Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 06.06.2007 10:37) А КАКИЕ именно гели будут - например диагоналъный ПАГЕ на 96 образцов ? 1: Трендс Биотечнол. 1998 Юл;16(7):287-90.Цлицк хере то реад Линкс Мицроплате-арраы диагонал-гел елецтропхоресис (МАДГЕ) анд мелт-МАДГЕ: тоолс фор молецулар-генетиц епидемиологы. Даы ИН, Спанакис Е, Паламанд Д, Щеавинд ГП, ОьДелл СД. Щессех Хуман Генетицс Институте, Университы оф Соутхамптон, УК. идаы@хгмп.мрц.ац.ук Мицроплате-арраы диагонал-гел елецтропхоресис (МАДГЕ) щас инвентед фор молецулар-генетиц епидемиологицал студиес. Ит цомбинес дирецт цомпатибилиты щитх мицроплатес, цонвениент поляцрыламиде-гел елецтропхоресис анд ецономы оф тиме анд реагентс ат минимал цапитал цост, анд енаблес оне усер то рун уп то северал-тхоусанд гел ланес пер даы фор тхе дирецт ассаы оф сингле-басе вариатионс. Мелт-МАДГЕ аддс темпорал-тхермал-рамп аппаратус то ачиеве симилар тхроугхпут фор де ново мутатион сцаннинг. ПМИД: 9675913 [PubMed - indexed for MEDLINE] на 384 и болъше - наверно задач не будет ? |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 06.06.2007 10:37) А КАКИЕ именно гели будут - например диагоналъный ПАГЕ на 96 образцов ? 1: Trends Biotechnol. 1998 Jul;16(7):287-90.Click here to read Links Microplate-array diagonal-gel electrophoresis (MADGE) and melt-MADGE: tools for molecular-genetic epidemiology. Day IN, Spanakis E, Palamand D, Weavind GP, O'Dell SD. Wessex Human Genetics Institute, University of Southampton, UK. iday@hgmp.mrc.ac.uk Microplate-array diagonal-gel electrophoresis (MADGE) was invented for molecular-genetic epidemiological studies. It combines direct compatibility with microplates, convenient polyacrylamide-gel electrophoresis and economy of time and reagents at minimal capital cost, and enables one user to run up to several-thousand gel lanes per day for the direct assay of single-base variations. Melt-MADGE adds temporal-thermal-ramp apparatus to achieve similar throughput for de novo mutation scanning. PMID: 9675913 [PubMed - indexed for MEDLINE] 1: Biotechniques. 1995 Nov;19(5):830-5.Links High-throughput genotyping using horizontal polyacrylamide gels with wells arranged for microplate array diagonal gel electrophoresis (MADGE). Day IN, Humphries SE, Richards S, Norton D, Reid M. Dept. of Medicine, University College London Medical School, Rayne Institute, UK. Genotyping (typing of genetic variation) typically involves PCR followed by an allele-specific oligonucleotide-binding assay, restriction enzyme digest or direct check of the outcome of a PCR designed to distinguish genotype. Electrophoresis can resolve "bound" from "free" oligonucleotide, as well as resolve PCR fragments and digests, but it is traditionally regarded as cumbersome and laborious in comparison with solution assays. Here we describe simple horizontal polyacrylamide gels which can receive a 96-well array of samples directly, which can be stacked in tanks and which are bound to a robust support of glass. The line of electrophoresis is on a 71.6 degree diagonal relative to the columns of the array (microplate array diagonal gel electrophoresis [MADGE]). Several thousand reactions can conveniently be analyzed in a shoebox-sized apparatus in a couple of hours. High resolution is achieved in the range of 20-1000 bp, information processing is simplified and automation is possible. |
genseq Постоянный участник |
зачем так много цитирования и повторений Abstracts? Все уже давно поняли, что Вас интересует исключительно MADGE. Повторюсь и я. Свободной нишей отсутствующего пока рынка гелей в России является ПААГ или его более стабильные аналоги, предназначенные для электрофореза ДНК при проведении ПЦР-диагностики. Диагональный форез на 96 или 384 дорожек в коммерческом отношении бесперспективен. Возможно, найдёт применение шахматное расположение лунок типа 12х2 (24) или 12х3 (36). Для начала гель должен иметь хорошее разрешение при длине ампликонов 100...500 п.о., но в перспективе желательно оптимизировать и для однонитевой ДНК с разрешением в 1n, т.е. нацелиться на секвенирование и/или небольшие делеции типа dF508 (3n). Лично меня особенно привлекают гели для секвенирования и анализа мультиплексной ПЦР на SNP с флуоресцентно мечеными праймерами. Пока-что моя семафорная на SNP система работает довольно скромно, но если убрать флуоресценцию праймеров и повысить яркость FAM, то будет выглядеть более пристойно. Впрочем, и первый блин, который комом, вполе работоспособен: Картинки: MTHFR.JPG — (9.9к) 06.06.2007 — 20.06.2007
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
1: Mol Cell Probes. 1992 Aug;6(4):353-6.Click here to read Links Fluorescence-based, multiplex allele-specific PCR (MASPCR) detection of the delta F508 deletion in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene. Fortina P, Conant R, Parrella T, Rappaport E, Scanlin T, Schwartz E, Robertson JM, Surrey S. Molecular Biology Diagnostics Unit, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine 19104. Cystic fibrosis (CF) is a common genetic disorder in Caucasians, and in some populations 70% of cases are associated with a 3 base pair (bp) deletion (delta F508) in the CFTR gene. We have implemented a fluorescence-based, multiplex allele-specific polymerase chain reaction (MASPCR) assay for deletion of the delta F508 mutation. Different allele-specific fluorescently-tagged primers are used in the PCR reaction to distinguish between normal and delta F508 alleles. Fluorescent PCR products are then visualized in a single lane on an agarose gel following electrophoresis combined with real-time multicolour fluorescence detection. The approach simplifies diagnosis of the most common mutation in the CFTR gene, and holds promise for a multiplex allele-specific, fluorescence-tagged gene amplification strategy for detection of additional CF mutations which may result in more cost-effective testing without increasing the risk of missed or erroneous diagnoses. PMID: 1382222 [PubMed - indexed for MEDLINE] |
Guest IP-штамп: frDQwa9k7riYg гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
кто-то выпускает ? |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 06.06.2007 11:50) даже многоразовый горизонталъный |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
основная работа на Изигеле - (5 штук камер ) а ПАГИ - вертикальные (20-30 см)для разгонки РАПДов |
genseq Постоянный участник |
(Guest @ 06.06.2007 10:05) 2 генсек- значит агарозу от 1 % до 4% уже массово в России кто-то выпускает ? Массово в России агарозу не выпускают, а разливают. Дело это для многих уже привычное, поэтому покупать готовые агарозные гели желающих будет мало. Другое дело - ПААГ. С ним форез ампликонов идёт намного чётче, но менять горизонтальные приборы на вертикальные желающих будет мало. Да и для приготовления таких гелей требуется намного больше опыта. Особых сложностей, конечно, нет, но только для професионалов. Кстати, Сигма продаёт готовые агарозные (1,25%) гели на 8 дорожек по 132 евро! Впрочем, у них и дистиллированная вода продавалась по 20$ за 100 мл. Сообщение было отредактировано genseq - 06.06.2007 15:40 |
genseq Постоянный участник |
(Guest @ 06.06.2007 09:49) В действительности всё не так, как на самом деле. Семафорная маркировка, т.е. зелёные и красные метки, дающие в смеси жёлтый цвет, распространены очень широко. Даже изображения биочипов, меченых Cy3 и Cy5, обрабатывают и представляют в псевдоцветах семафора, которые лучше всего воспринимаются глазом. Проблема не в окраске, а в чёткости дифференциации одиночных мутаций. Трёхнуклеотидная делеция F508 тестируется сравнительно легко, а вот добиться чёткости для однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) - это задачка, над которой трудятся не десятки, а сотни умников. Есть очень неплохие решения, но мне хотелось бы сделать универсальные праймеры, работающих и при электрофоретическом анализе аипликонов, и в Real-time PCR, причём показывающие совершенно однозначные результаты в любых руках. При этом электрофоретический анализ даже предпочтительнее, поскольку поволит сделать мультиплексное тестирование. Отсюда и мой личный интерес к готовым гелям для электрофореза ДНК с высоким разрешением. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(genseq @ 06.06.2007 15:58) В действительности всё не так, как на самом деле. Семафорная маркировка, т.е. зелёные и красные метки, дающие в смеси жёлтый цвет, распространены очень широко. Даже изображения биочипов, меченых Цы3 и Цы5, обрабатывают и представляют в псевдоцветах семафора, которые лучше всего воспринимаются глазом. Проблема не в окраске, а в чёткости дифференциации одиночных мутаций. Трёхнуклеотидная делеция Ф508 тестируется сравнительно легко, а вот добиться чёткости для однонуклеотидных полиморфизмов (СНП) - это задачка, над которой трудятся не десятки, а сотни умников. Есть очень неплохие решения, но мне хотелось бы сделать универсальные праймеры, работающих и при электрофоретическом анализе аипликонов, и в Реал-тиме ПЦР, причём показывающие совершенно однозначные результаты в любых руках. При этом электрофоретический анализ даже предпочтительнее, поскольку поволит сделать мультиплексное тестирование. Отсюда и мой личный интерес к готовым гелям для электрофореза ДНК с высоким разрешением. мултиплексы легче минисиквенсом на чипах делать уроде технология достаточно простая |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 06.06.2007 16:14) Генсек, и при ртПЦР и при форезе? А куда денешь избыток постоянно светящихся праймеров? . Тянешь на Нобелевскую . Сейчас на тебя налетят за Аллельспецифик - СНП. Но мы с Хрипины и может Макс Мякишев (ремпел) присоединится, будем тебя защищать от Первого Гостя и Царбон Цопы. Держись да не буду я его убивать Когда любой из вас Двойной Аллеле-специфик сделает - тоды и поговорим |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 06.06.2007 16:22) Ценю. Но где Горынич, где Чухонец? Тоды и поговорим Даже на АВИ 9700 низзя |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 06.06.2007 16:14) Генсек, и при ртПЦР и при форезе? А куда денешь избыток постоянно светящихся праймеров? . Тянешь на Нобелевскую . Сейчас на тебя налетят за Аллельспецифик - СНП. Но мы с Хрипины и может Макс Мякишев (ремпел) присоединится, будем тебя защищать от Первого Гостя и Царбон Цопы. Держись на ентом геле - "двойной аллеле специфик" делается без всяких меток - просто к "обратному-прямому " на второй аллелъ по 2 лишней буковки на хвост |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 06.06.2007 16:28) Ну горыныч был сделан в 1997 году - мог бы съездить к кабоше и повторить Из Москвы до Гатчины за 10 лет Ломоносов пешком милъон раз прошагал бы туда-обратно |
genseq Постоянный участник |
(Ъ @ 06.06.2007 14:14) Генсек, и при rtPCR и при форезе? А куда денешь избыток постоянно светящихся праймеров? . Тянешь на Нобелевскую . Сейчас на тебя налетят за Аллельспецифик - SNP. Но мы с Хрипины и может Макс Мякишев (rempel) присоединится, будем тебя защищать от Первого Гостя и Carbon Copy. Держись Защищать от Первого Гостя не стоит. Он хоть и чрезмерно словоблуден, но достаточно интеллектуален, чтобы не перегибать палку. Ну а Carbon Copy вообще куда-то пропал. На Нобелевскую не потянет, но принцип улучшения дифференцировки SNP я тебе излагал. Главне - он, похоже, работает. Что касается тушения праймеров, то здесь ничего нового. Всё как обычно. Сейчас известные тебе девушки получили очередную партию праймеров на три мутации. Если принцип дифференцировки сработает хорошо, то в следующую серию сделаю уже с потушеной флуоресценцией и увеличенной яркость. |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 06.06.2007 16:39) Ну горыныч был сделан в 1997 году - мог бы съездить к кабоше и повторить Из Москвы до Гатчины за 10 лет Ломоносов пешком милъон раз прошагал бы туда-обратно Я же думаю все время о Писуаризации всей России, а мне одному не имеет смысла. Я еще не вышел из "большого секса". Так что не ходок я в Гатчину к кабоше. |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(genseq @ 06.06.2007 16:45) Защищать от Первого Гостя не стоит. Он хоть и чрезмерно словоблуден, но достаточно интеллектуален, чтобы не перегибать палку. Ну а Царбон Цопы вообще куда-то пропал. На Нобелевскую не потянет, но принцип улучшения дифференцировки СНП я тебе излагал. Главне - он, похоже, работает. Что касается тушения праймеров, то здесь ничего нового. Всё как обычно. Сейчас известные тебе девушки получили очередную партию праймеров на три мутации. Если принцип дифференцировки сработает хорошо, то в следующую серию сделаю уже с потушеной флуоресценцией и увеличенной яркость. генсек, почитай Карлушину статейку - он мне ее 14 лет назад подарил лично |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Ъ @ 06.06.2007 16:53) Вспомнил - Лейден, Протомбин, и MTHFR, а главное про "девушек" |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(genseq @ 06.06.2007 16:45) Защищать от Первого Гостя не стоит. Он хоть и чрезмерно словоблуден, но достаточно интеллектуален, чтобы не перегибать палку. Ну а Царбон Цопы вообще куда-то пропал. На Нобелевскую не потянет, но принцип улучшения дифференцировки СНП я тебе излагал. Главне - он, похоже, работает. Что касается тушения праймеров, то здесь ничего нового. Всё как обычно. Сейчас известные тебе девушки получили очередную партию праймеров на три мутации. Если принцип дифференцировки сработает хорошо, то в следующую серию сделаю уже с потушеной флуоресценцией и увеличенной яркость. чтоб праймеры сами тушились- надо правилъные мутации выбирать |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 06.06.2007 17:02) чтоб праймеры сами тушились- надо правилъные мутации выбирать |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 06.06.2007 17:00) делишся "опытом" ? |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 06.06.2007 17:00) для тебя ЛИЧНО - буду цитировать Карлушины ПАТЕНТЫ |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 06.06.2007 17:02) чтоб праймеры сами тушились- надо правилъные мутации выбирать Это классная статья! Но Генсек ее читал давно, я уверен |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 06.06.2007 17:02) чтоб праймеры сами тушились- надо правилъные мутации выбирать Но неправильные мутации тоже человеческие . А как быть с ними? |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 06.06.2007 17:15) ТакманМГБ и не морочить людям голову с аллеле-специфик |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 06.06.2007 17:31) Никогда, только аллельспецифик и Амплифлюры Любые SNP, и кривые и косые . Генсек, я один тут за тебя, я это уже проходил |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 06.06.2007 17:37) Никогда, только аллельспецифик и Амплифлюры Любые СНП, и кривые и косые . Генсек, я один тут за тебя, я это уже проходил сядете в турму с аллеле -специфик так как сами не умеете - а что о "доктурах" говорить |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 06.06.2007 17:39) Я хитрый, в свою компанию Генсека возьму и твоего Горынича задействую. А если будешь много выступать, Горынича на Чухонца обменяю Генсеков не сажают, ну и ты лицо заинтерисованное... |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 06.06.2007 17:53) Я хитрый, в свою компанию Генсека возьму и твоего Горынича задействую. А если будешь много выступать, Горынича на Чухонца обменяю Генсеков не сажают, ну и ты лицо заинтерисованное... чухонца я еще не проверял - обещали в конце недели токма на 24 лунки - на 96- позже - я тебе уже говорил "укороченная ПЦР" и " ПЦР в быстрых циклах" две большие разницы -токма не ссылайся на склероз |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 06.06.2007 18:06) чухонца я еще не проверял - обещали в конце недели токма на 24 лунки - на 96- позже - я тебе уже говорил "укороченная ПЦР" и " ПЦР в быстрых циклах" две большие разницы -токма не ссылайся на склероз 1: Biotechniques. 1991 Jan;10(1):76-83.Links Rapid cycle DNA amplification: time and temperature optimization. Wittwer CT, Garling DJ. Department of Pathology, University of Utah Medical Center, Salt Lake City 84132. Rapid temperature cycling with hot air allows rigorous optimization of the times and temperatures required for each stage of the polymerase chain reaction. A thermal cycler based on recirculating hot air was used for rapid temperature control of 10-microliters samples in thin glass capillary tubes with the sample temperature monitored by a miniature thermocouple probe. The temperatures and times of denaturation, annealing and elongation were individually optimized for the amplification of a 536-base pair beta-globin fragment from human genomic DNA. Optimal denaturation at 92 degrees-94 degrees C occurred in less than one second; yield decreased with denaturation times greater than 30 seconds. Annealing for one second or less at 54 degrees-56 degrees C gave the best product specificity and yield. Non-specific amplification was minimized with a rapid denaturation to annealing temperature transition (9 seconds) as compared to a longer transition (25 seconds). An elongation temperature of 75 degrees-79 degrees C gave the greatest yield and increased yields were obtained with longer elongation times. Product specificity was improved with rapid air cycling when compared to slower conventional heat block cycling. Rapid thermal control of the temperature-dependent reactions in DNA amplification can improve product specificity significantly while decreasing the required amplification time by an order of magnitude. PMID: 2003928 [PubMed - indexed for MEDLINE] |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 06.06.2007 18:06) чухонца я еще не проверял - обещали в конце недели токма на 24 лунки - на 96- позже - я тебе уже говорил "укороченная ПЦР" и " ПЦР в быстрых циклах" две большие разницы -токма не ссылайся на склероз 1: Biotechniques. 1998 Aug;25(2):208-10.Links Shortened PCR cycles in a conventional thermal cycler. Mai M, Grabs R, Barnes RD, Vafiadis BP, Polychronakos C. McGill University-Montreal Children's Hospital Research Institute, QC, Canada. PMID: 9714878 [PubMed - indexed for MEDLINE] |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 06.06.2007 17:53) Я хитрый, в свою компанию Генсека возьму и твоего Горынича задействую. А если будешь много выступать, Горынича на Чухонца обменяю Генсеков не сажают, ну и ты лицо заинтерисованное... "Я мзду не беру - мне за Державу обидно" © |
genseq Постоянный участник |
(Guest @ 06.06.2007 14:54) генсек, почитай Карлушину статейку - он мне ее 14 лет назад подарил лично Насколько я понял, Карлуша - это Carl Wittwer, который ещё 15 лет назад продемонстрировал преимущество коротких циклов амплификации при дифференциации F508 и подарил начинающему студенту репринт своей статьи . С тех пор утекло много воды. Появились и другие подходы к улучшению дифференциации . Мне, например , ещё недавно очень нравилось использование полимераз с корректирующей активностью в сочетании с фосфотиоатной защитой праймерных 3'-концов. Да и принцип горячего старта от Кабоши (Кабоева) очень хорош. Жалко, что этот подход не был проработан достаточно глубоко и применяется только в LUX-праймерах . В общем, придумано очень много хороших и разных вещей, которые можно использовать в тест-системах, но мне хотелось бы использовать их в качестве отправой точки для создания ещё более совершенных систем. Правда, местный всезнайка считает, что лучше уже не придумать . И он совершено прав, если говорит о себе. Ну а мне кажется, что подобная скромная самооценка хороша для девушек, а не для разработчиков новых методов . Сообщение было отредактировано genseq - 07.06.2007 10:16 |
genseq Постоянный участник |
(Guest @ 06.06.2007 15:02) чтоб праймеры сами тушились- надо правилъные мутации выбирать Ирина Назаренко с коллегами из фирмы Инвитроген предложила использовать далеко не лучший вариант сочетания контактного тушения флуоресцеина и его аналогов в сочетании с горячим стартом от Кабоева. Эта система сейчас проходит под торговой маркой LUX. Я тоже хочу использовать контактное тушение, но более эффективное. Кроме того, необходимо устранить синтез шпилечных структур, на которые Кабоев почему-то не обратил ни какого внимания. Но это всё "прибамбасы". Главное - это принцип улучшения дифференциации SNP. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(genseq @ 07.06.2007 10:15) Насколько я понял, Карлуша - это Царл Щиттщер, который ещё 15 лет назад продемонстрировал преимущество коротких циклов амплификации при дифференциации Ф508 и подарил начинающему студенту репринт своей статьи . С тех пор утекло много воды. Появились и другие подходы к улучшению дифференциации . Мне, например , ещё недавно очень нравилось использование полимераз с корректирующей активностью в сочетании с фосфотиоатной защитой праймерных 3ь-концов. Да и принцип горячего старта от Кабоши (Кабоева) очень хорош. Жалко, что этот подход не был проработан достаточно глубоко и применяется только в ЛУХ-праймерах . В общем, придумано очень много хороших и разных вещей, которые можно использовать в тест-системах, но мне хотелось бы использовать их в качестве отправой точки для создания ещё более совершенных систем. Правда, местный всезнайка считает, что лучше уже не придумать . И он совершено прав, если говорит о себе. Ну а мне кажется, что подобная скромная самооценка хороша для девушек, а не для разработчиков новых методов . Студент был "вечный" и двоешник Потому как Карлуша младше меня |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(genseq @ 07.06.2007 10:15) Насколько я понял, Карлуша - это Царл Щиттщер, который ещё 15 лет назад продемонстрировал преимущество коротких циклов амплификации при дифференциации Ф508 и подарил начинающему студенту репринт своей статьи . С тех пор утекло много воды. Появились и другие подходы к улучшению дифференциации . Мне, например , ещё недавно очень нравилось использование полимераз с корректирующей активностью в сочетании с фосфотиоатной защитой праймерных 3ь-концов. Да и принцип горячего старта от Кабоши (Кабоева) очень хорош. Жалко, что этот подход не был проработан достаточно глубоко и применяется только в ЛУХ-праймерах . В общем, придумано очень много хороших и разных вещей, которые можно использовать в тест-системах, но мне хотелось бы использовать их в качестве отправой точки для создания ещё более совершенных систем. Правда, местный всезнайка считает, что лучше уже не придумать . И он совершено прав, если говорит о себе. Ну а мне кажется, что подобная скромная самооценка хороша для девушек, а не для разработчиков новых методов . Кабоев проработал его ТАК ГЛУБОКО , что Ирина его нифига не поняла |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 07.06.2007 11:12) Ирина ФИЗИЧЕСКИ не может повторить резалты кабоши потому как у нее НИКОГДА небыло такого циклера 1: Bioorg Khim. 1997 Jun;23(6):526-8.Links [Fast DNA amplification in small ultrathin-wall microplates] [Article in Russian] Tret'iakov AN, Pantina RA, Kaboev OK. A new method was developed for fast DNA amplification by polymerase chain reaction in tiny ultrathin microplates formed directly on the thermocycler's thermoblock. The microplates are made from thin (40-60 microns) polypropylene film by the thermal vacuum-formation method. Due to the effective heat transfer to 10-15 microliters samples and a high velocity of heating and cooling of the thermoblock (up to 7 degrees C/s), the total duration of the DNA amplification (30 cycles) is only 15-30 min. PMID: 9265475 [PubMed - indexed for MEDLINE] |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 07.06.2007 10:37) 1: Mol Biol (Mosk). 1994 May-Jun;28(3):665-9.Links [Amplification of DNA for 15-30 minutes in single-use pipette tips] [Article in Russian] Tret'iakov AN, Gel'fand VM, Pantina RA, Shevtsov SP, Bulat SA. Amplification of 200-1000-bp DNA fragments was performed in 15-30 min using a rapid thermal cycler based on the commercial instrument TC-1000-1 (IRLEN, St. Petersburg, Russia). Plastic pipette tips were used as thin walled, high surface to volume-ratio tubes, to increase the rate of heating (cooling) of 20 microliters samples, which allowed the time required for DNA amplification to be considerably reduced (5-10 times). PMID: 8052258 [PubMed - indexed for MEDLINE] |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 07.06.2007 11:12) Ну достал ты всех своим циклером. Ирина прошла дашле, а Кабоев - нет. А весь ПЦР-ный мир ждет Горынича, Продвигай, просвещай, ну я не знаю чем еще тебе помочь |
genseq Постоянный участник |
1. Ирина при конструировании праймеров использовала Кабоевский способ горячего старта, т.е. шпильку, образуемую 3' и 5'-концами. Недостаток подобных шпилек - это синтез комплементарных нитей, у которых 3'-конец комплементарен синтезированной нити. Следствие - образование шпилечных ампликонов, содержащих только один праймер и асимметрия реакции. 2. Быстрый амплификатор к этому горячему старту отношения не имеет. 3. Понимание важнее знания. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(genseq @ 07.06.2007 11:32) Ну а если всё-таки суп отделить от мух? 1. Ирина при конструировании праймеров использовала Кабоевский способ горячего старта, т.е. шпильку, образуемую 3ь и 5ь-концами. Недостаток подобных шпилек - это синтез комплементарных нитей, у которых 3ь-конец комплементарен синтезированной нити. Следствие - образование шпилечных ампликонов, содержащих только один праймер и асимметрия реакции. 2. Быстрый амплификатор к этому горячему старту отношения не имеет. 3. Понимание важнее знания. для того чеб ШПИЛЕЧКА ВЫЛУПИЛАСь треба ВРЕМЯ БЫСТРЫЙ СТАРТ с 20 градусов ДО 95 градусов ЗА пару секунд !!!!!!!!!!! ОБЯЗАТЕЛьНО !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Пока "тарахтелки " иринины греют от комнаты до 95 градусов - ПЦР можно уж закончить Понимание -важнее знания - плохо когда ни знания - ни понимания |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(genseq @ 07.06.2007 11:32) Ну а если всё-таки суп отделить от мух? 1. Ирина при конструировании праймеров использовала Кабоевский способ горячего старта, т.е. шпильку, образуемую 3ь и 5ь-концами. Недостаток подобных шпилек - это синтез комплементарных нитей, у которых 3ь-конец комплементарен синтезированной нити. Следствие - образование шпилечных ампликонов, содержащих только один праймер и асимметрия реакции. 2. Быстрый амплификатор к этому горячему старту отношения не имеет. 3. Понимание важнее знания. недостаток шпилек - спроси у "девушек" у кабоши шпилъки при КОМНАТНОЙ температуре - научись скручивать шпилъки МФОЛдом Миши Цукера |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(genseq @ 07.06.2007 10:15) Насколько я понял, Карлуша - это Царл Щиттщер, который ещё 15 лет назад продемонстрировал преимущество коротких циклов амплификации при дифференциации Ф508 и подарил начинающему студенту репринт своей статьи . С тех пор утекло много воды. Появились и другие подходы к улучшению дифференциации . Мне, например , ещё недавно очень нравилось использование полимераз с корректирующей активностью в сочетании с фосфотиоатной защитой праймерных 3ь-концов. Да и принцип горячего старта от Кабоши (Кабоева) очень хорош. Жалко, что этот подход не был проработан достаточно глубоко и применяется только в ЛУХ-праймерах . В общем, придумано очень много хороших и разных вещей, которые можно использовать в тест-системах, но мне хотелось бы использовать их в качестве отправой точки для создания ещё более совершенных систем. Правда, местный всезнайка считает, что лучше уже не придумать . И он совершено прав, если говорит о себе. Ну а мне кажется, что подобная скромная самооценка хороша для девушек, а не для разработчиков новых методов . МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ПОЛИМЕРАЗА для аллеле специфик ПЦР - енто Штоффель фрагмент ! |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 07.06.2007 12:08) для того чеб ШПИЛЕЧКА ВЫЛУПИЛАСь треба ВРЕМЯ БЫСТРЫЙ СТАРТ с 20 градусов ДО 95 градусов ЗА пару секунд !!!!!!!!!!! ОБЯЗАТЕЛьНО !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Пока "тарахтелки " иринины греют от комнаты до 95 градусов - ПЦР можно уж закончить Понимание -важнее знания - плохо когда ни знания - ни понимания А я считаю, что ПЦР нужно ваабще запретить, как вредный метод, отвлекающий громадные средства от науки Развращающий молодежь метод! |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 07.06.2007 12:22) А я считаю, что ПЦР нужно ваабще запретить, как вредный метод, отвлекающий громадные средства от науки Развращающий молодежь метод! пора тебе менять религию |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 07.06.2007 12:22) А я считаю, что ПЦР нужно ваабще запретить, как вредный метод, отвлекающий громадные средства от науки Развращающий молодежь метод! плохому танцору |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |