лигирования и трансформации не нужно много ДНК. Хватит того, что получится любым методом, что используется. Даже если на форезе не будет ничего видно, трансформация "вытянет" этот фрагмент по любому.

ERiNaCeUS
Участник
Москва

06.07.2013 14:41

URL #18

Гель-фильтрация. Sephadex G100 например. Потом переосадить с гликогеном.

RNK
Постоянный участник
СССР

07.07.2013 00:58

URL #19

Можно гель заморозить и оттаять, после этого отцентрифугировать на максимальной скорости, и уже после этого водный раствор профильтровать через "Microcon, Ultracel DNA Fast Flow Membrane", ДНК пройдет фильтр, а фрагменты агарозы застрянут:

http://www.millipore.com/catalogue/module/C113861

ОК3

07.07.2013 06:36

URL #20

(ERiNaCeUS @ 06.07.2013 15:41)

Гель-фильтрация. Sephadex G100 например. Потом переосадить с гликогеном.

Да. Это самое простое. G50 fine лучше будет. Все остальное, вкл рестриктазу "провалится". Переосаждать не нужно, если фрагмент виден - сразу в ТЕ и выход контролировать электрофорезом с маркером 50по

Aglaiaa
Участник

07.07.2013 23:56

URL #21

Тем временем я не просто молчу, а временно отсутствую в лаборатории. По приезду расскажу, какой из способов мне помог.

Guest
IP-штамп: frYmGqvvNujjc
гость

08.07.2013 05:14

URL #22

Плюсану за Биосилику - я так чистил дц 50-ку

Ivalex
Участник

12.05.2017 20:11

URL #23

Добрый день!
У меня возникла следующая проблема: привезли штаммы бактерий в транспортной среде с агаром. Попытались выделить ДНК нагревом-заморозкой-разморозкой - получилось (вроде как, Qubit днк там видит). А пцр не идет - видимо из-за остаточного агара в жидкости.

Подскажите пожалуйста, как убрать агар/очистить днк из раствора?

MMM
Постоянный участник

12.05.2017 21:34

URL #24

(Ivalex @ 12.05.2017 21:11)

Подскажите пожалуйста, как убрать агар/очистить днк из раствора?

1)Простейший вариант разбавте ДНК по-сильнее.

2) Всеми любимая силка.

Поблагодарили (1): Ivalex

ship
Постоянный участник
Moscow

13.05.2017 02:21

URL #25

а нарастить их и выделить из живых нет возможности?
ну или отфенолить-переосадить?
нагрев-заморозак-разморозка - это не выделение днк. это лизис клеток.

dk
Постоянный участник
Россия

13.05.2017 10:57

URL #26

Если имеется большой кол-во клеток - то выделите ДНК любым "человеческим" методом. С этим раствором можно будет и работать, и спрашивать о проблемах.
Как Вам правильно указывает ship - при криогенном лизисе получается набор всех молекул, а не только ДНК (ещё и непонятной длины), которую Кубит и "видит". Но также в растворе могут быть ингибиторы полимераз, рестриктазы и ещё чёрт знает что препятствующее ПЦР.

Atropos
Постоянный участник
abroad

15.05.2017 06:43

URL #27

(RNK @ 07.07.2013 01:58)

Можно и просто гель заморозить/разморозить 2-3 раза, отцентрифугировать и внести несколько миеролитров супернатанта в реакцию лигирования (+ порезанный вектор, очищенный так же).
Несколько раз успешно так делал и с фрагментами 50-100 bp (полученными рестрикцией либо достроенныех олигов, либо плазмиды).

Nickkolas
Участник

15.05.2017 12:08

URL #28

60bp, можно вырезанный фрагмент через стекловату выкрутить, а выкрут центрифугировать собрать супер, геля почти не останется. Заморозить-разморозить всегда полезно, больше выкрутится.
В легирование можно брать супер без очистки или разбавить водой (если концентрация позволяет), можно почистить супер на силеке и избавиться от T(A/B)E... Сам часто на легирование брал выкрут в 1хTAE (1/5 - 1/6 объема от лигазной смеси), эффективность ниже, чем после очистки (GTC в моем случае), но легируется.

Ivalex
Участник

15.05.2017 13:20

URL #29

(ship @ 13.05.2017 03:21)

Увы, нет.

Да, я некорректно выразился. Я таким способом попытался одновременно и лизировать клетки, и сжать агарозу (получая таким образом довольно большое количество супернатанта)

А при фенол-хлороформе куда уйдет агароза?

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

15.05.2017 13:34

URL #30

(Ivalex @ 12.05.2017 21:11)

Ваша ошибка - нагревание агара с культурой.

Замораживание- размораживание несколько раз и все в должно было быть в порядке.
При этом я бы взял соотношение агара к воде 1 к 10 и никакого ингибирования от компонентов агара там не останется.
Или выделяйте ДНК китами, где предусмотрена солюбилизация агара, типа элюции ДНК из агарозных гелей.
Вообщем, ммм как всегда прав.

Поблагодарили (1): Ivalex

watchesbiz
Постоянный участник

23.11.2021 15:25

URL #31

https://replicawatches24.tumblr.com/post/64...lica-watches-uk
https://ello.co/replicawatchesuk/post/ubut9ig9g4glx-q6nyphka
https://www.evernote.com/shard/s451/client/...%2BWatches%2BUK
https://www.bloglovin.com/@rolexrelicawatch...replica-watches
https://www.designspiration.com/watcheshutuk/saves/
https://write.as/fakerolexwatches/hints-to-...lica-watches-uk
https://www.dailystrength.org/journals/hint...lica-watches-uk
https://issuu.com/replicawatchesuk/docs/dif...he_replica_watc
https://www.keepandshare.com/discuss2/5601/...lica-watches-uk
https://penzu.com/public/9e250377
https://bestreplicawatc.livejournal.com/336.html
https://www.pearltrees.com/replicawatchesuk/item349627941
https://www.intensedebate.com/people/watches24
https://anonfiles.com/N039Qf66q9/Guide_On_H...atch_Online_pdf

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.