Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
solian Участник Уфа/Россия |
Помогите советом, кто занимается Functional Analysis mirna У меня маловато опыта. как лучше down-reg mirna - экспрессировать anti-mir или просто трансфецировать ингибитором? Детекция изменения уровня экспрессии mir - RT-PCR. Детекция изменения уровня эндогенного таргета: транскрипт - RT-PCR, белок - Вестерн блот. Косвенно, предсказанный сайт посадки mirna - Luciferase miRNA Expression Reporter Vector. спасибо. Сообщение было отредактировано solian - 02.07.2007 16:40 |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 30.06.2007 02:04) Всем привет. Помогите советом кто занимается Фунцтионал Аналысис мирна как лучше дощн-рег мир - экспрессировать анти-мир или просто трансфецировать ингибитором? спасибо. сначала уроде нужно померить кабы експрессию а потом кабы решатъ |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 30.06.2007 02:04) Всем привет. Помогите советом кто занимается Functional Analysis mirna как лучше down-reg mir - экспрессировать anti-mir или просто трансфецировать ингибитором? спасибо. 1: RNA Biol. 2005 Jul 20;2(3) [Epub ahead of print]Click here to read Links Rational Probe Optimization and Enhanced Detection Strategy for MicroRNAs Using Microarrays. Goff LA, Yang M, Bowers J, Getts RC, Padgett RW, Hart RP. W.M. Keck Center for Collaborative Neuroscience, Rutgers University, Piscataway, New Jersey, USA. MicroRNAs (miRNAs) are post-transcriptional regulators participating in biological processes ranging from differentiation to carcinogenesis. We developed a rational probe design algorithm and a sensitive labelling scheme for optimizing miRNA microarrays. Our microarray contains probes for all validated miRNAs from five species, with the potential for drawing on species conservation to identify novel miRNAs with homologous probes. These methods are useful for high-throughput analysis of micro RNAs from various sources, and allow analysis with limiting quantities of RNA. The system design can also be extended for use on Luminex beads or on 96-well plates in an ELISA-style assay. We optimized hybridization temperatures using sequence variations on 20 of the probes and determined that all probes distinguish wild-type from 2 nt mutations, and most probes distinguish a 1 nt mutation, producing good selectivity between closely-related small RNA sequences. Results of tissue comparisons on our microarrays reveal patterns of hybridization that agree with results from Northern blots and other methods. PMID: 17114923 [PubMed - as supplied by publisher]
|
solian Участник Уфа/Россия |
(Guest @ 01.07.2007 13:47) сначала уроде померили кабы експрессию (array(LC), rt-pcr(TaqMan (Appl)) а потом решили ;-) |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 02.07.2007 16:23) Интересно как ТакМан сработал на микроРНК ? Не поделитесь опытом |
solian Участник Уфа/Россия |
(Guest @ 02.07.2007 20:24) Ребята Вы чего MicroRNA Assays Choose from hundreds of real-time PCR-based microRNA assays, listed by the species they interrogate. Controls function across all species. можно конечно параллельное секвенирование |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 02.07.2007 18:08) Ребята Вы чего МицроРНА Ассаыс Чоосе фром хундредс оф реал-тиме ПЦР-басед мицроРНА ассаыс, листед бы тхе специес тхей интеррогате. Цонтролс фунцтион ацросс алл специес. можно конечно параллельное секвенирование Дк ничего - вот ЕНТО ИМЕННО от АБИ что-то чихает Конкретно - что у вас получается с ЕНТИМИ КИТАМИ ? |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 02.07.2007 18:08) Ребята Вы чего МицроРНА Ассаыс Чоосе фром хундредс оф реал-тиме ПЦР-басед мицроРНА ассаыс, листед бы тхе специес тхей интеррогате. Цонтролс фунцтион ацросс алл специес. можно конечно параллельное секвенирование после инвитрогена - проверка такманами = "фигфам " -жилище индейца |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 30.06.2007 02:04) Всем привет. Помогите советом, кто занимается Functional Analysis mirna У меня маловато опыта. как лучше down-reg mirna - экспрессировать anti-mir или просто трансфецировать ингибитором? Детекция изменения уровня экспрессии mir - RT-PCR. Детекция изменения уровня эндогенного таргета: транскрипт - RT-PCR, белок - Вестерн блот. Косвенно, предсказанный сайт посадки mirna - Luciferase miRNA Expression Reporter Vector. спасибо. 1: Methods Mol Biol. 2006;342:267-76.Click here to read Links Identification of messenger RNAs and microRNAs associated with fragile X mental retardation protein. Duan R, Jin P. Department of Human Genetics, Emory University School of Medicine, Atlanta, Georgia, USA. Fragile X syndrome, a common form of inherited mental retardation, is caused by the loss of the Fragile X mental retardation protein (FMRP). FMRP, which may regulate translation in neurons, not only associates with specific messenger RNAs (mRNAs) and with microRNAs (miRNAs), but also associates with the components of the miRNA pathway, including the Dicer and Argonaute proteins. It has been proposed that FMRP regulates the translation of its mRNA targets through miRNAs. In this chapter, we describe the protocol to identify the mRNAs and miRNAs associated with FMRP in vivo. The same method could also be applied to other RNA-binding proteins interacting with specific mRNAs or miRNAs. PMID: 16957381 [PubMed - indexed for MEDLINE]
|
solian Участник Уфа/Россия |
(Guest @ 02.07.2007 21:34) после инвитрогена - проверка такманами = "фигфам " -жилище индейца Вы знаете, та же история похоже доверять array-ям даже на 60-80% нельзя , хотя rt-pcr точнее - все равно - "вилами по воде" вот хочеться функционально подтвердить в ambione заказали наборы, еще бы протокол рабочий найти . |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 02.07.2007 19:17) Вы знаете, та же история похоже доверять арраы-ям даже на 60-80% нельзя , хотя рт-пцр точнее - все равно - "вилами по воде" вот хочеться функционально подтвердить в амбионе заказали наборы, еще бы протокол рабочий найти . ну енто НОРМАЛьНЫЙ реалтайм может и точнее Посмотрите , что АБИ НАИЗОБРЕТАЛИ для микроРНК |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 02.07.2007 19:20) |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 02.07.2007 19:17) Вы знаете, та же история похоже доверять арраы-ям даже на 60-80% нельзя , хотя рт-пцр точнее - все равно - "вилами по воде" вот хочеться функционально подтвердить в амбионе заказали наборы, еще бы протокол рабочий найти . амбион енто кажется АБИ уже - в наборах и протоколы |
solian Участник Уфа/Россия |
(Guest @ 02.07.2007 22:27) и я так думал |
solian Участник Уфа/Россия |
(solian @ 02.07.2007 22:48) протокола к ингибиторам (Ambion) небыло впариваемый АБИ siPORT™ NeoFX™ Transfection Agent брать не стали есть Lipofectamine +, думаю им и обойдемсъ |
solian Участник Уфа/Россия |
(Guest @ 02.07.2007 21:49) 1: Methods Mol Biol. 2006;342:267-76.Click here to read Links Identification of messenger RNAs and microRNAs associated with fragile X mental retardation protein. Duan R, Jin P. Department of Human Genetics, Emory University School of Medicine, Atlanta, Georgia, USA. Fragile X syndrome, a common form of inherited mental retardation, is caused by the loss of the Fragile X mental retardation protein (FMRP). FMRP, which may regulate translation in neurons, not only associates with specific messenger RNAs (mRNAs) and with microRNAs (miRNAs), but also associates with the components of the miRNA pathway, including the Dicer and Argonaute proteins. It has been proposed that FMRP regulates the translation of its mRNA targets through miRNAs. In this chapter, we describe the protocol to identify the mRNAs and miRNAs associated with FMRP in vivo. The same method could also be applied to other RNA-binding proteins interacting with specific mRNAs or miRNAs. PMID: 16957381 [PubMed - indexed for MEDLINE] сайт humanapress - нет доступа ((( |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 02.07.2007 20:07) ващето енто книги кается у Хумана Пресс - берется денъги и заказывается том N ....... |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 02.07.2007 20:07) Значит весь ентот ВолумН .... посвящен микроРНК - смотри Гугл Humana Press
|
solian Участник Уфа/Россия |
(Guest @ 02.07.2007 23:39) MicroRNA Protocols я скачивал с молбиола, посмотрю, спасибо, мона там что есть Сообщение было отредактировано solian - 02.07.2007 21:55 |
solian Участник Уфа/Россия |
(Guest @ 02.07.2007 23:39) Извините за глупый вопрос: (если у вас исследование случай-контроль) Вы сравнивали данные (by такман) - average dCt (=average Ct target - average Ct endo) t-тестом, anova? И какой эндоконтроль Вы использовали (let-7a)? Спасибо. Денис. Сообщение было отредактировано solian - 02.07.2007 22:48 |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 02.07.2007 21:55) |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 02.07.2007 22:34) Извините за глупый вопрос: (если у вас исследование случай-контроль) Вы сравнивали данные (by такман) - average dCt (=average Ct target - average Ct endo) t-тестом, anova? И какой эндоконтроль Вы использовали (let-7a)? Спасибо. Денис. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 02.07.2007 22:34) Извините за глупый вопрос: (если у вас исследование случай-контроль) Вы сравнивали данные (бы такман) - авераге дЦт (=авераге Цт таргет - авераге Цт ендо) т-тестом, анова? И какой эндоконтроль Вы использовали (лет-7а)? Спасибо. Денис. Вообще-то естъ сомнения - а не лучше по "рабочекрестъянски" с СИБРиком |
solian Участник Уфа/Россия |
(Guest @ 03.07.2007 11:23) $119.00 дороговато |
solian Участник Уфа/Россия |
(Guest @ 03.07.2007 12:50) Вообще-то естъ сомнения - а не лучше по "рабочекрестъянски" с СИБРиком Я более склоняюсь к TaqManу, хотя и дороговато Но на форезе спецефичность проверять стоит в любом случае. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 03.07.2007 17:09) Я более склоняюсь к ТаяМану, хотя и дороговато Но на форезе спецефичность проверять стоит в любом случае. пока не думал - попробую решить проблему "нормалайзеров" у инвитрогена "глобалъная нормализация" аррея ее в реал-тайм силъно не перекинеш |
solian Участник Уфа/Россия |
(Guest @ 03.07.2007 20:24) пока не думал - попробую решить проблему "нормалайзеров" у инвитрогена "глобалъная нормализация" аррея ее в реал-тайм силъно не перекинеш кстати MicroRNA Protocols можно скачать здесь: пароль на архив: lekar |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 03.07.2007 17:45) кстати MicroRNA Protocols можно скачать здесь: пароль на архив: lekar |
solian Участник Уфа/Россия |
(Guest @ 03.07.2007 20:24) пока не думал - попробую решить проблему "нормалайзеров" у инвитрогена "глобалъная нормализация" аррея ее в реал-тайм силъно не перекинеш мне тут с эксикона прислали: Bead-based in solution microRNA expression profiling with the FlexmiR™ microRNA products мы у них заказываем профайлинг, спросил можно ли прислать малую фракцию рнк, ответили, что у них проблемы с точным определением количества, лучше вроде из известного количества тотал выделять, не нравиться мне все это, в lc это решается без проблем. тут еще в АБИ закрутили: Low Density Arrays (384-Well Micro Fluidic Cards) Хотя у меня шеф уверен что, точнее всего паралельное сиквенирование (solexa, 454 ..) Я думаю можно наормализавать RT-PCR по среднему уровню экспрессии, log 2 или log 10 преобразование - наглядно, ))) |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 03.07.2007 17:58) мне тут с эксикона прислали: Беад-басед ин солутион мицроРНА ехпрессион профилинг щитх тхе ФлехмиР™ мицроРНА продуцтс мы у них заказываем профайлинг, спросил можно ли прислать малую фракцию рнк, ответили, что у них проблемы с точным определением количества, лучше вроде из известного количества тотал выделять, не нравиться мне все это, в лц это решается без проблем. тут еще в АБИ закрутили: Лощ Денситы Арраыс (384-Щелл Мицро Флуидиц Цардс) Хотя у меня шеф уверен что, точнее всего паралельное сиквенирование (солеха, 454 ..) Я думаю можно наормализавать РТ-ПЦР по среднему уровню экспрессии, лог 2 или лог 10 преобразование - наглядно, ))) Реклама - двигатель торговли АБИ тоды БЕЗПЛАТНО кабы АБИ 7900 должныдарить А я заказал 48-луночный СтепУван к Миниоптикону - мне много микроРНК не надо - тока свои - а на аррее их похожо мало наекспрессировалось "454" лучше для ченибудь более полезного |
solian Участник Уфа/Россия |
(Guest @ 03.07.2007 21:50) Реклама - двигатель торговли АБИ тоды БЕЗПЛАТНО кабы АБИ 7900 должныдарить А я заказал 48-луночный СтепУван к Миниоптикону - мне много микроРНК не надо - тока свои - а на аррее их похожо мало наекспрессировалось "454" лучше для ченибудь более полезного если интересно - в эксиконе 340 баков - один образец, если два на аррей загружать у них 15% скидка пока действует. |
ghost-ya Участник |
|
solian Участник Уфа/Россия |
(ghost_ya @ 04.07.2007 01:43) Чтобы померить количество микроРНК в клетке компания Applied Biosystems предложила использовать праймер для обратной транскрипции в виде шпильки, 3' конец которой комплементарен последовательности микроРНК (шпилька нужна для увеличения длины ДНК, образующейся после ОТ); далее с образовавшейся ДНК проводят qPCR, используя forward праймер, 5' часть которого не комплементарна ДНК, а 3' - комплементарна (чтобы учеличить размер ПЦР продукта); reverse праймер комплементарен последовательности петли шпильки, зонд TaqMan отжигается на стыке последовательности, формирующей шпильку, и последовательности 3'-конца микроРНК, далее стандартная qPCR. Это Вы к чему? |
ghost-ya Участник |
(solian @ 04.07.2007 00:40) Детекция изменения уровня экспрессии mir |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(ghost_ya @ 04.07.2007 06:48) вы кабы топик почитайте выше за 2 число мп: fr45uHVgO7WZ2 гость прочитанное сообщение 02.07.2007 19:22 Сообщение для модератора Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей URL #12 множественное цитирование (Guest @ 02.07.2007 19:20) Ссылка на исходное сообщение confused.gif confused.gif confused.gif ну енто НОРМАЛьНЫЙ реалтайм может и точнее smile.gif Посмотрите , что АБИ НАИЗОБРЕТАЛИ для микроРНК frown.gif Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость прочитанное сообщение 02.07.2007 19:27 Сообщение для модератора Цитировать |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(ghost_ya @ 03.07.2007 22:43) Чтобы померить количество микроРНК в клетке компания Апплиед Биосыстемс предложила использовать праймер для обратной транскрипции в виде шпильки, 3ь конец которой комплементарен последовательности микроРНК (шпилька нужна для увеличения длины ДНК, образующейся после ОТ); далее с образовавшейся ДНК проводят яПЦР, используя форщард праймер, 5ь часть которого не комплементарна ДНК, а 3ь - комплементарна (чтобы учеличить размер ПЦР продукта); реверсе праймер комплементарен последовательности петли шпильки, зонд ТаяМан отжигается на стыке последовательности, формирующей шпильку, и последовательности 3ь-конца микроРНК, далее стандартная яПЦР. Ващето "шпилечные праймеры" до АБИ кабы изобрели в России |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(ghost_ya @ 03.07.2007 22:43) Чтобы померить количество микроРНК в клетке компания Апплиед Биосыстемс предложила использовать праймер для обратной транскрипции в виде шпильки, 3ь конец которой комплементарен последовательности микроРНК (шпилька нужна для увеличения длины ДНК, образующейся после ОТ); далее с образовавшейся ДНК проводят яПЦР, используя форщард праймер, 5ь часть которого не комплементарна ДНК, а 3ь - комплементарна (чтобы учеличить размер ПЦР продукта); реверсе праймер комплементарен последовательности петли шпильки, зонд ТаяМан отжигается на стыке последовательности, формирующей шпильку, и последовательности 3ь-конца микроРНК, далее стандартная яПЦР. болъно ихов АБИ-праймер на енто смахивает |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(ghost_ya @ 03.07.2007 22:43) Чтобы померить количество микроРНК в клетке компания Апплиед Биосыстемс предложила использовать праймер для обратной транскрипции в виде шпильки, 3ь конец которой комплементарен последовательности микроРНК (шпилька нужна для увеличения длины ДНК, образующейся после ОТ); далее с образовавшейся ДНК проводят яПЦР, используя форщард праймер, 5ь часть которого не комплементарна ДНК, а 3ь - комплементарна (чтобы учеличить размер ПЦР продукта); реверсе праймер комплементарен последовательности петли шпильки, зонд ТаяМан отжигается на стыке последовательности, формирующей шпильку, и последовательности 3ь-конца микроРНК, далее стандартная яПЦР. АБИ нагло стыбзили чужую идею и СТЫДЛИВО НЕ ПРОЦИТИРОВАЛИ при НИЗКОЙ температуре обратной транскрипции - праймер в виде ШПИЛьКИ при ПЦР - открыт см "Кабоев ОК и др ":лол: |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 04.07.2007 10:04) АБИ нагло стыбзили чужую идею и СТЫДЛИВО НЕ ПРОЦИТИРОВАЛИ при НИЗКОЙ температуре обратной транскрипции - праймер в виде ШПИЛьКИ при ПЦР - открыт см "Кабоев ОК и др ":лол: Ну все, пошло-поехало. Привет. Остановись. Ты лучше посмотри на это ссылку, может пригодится для твоих мирн. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 04.07.2007 10:57) Ну все, пошло-поехало. Привет. Остановись. Ты лучше посмотри на это ссылку, может пригодится для твоих мирн. Привет - химики достали ПНА,ЛНА, ИНА - скоро углерод на кремний заменют типа "Кремниевая ДНК" |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 04.07.2007 10:57) Ну все, пошло-поехало. Привет. Остановись. Ты лучше посмотри на это ссылку, может пригодится для твоих мирн. Лужков ЗАПРЕТИЛ исполъзовать "Генномодифицированную СТРУКТУРУ ДНК " |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 04.07.2007 10:57) Ну все, пошло-поехало. Привет. Остановись. Ты лучше посмотри на это ссылку, может пригодится для твоих мирн. "МикроРНК" у меня "левая работа" могу и нафиг послать) |
solian Участник Уфа/Россия |
(Guest @ 04.07.2007 16:59) с ней, если чего накопать, мона прямо в натуру публиковать модная тема |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(solian @ 04.07.2007 17:09) ну мине уроде енто не надо - в натуру денег не прибавится а методу интересную и дешевую поставить - енто для ДУШИ |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 04.07.2007 19:33) ну мине уроде енто не надо - в натуру денег не прибавится а методу интересную и дешевую поставить - енто для ДУШИ Наш человек! . Нет, из "большого секса" выйте нельзя. Стоит попробовать раз и все - хана |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 04.07.2007 19:40) ты статейку прочитай Я енту микроРНК на ЕвуБраун реалтайм уж перикину - Ну НЕ ЛУБЛУ я ТакМанов |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 04.07.2007 19:54) Благодарю за статью Читаю. Пока, до завтра. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |