Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Andrew Постоянный участник Москва |
|
Statin Постоянный участник |
|
Guest1 Постоянный участник |
|
Andrew Постоянный участник Москва |
|
Andrew Постоянный участник Москва |
(Guest1 @ 24.11.2009 15:23) мы этим не пользуемся, брезгуем |
Nameless Постоянный участник CA |
Или плазмидная ДНК загрязнена чем-то ингибирующим. |
Ъ IP-штамп: frMwi0yGcI/l6 гость |
Но если брезгуете, годится и из хвоста ящерицы.
|
Ъ IP-штамп: frMwi0yGcI/l6 гость |
Но если брезгуете, годится и из хвоста ящерицы. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Andrew @ 24.11.2009 13:47) Почему-то при постановке с Таяман-зондом ПЦРа амплитуда сигнала в несколько раз выше при использовании геномки по сравнению с плазмидой при сопоставимом количестве копий последовательности-мишени. Эфект воспроизводится. С чего бы это? в основном - это димеры праймеров в Негатив Контроле и в плазмидке НА ВОДЕ - я гоню обычно праймеры без ТакМана в параллельку - потом на гель с Гелстаром - если под продуктом "бомба" - самое простое - выкинуть "ТакМан ассей" развожу плазмидки и контроли с Соломоном или Дрыжжжа tRNA
|
Andrew Постоянный участник Москва |
|
Ъ IP-штамп: frMwi0yGcI/l6 гость |
(Andrew @ 25.11.2009 11:46) Но иногда кольцевые формы плазмиды ведут себя как ПЦР-матрицы непредсказуемо, но для крошечных ПЦР продуктов, думаю, это не должно наблюдаться. Скорее всего, необходимо наличие высокомолекулярной ДНК одного качества и количества в реакционной среде. |
Guest1 Постоянный участник |
(Ъ @ 25.11.2009 13:40) Но иногда кольцевые формы плазмиды ведут себя как ПЦР-матрицы непредсказуемо, но для крошечных ПЦР продуктов, думаю, это не должно наблюдаться. Скорее всего, необходимо наличие высокомолекулярной ДНК одного качества и количества в реакционной среде. отвали 95градусов -3-5 минуты - потом 40 циклов 95-15 сек -60 -1минута "универсальный ТакМан протокол" за первых 3-5 минут при 95 градусов все твои "колечки" тю-тю |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
Но лучше всего, если ТакМан проба помечена не ФАМом, а какой-то другой краской, добавьте в реакцию ЕваГрин или СИБР. Это вам практически гарантирует 100% диагностику. По этой причине я избегаю ФАМ-меченых проб. |
Ъ IP-штамп: frMwi0yGcI/l6 гость |
(Guest1 @ 25.11.2009 14:31) отвали 95градусов -3-5 минуты - потом 40 циклов 95-15 сек -60 -1минута "универсальный ТакМан протокол" за первых 3-5 минут при 95 градусов все твои "колечки" тю-тю Ты когда-нибудь плазмиду выделял? Вообщем, там один принцип - выделение начинается с денатурации (щелочной или кипячением). |
Guest1 Постоянный участник |
(Ъ @ 25.11.2009 18:32) Ты когда-нибудь плазмиду выделял? Вообщем, там один принцип - выделение начинается с денатурации (щелочной или кипячением). дк она же "круглая" как сденатарирает-так сренатарирает |
Guest1 Постоянный участник |
(Yuri K @ 25.11.2009 18:15) Причин обычно бывает две: или ниже сигнал, или выше шум. Если машина позволяет, посмотрите, как у вас выглядит непроцессированный сигнал (на Стратаджине он называется Р в отличие от процессированного дР, и т п). Тогда вам станет ясно, в чем дело. Но лучше всего, если ТакМан проба помечена не ФАМом, а какой-то другой краской, добавьте в реакцию ЕваГрин или СИБР. Это вам практически гарантирует 100% диагностику. По этой причине я избегаю ФАМ-меченых проб. Угу - РОКСом пометь для "диагностики" - выкинь свой Страхаген и не морочь людям голову |
Ъ IP-штамп: frMwi0yGcI/l6 гость |
(Guest1 @ 25.11.2009 18:04) Молодец, 1+ И не так легко этот бублик сломать. при 95 оС. |
Guest1 Постоянный участник |
(Ъ @ 25.11.2009 19:12) Легко Потому как в ПЦР буффере - МАГНИЙ |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(Guest1 @ 25.11.2009 18:06) Что-то сказать хотел по делу, или просто очередной словесный понос начинается? |
Ъ IP-штамп: frMwi0yGcI/l6 гость |
(Guest1 @ 25.11.2009 18:16) Тааак, интереееесно 95 оС, Магний и кольцевые формы плазмиды При щелочном лизисе колей (при выделении плазмиды) тоже Магния хватает ЭНДОГЕННОГО. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Yuri K @ 25.11.2009 18:57) зависит от реалтаймера - если "по делу" У АБИ Степана - "фамовский" канал ТакМан -ФАМ-БлакХолКвенчер основной "диагностика" , ВИК - екстернал контроль , а РОКс - нормализатор ну и куда я "неФАМ" суну например по твоему "рецепту" ? |
Guest1 Постоянный участник |
(Ъ @ 25.11.2009 20:24) Тааак, интереееесно 95 оС, Магний и кольцевые формы плазмиды При щелочном лизисе колей (при выделении плазмиды) тоже Магния хватает ЭНДОГЕННОГО. теоретик - ну гонял я линеаризированную плазмиду и кальцавую ТакМаном - никакой разницы после 2 минуты при 95 град на Степане АБИ с 2ХФаст ТакМан миксой |
Guest1 Постоянный участник |
(Ъ @ 25.11.2009 20:24) Тааак, интереееесно 95 оС, Магний и кольцевые формы плазмиды При щелочном лизисе колей (при выделении плазмиды) тоже Магния хватает ЭНДОГЕННОГО. Ничего там не зависит - Олег Кабоев зклонировал так 115бп ПЦР фрагмент "хфируса СПИДА" в "плазмиду" лет так 100 назад - ну в прошлом веке или МИЛЛЕНИЮМЕ - ну гоняем мы "разведения ПЛАЗМИДЫ ХвирусаСПИДА" до 1 молекулы во ВСЕЙ ВСЕЛЕННОЙ - ПЦР идет -Хоть Тресни |
Guest1 Постоянный участник |
(Ъ @ 25.11.2009 20:24) Тааак, интереееесно 95 оС, Магний и кольцевые формы плазмиды При щелочном лизисе колей (при выделении плазмиды) тоже Магния хватает ЭНДОГЕННОГО. Тута почитай про Страшный СПИДОпраймер и СПИДоплазмиду и КАК СПИДОПАЗМИДУ РАЗВАДИТь .... "вода-гидрашка 50:50" |
Guest1 Постоянный участник |
(Ъ @ 25.11.2009 18:32) Ты когда-нибудь плазмиду выделял? Вообщем, там один принцип - выделение начинается с денатурации (щелочной или кипячением). тебе напомнить кто тебя ПЦРу учил в "чухонских землях" |
Andrew Постоянный участник Москва |
|
Guest1 Постоянный участник |
(Ъ @ 25.11.2009 20:24) Тааак, интереееесно 95 оС, Магний и кольцевые формы плазмиды При щелочном лизисе колей (при выделении плазмиды) тоже Магния хватает ЭНДОГЕННОГО. Учи матчасть . Кстати пионеры (не все ) " Генетических мутаций в СССР" вдруг оказались с 1 октября указом Президента России вдруг в "Курчатовском ЦЕНТРЕ " Е.И.Шварц, О.К.Кабоев, А.А.Гольцов, С.В.Виноградов, Е.Н.Лебеденко, Ю.А.Берлин, Праймерзависимая амплификация двух участков в-глобинового гена человека, 1988, Биоорганическая химия, 14, 11, 1577-1579 |
Guest1 Постоянный участник |
(Andrew @ 26.11.2009 00:17) Юри К, фон тот же, упал уровень сигнала. Буду пробовать с царриер ДНА - посмотрим как это будет выглядеть. Выставь праймеры , ТакМан и реалтаймер - я быстрее "твои муки" отпробую |
Guest1 Постоянный участник |
(Andrew @ 26.11.2009 00:17) Юри К, фон тот же, упал уровень сигнала. Буду пробовать с царриер ДНА - посмотрим как это будет выглядеть. Вроде ПРАВИЛО : праймеры , ТакМана, химию и прибор НА СЦЕНУ - чего секретничать ? |
Guest1 Постоянный участник |
(Andrew @ 24.11.2009 14:47) Почему-то при постановке с Таяман-зондом ПЦРа амплитуда сигнала в несколько раз выше при использовании геномки по сравнению с плазмидой при сопоставимом количестве копий последовательности-мишени. Эфект воспроизводится. С чего бы это? Потому, что Вы не читаете "правила" и вопросы типа "одна бабка сказала" тут никого не волнуют - особенно от "Постоянных Участнегов" |
Ъ IP-штамп: frMwi0yGcI/l6 гость |
(Guest1 @ 25.11.2009 23:12) Ответь на вопрос - почему днем без своего ника, а вечером - наоборот, всплываешь на форум цивилизованно. И ведешь себя вечером, мягко говоря, агрессивно. |
Andrew Постоянный участник Москва |
TTGCTGAGTTTCCCCGTT FAM-CTTTCGGCTTGTTGCCCGCTT-RTQ1 химия -Синтол (2,5х премикс), прибор -Синтол АНК-32 |
Guest IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
(Andrew @ 26.11.2009 10:30) химия -Синтол (2,5х премикс), прибор -Синтол АНК-32 ё... вот с этого и надо было начинать... |
Andrew Постоянный участник Москва |
Хотелось бы услышать более предметное высказывание. Между прочим прибор исправно работает уже 2 года и нареканий никогда не вызывал, в отличие от iQ5. |
Guest IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
(Andrew @ 26.11.2009 10:57) а что "ё..."? Хотелось бы услышать более предметное высказывание. Между прочим прибор исправно работает уже 2 года и нареканий никогда не вызывал, в отличие от iQ5. а то что надо было сразу об этом сказать и не морочить людям голову... приборсинтолхимиясинтол - телефон 977-74-55 и пусть они со своим металлоломом и разбираются |
Andrew Постоянный участник Москва |
|
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(Guest @ 25.11.2009 20:12) зависит от реалтаймера - если "по делу" У АБИ Степана - "фамовский" канал ТакМан -ФАМ-БлакХолКвенчер основной "диагностика" , ВИК - екстернал контроль , а РОКс - нормализатор ну и куда я "неФАМ" суну например по твоему "рецепту" ? Ну это как бы твои личные проблемы. Хотя, если память мне не изменяет, у ABI еще и 4я краска есть, NED. |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(Andrew @ 26.11.2009 11:11) All is well what ends well. |
nigoal123 IP-штамп: fr4iy3.kHUw02 гость |
Articles may focus on emerging |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |