Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Nadya Y. |
У меня возникла проблема: Матрицей у меня является кДНК,полученная после RT-PCR. Нужная мне полоса появляется только в случае touch-down PCR, но проблема в том, что на такой амплификатор попасть проблематично, да и матрица почти закончилась. Теперь я пытаюсь использовать в качестве матрицы PCR-mixture, но идет какая-то шмазь, а фрагментов нужных нет? |
Kis Участник |
|
Nadya Y. |
|
Kis Участник |
|
Павел Постоянный участник Новосибирск |
бэнд нужный вырезаешь из 4% акриламида (агароза - хуже), переносишь в чистую пробирку эппендорф, стеклянной палочкой размазываешь до получения соплей, добавляешь воды 300-400 мкл, замораживаешь-оттаиваешь, ц/ф 1 мин при макс оборотах и супер (2-3) мкл используешь как матрицу для PCR. PS Этот метод проверен многажды. Ре ПЦР не идет часто из предыдущей смеси из-за ингибирования продуктами реакции и всяческими минорами. Описанную процедуру можно назвать пассивной элюцией из геля в воду. Достаточно обычно 25 циклов (иногда нужно минимизировать циклы, например для уменьшения внесенных мутаций) Удачи! Павел |
Nadya Y. |
to Pavel: Согласна, с тем, что возможно ингибирование, но как уже, говорила, очень боюсь потерять драгоценный продукт. Ре_ПЦР, наоборот сейчас делаю с увеличением циклов, почти до 40. И еще ставлю сначала на большей температуре, а затем в два приема снижаю, с большим количеством циклов. Извините за корявое объяснение. |
Der-ro Участник |
С уважением... |
Павел Постоянный участник Новосибирск |
Я как бы давал совет, конкретно для вашего случая. Т.е. когда мало матрицы (но все же есть). Про количество циклов. Всегда лучше, когда циклов меньше. Ну, если вас интересует правильная структура вашего фрагмента, конечно. А про снижение температуры - это вообще ни к чему. Более эффективно - подбор нужной температуры, далее - hot-start при оптимальной T отжига и , возможно, плавное увеличение T (см. программу "OLIGO"). |
Лена |
|
Nadya Y. |
Плавное увеличение я тоже пробовала, результат никакой, даже шмази почти не было, а фрагментов тем более. |
Павел Постоянный участник Новосибирск |
Вы знаете, была у нас в лабе (впрочем и сейчас тоже есть) мадам. По образованию - физик. Была одна у нас курсе девушка, таких всегда - одна (Новосиб. универ). Числилась у нас матбиологом, и вдруг решила работать руками. Ходила весь день по этажам - спрашивала - как высадить ДНК. Все ей говорили, тонкости рассказывали, ну там про разные соли -от NaCl и NaAc и спиртов, температур и др. Она всех выслушала, почитала Маниатиса и пошла высаживать. В этот день у нее ничего не село. Увы... с чего бы это? Очень критически относилась к советам. Даже очевидным... Это я к чему? Просто я говорю одни вещи, а вы мне - савсем другие. с какой-то неожиданной для меня стороны. Поясняю: я не предлагал рассчитывать температуру (хотя и это можно), а подобрать экспериментально, а в вашем случае - не подбирать даже, а использовать те условия, которые вы знаете, а в качестве матрицы взять пасивноэлюированный фрагмент ДНК из удачного ПЦР. И его уже писиарить. Причем температуоа отжига будет довольно хорошая - синтез вновь образуемых ДНК начнется со своих родных местах посадки олигов. Если позволите - еще один совет, вытекающий из вашего ответа: Если стартовать с низких температур - редко бывает эффективный PCR. Поможет преодолеть эту трудность либо: - очень плавное повышение температуры от Тотжига до Тэлонгации, либо - использовать 4 температурные точки. Промежуточную, градусов 50-55 нужно поставить между отжигом и элонгацией. Дело в том, что при низких темпервтурах (до 45 градусов) у полимеразы почти не наблюдается активности и при быстром наборе температуры олиги сваливаются с матрицы, не успев удлиниться. В ячейке - 72 градуса, а субстрата для реакции нету... Простите, если чем обидел Павел |
yack moderator Москва, Россия |
Как я Вас понимаю! У меня дипломник из физтеха 3 недели переосаждал ДНКу без соли. Не потому, что ему никто не сказал, а потому, что он написал какие-то там уравнения и решил, что должно сесть и так. К концу второй недели он принес, торжествуя, мне осадок... который впрочем наотрез отказался растворяться |
Kis Участник |
Во-вторых - четыре вырожденных праймера в первой ПЦР. Какой паре соответсвтует тот самый нужный фрагмент ? Какая пара используется во второй ПЦР ? Или опять все 4 ? |
Veshka Постоянный участник Москва |
|
vb Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
CNC Milling Inserts IP-штамп: fr4iSIt6irJd6 гость |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |