Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Сиквенаторы третьего поколения -- Pacific Biosciences --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Redactor
admin.
Берлин, Германия



 прочитанное сообщение 05.02.2010 17:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ

картинка: Turner.jpgВ конце января в наш институт (MPI MG) приезжал Dr. Stephen Turner, основатель и руководитель компании Pacific Biosciences, и рассказывал о планах компании на ближайшее время.

Pacific Biosciences разрабатывает сиквенатор третьего поколения и является наиболее успешной компанией в этой области. Примерно год назад компания опубликовала статью в Science c описанием реального одномолекулярного сиквенса по своей технологии (см. ниже).

Компания обещает выставить сиквенатор на рынок к концу этого года.

Ожидаемые цены:
SMRT-сиквенатор (Single Molecule Real Time) ~$600 000.
Кит (реактивы и ZMWs-чип) ~$100 за комплект.

Один ZMWs-чип имеет 80 000 ZMWs-ячеек. Примерно треть отверстий - рабочие (в остальных - либо нет полимеразы, либо, наоборот, слишком много).

Скорость чтения: ~1-3 нуклеотида в секунду в каждой ZMWs-ячейке.

Cредняя длина чтения: 1kb (длина чтения убывает экспоненциально, встречаются ячейки с длиной до ~10kb). Т.е. с одного чипа снимается ~27Mb.

Точность чтения (исходные данные без биоинформатической обработки) - более 90%. Это примерно соответствует точности первой Solexa (Illumina) машины. Ошибки сиквенса почти независимы -- это позволяет повышать точность сиквенса читая один и тот же фрагмент несколько раз.

SMRT-сиквенатор без изменения железа может работать до скорости ~15 нуклеотидов в секунду. С ограниченным апгрейдом (более быстрая камера) - до 50 nt/sec. Изображения не хранятся, хранятся тоько "хромотограммы" похожие на результат работы автоматического сиквенатора первого поколения. Предполагается, что в будущем и хромотограммы хранить не будут. Т.е., на выходе будет только нуклеотидная последовательность с показателями "качества" для каждого нуклеотида.

Сиквенс идёт на индивидуальных (не амплифицированных) молекулах. В частности, это позволяет довольно быстро готовить сиквенсовые библиотеки: несколько часов от образца ДНК до начала сиквенса. В сочетании со сравнительно быстрой сиквенсовой реакцией (~1-3 нуклеотида в секунду в реальном времени) может получится получается хороший медицинский экспресс-анализ.

Все очень интересно и перспективно, НО(!), пока что ожидается, что цена сиквенса будет примерно на порядок выше, чем у Illumina и SOLID (но и на порядок ниже, чем у 454-платформы; см. http://seq.molbiol.ru/ ). С другой строны - это первая машина. К тому же и у технологии в целом и у машины в частности есть большие резервы для повышения эффективности.


umnik.gif

Забавно сравнить технологии компаний Pacific Biosciences и Helicos. В обоих случаях сиквенс проходит на индивидуальных молекулах. Т.е., чисто формально обе технологии можно отнести к третьему поколению. Цена за нуклеотид у Helicos примерно на уровне Illumina/SOLID, а у Pacific Biosciences существенно выше. Казалось бы, это должно означать, что дела у Helicos идут лучше.

На самом деле всё не так. Кроме сомнительного преимущества "сиквенса на отдельных молекулах" Helicos не может предложить ничего, что делало бы технологию лучше, чем уже есть у Illumina (а длина сиквенса у Helicos существенно меньше, чем у Illumina). Язык не поворачивается относить технологию к следующему поколению и непонятно, где найдёт применение машина Heliscop.

Технология Pacific Biosciences хоть и дорога, но даёт столько новых возможностей, что нет никаких сомнений, что это новое поколение сиквенаторов. И хотя машины на рынке ещё нет, многие её уже очень хотят  wink.gif




По теме можно псмотреть следующие вещи:
  • в комменариях к этому сообщению находятся (i) описание SMRT-технологии и (ii) список её достоинств и возможных применений;
  • web-сайт Pacific Biosciences
  • описание технологии на сайте компании (pdf-файл и видео-ролик)
  • статья в Science 2009 (прицеплена ниже)


Файл/ы:

скачать файл SMRT.pdf
размер: 969.18к
кол-во скачиваний: 6402




Всего благодарностей: 6Поблагодарили (6): VVolkov, taniusha, Frosch, Esya, E., dinches



Сообщение в колонке новостей: Наука: общая и молекулярная биологияСообщение в колонке новостей, раздел "Наука: общая и молекулярная биология"
05.02.2010 21:08
Участник оффлайн! Redactor
admin.
Берлин, Германия



 прочитанное сообщение 05.02.2010 17:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Технология

В отличии от других net-generation сиквенаторов, Pacific Biosciences не прокачивает через чип никаких растворов. В собранном чипе сиквенс начинается сам собой и нужно лишь наблюдать за ним. Автоматический флуоресцентный микроскоп в "реальном времени" наблюдает за индивидуальными молекулами полимеразы и детектирует включение флуоресцентно-меченных нуклеотидов.



Ключевые моменты технологии

ZMWs-ячейки
Чтобы следить за индивидуальными молекулами ДНК полимеразы используется специальный чип. Одна его сторона -- это стекло, покрытое изнутри металлической фольгой. В фольге проделаны отверстия диаметром несколько десятков нанометров. Так как размер отверстий существенно меньше длины волны света, то свет сквозь них не проходит (так же, как микроволновое излучение не выходит за покрытую металлическим ситом дверцу бытовой микроволновой печи; там соотношение 2мм отверстие // 20см волны).

Но в самом основании отверстия свет есть. Там создается освещенная область объемом ~10-21 литра. Флуоресцентные молекулы в этой области видимы.
картинка: smrt_well.jpgкартинка: smrt_light.jpg



что собственно детектируется?
Меченные нуклеотиды заходят в освещенную облясть очень ненадолго (быстро уходят из-за диффузии). Так что в отсутствии полимеразы и матрицы в ZMWs-ячейке регистрируется слабый случайный шум. Однако, когда полимераза встраивает правильный нуклеотид, она захватывает его и довольно долго с ним возится. В результате появляется долгий сигнал определенного цвета. Эти сигналы и регистрируются.
картинка: smrt_seq.gif



гамма-меченные нуклеотиды
Обычно флюоресцентная метка прикрепляются к основаниям ДНК. В SMRT-технологии флуоресцентная группа крепится к гамма-фосфату. При синтезе она отщепляется вместе с пирофосфатом, так что в результате получается нормальная ДНК. Два преимущества гамма-меченных нуклеотидов:
    в результате синтеза получается нормальная двухцепочечная ДНК, так что синтез может идти долго;
  • гамма-меченные нуклеотиды используются полимеразой даже лучше, чем обычные, так что небольшие примеси немеченных нуклеотидов не приводят к непропорционально большому загрязнению (для меченных за основание нуклеотидов ситуация обратная).
картинка: smrt_nucl.gif



SMRT-сиквенатор
По сути дела это комбинация ZMWs-чипа и флуоресцентного микроскопа, которая позволяет регистрировать сиквенс в тысячах ZMWs-ячеек одновременно.
картинка: smrt.gif
Участник оффлайн! Redactor
admin.
Берлин, Германия



 прочитанное сообщение 05.02.2010 17:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Резервы

* скорость чтения: сейчас скорость полимеразы искуственно занижена, в принципе, фаговые полимеразы могут достигать скорости ~100 нуклеотидов в секунду. Мультиферментные полимеразные комплексы достигают скоростей ~1000 нуклеотидов в секунду. Технически максимальная допустимая скорость определяется скоростью работы камеры.

* количество ZMWs-ячеек в чипе. Сейчас чип -- примерно 300х300 ячеек. Принципиальный лимитирующий фактор -- пикселей в камере должно быть достаточно для разрешения "хромотограм". Похоже, что количество ячеек будет увеличено в несколько раз даже без замены камеры.

* процент занятых ячеек. Уже сейчас ведется работа по повышению доли "полезных ячеек".

* патентная ситуация. Есть несколько фирм продвигающих свой сиквенаторы третьего поколения и использующие полимеразу и гамма-меченные нуклеотиды. Скорее всего это означает, что будет несколько сходных платформ, а монополиста не будет.


Перспективы и применения

длинные сиквенсы
Сейчас cредняя длина сиквенса соответствует длине сиквенса первого поколения (~1kb). Сиквенс в некоторых ячейках продолжается за 10kb -- на это не способна ни одна другая сиквенсовая технология.


прерывистые сиквенсы
Основной фактор, который приводит к остановке сиквенса -- свет (предполагается, что это фотоиндуцируемая свободнорадикальная реакция в полимеразе). Если свет выключить, сиквенс будет продолжаться существенно дольше. Это можно использовать для организации некого подобия paired-end сиквенса. Можно выключить свет и позволить сиквенсу идти "втемную". Потом свет на время включается -- записвается сиквенс -- опять выключается и т.д.

Результат -- разнесенные на примерно известное расстояние (± корень из длины последовательности) просиквенированные участки (Strobe Sequencing). Сейчас такие структуры занимают более 50kb. Очень удобно и полезно для сиквенса de novo.


картинка: smrt_templ.gifмногократное чтение одной молекулы
Топологически ДНК-матрица для SMRT-сиквенса -- это кольцевая ДНК. Если длина молекулы меньше длины сиквенса, то матрица будет читаться раз за разом по кругу. Это позволяет прочитать одну и ту же матрицу несколько раз и повысить точность сиквенса.


экспресс-анализ
Сиквенс идет на индивидуальных (не амплифицированных) молекулах. Это позволяет довольно быстро готовить сиквенсовые библиотеки: несколько часов от образца ДНК до начала сиквенса. В сочетании со сравнительно быстрой сиквенсовой реакцией (~1-3 нуклеотида в секунду в реальном времени) может получится получается хороший медицинский экспресс-анализ.


легкое масштабирование
Есть надежда, что будут доступны чипы разных размеров (по разной цене). Это позволит использовать разный масштаб сиквенса для разных проектов. Как вариант сейчас -- разное количество чипов на проект.


эпигенетический анализ
Технология позволяет анализировать метилирование по кинетике чтения метилированного участка (в ~60 нуклеотидной окресности модифицированного нуклеотида меняется кинетика чтения). На искуственных матрицах можно различаить метил-цитозин и гидроксиметил-цитозин.


обратная транскрипция
Ведутся работы по сиквенсу обратной транскриптазой. Пока что результаты не ахти, но Стив сказал, что ДНК-сиквенсы вначале выглядели так же.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Frosch
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.02.2010 19:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Если не ошибаюсь, компания Pacific Biosciences в середине 2008 года обещала начать продажи своего секвенатора в 2009 году. Потом сроки перенеслись на 2010 год, и все думали, что речь идёт о начале 2010 года. Сейчас говорят уже о конце года. Не удивлюсь, если они ещё немного отодвинут срок, и все решат, что уж теперь-то точно новый секвенатор появится в начале 2011 г., причём опять ошибутся, поскольку руководитель компании заявит, что его не так поняли - речь шла о конце 2011 года.

Примерно по такой же схеме пробивался на рынок мономолекулярный секвенатор Heliscop компании Helicos. Год назад, т.е. с опозданием почти на 2 года, прибор появился в продаже, но первые поставленные экземпляры были возвращены на доработку (за исключением прибора, каким-то образом угодившего в Индию). Правда, пол года назад была предпринята попытка заявить о выдающихся параметрах прибора с помощью секвенирования генома одного из его ведущих разработчиков за 50 тыс.$, но к этому времени Illumina уже опустила планку заказного геномного секвенирования до 48 тыс.$ beer.gif .

В конце второго квартала (т.е. через 3...4 месяца), Roche обещала начать продажи GS Junior (облегчённа версия пиросеквенатора FLX) по 100...125 тыс.$. Прибор размером с лазерный принтер (правда, цветной wink.gif ). На этом конкурентном фоне обещание фирмы Pacific Biosciences в конце года выпустить секвенатор стоимостью 660 тыс.$ как-то не впечатляет shuffle.gif .

Несмотря на всё вышесказанное желаю всяческих успехов разработчикам из Pacific Biosciences beer.gif , поскольку из-за немногочисленности конкурентов цены на приборы и реактивы для NGS сейчас завышены в 2...3 раза. Чем скорее прибор Pacific Biosciences появится на рынке, тем лучше jump.gif .

Сообщение было отредактировано genseq - 05.02.2010 19:49
Участник оффлайн! Redactor
admin.
Берлин, Германия



 прочитанное сообщение 05.02.2010 20:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Солекса тоже несколько раз переносила срок выпуска прибора.

Первая партия SOLID'ов была практически нерабочей (примерно год мороки).
Участник оффлайн! Guest1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.02.2010 21:12     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

(Redactor @ 05.02.2010 21:21)
Ссылка на исходное сообщение  Солекса тоже несколько раз переносила срок выпуска прибора.

Первая партия СОЛИДьов была практически нерабочей (примерно год мороки).


Поехали в Констанц к Томасу Полю "Хисек-2000" сотреть wink.gif
Участник оффлайн! Guest1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.02.2010 21:22     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(Redactor @ 05.02.2010 21:21)
Ссылка на исходное сообщение  Солекса тоже несколько раз переносила срок выпуска прибора.

Первая партия СОЛИДьов была практически нерабочей (примерно год мороки).


Нарисуй картинку оптики "Хисек-2000" Иллумины
Участник оффлайн! Guest1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.02.2010 21:27     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

(Redactor @ 05.02.2010 21:21)
Ссылка на исходное сообщение  Солекса тоже несколько раз переносила срок выпуска прибора.

Первая партия СОЛИДьов была практически нерабочей (примерно год мороки).


smile.gif угу - тока самый мощный "сиквинатор чилавеков" в Европе не в Берлине, а в Констанце smile.gif
Участник оффлайн! Guest1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.02.2010 21:34     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(Redactor @ 05.02.2010 21:21)
Ссылка на исходное сообщение  Солекса тоже несколько раз переносила срок выпуска прибора.

Первая партия СОЛИДьов была практически нерабочей (примерно год мороки).


вторая партия из 4 СОЛИДов была совсем нерабочей smile.gif
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.02.2010 22:35     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

SMRT.pdf - Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules / John Eid, et al.// Science. - 2009. - Vol.323. - P.133. Опубликована в январе 2009 г., но сдана в печать намного раньше (9 July 2008; accepted 20 October 2008, Published online 20 November 2008). Как видите, статья далеко не первой свежести shuffle.gif .

При бурном развитии технологий NGS за полтора года устаревают почти все данные. За это время родилась идея "пунктирного" (прерывистого) секвенирования, причём рождение явно было вынужденным - связанным со слишком быстрой фотоинактивацией ДНК и полимеразы rolleyes.gif .

Полностью согласен с тем, что для подобных сложных технологий точно предсказать сроки завершения разработки очень трудно. Но настораживает то, что тот же руководитель компании Pacific Biosciences примерно год назад хвастался тем, что они ежемесячно тратят на исследования по 20 млн.$ beer.gif . При таких расходах разработчики не заинтересованы в быстром завершении работы, а прибор и технология не могут получиться дешёвыми, поскольку все затраты должны окупиться, т.е. должны быть включены в стоимость прибора и расходных материалов weep.gif.

Сообщение было отредактировано genseq - 05.02.2010 22:38
Участник оффлайн! Guest1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 06.02.2010 02:39     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(genseq @ 05.02.2010 23:35)
Ссылка на исходное сообщение  СМРТ.пдф - Реал-Тиме ДНА Сеяуенцинг фром Сингле Полымерасе Молецулес / Ёхн Еид, эт ал.// Сциенце. -  2009. - Вол.323. - П.133. Опубликована в январе 2009 г., но сдана в печать намного раньше (9 Юлы 2008; аццептед 20 Оцтобер 2008, Публишед онлине 20 Новембер 2008). Как видите, статья далеко не первой свежести shuffle.gif .

При бурном развитии технологий НГС за полтора года устаревают почти все данные. За это время родилась идея "пунктирного" (прерывистого) секвенирования, причём рождение явно было вынужденным - связанным со слишком быстрой фотоинактивацией ДНК и полимеразы rolleyes.gif .

Полностью согласен с тем, что для подобных сложных технологий точно предсказать сроки завершения разработки очень трудно. Но настораживает то, что тот же руководитель компании Пацифиц Биосциенцес примерно год назад хвастался тем, что они ежемесячно тратят на исследования по 20 млн.$ beer.gif . При таких расходах разработчики не заинтересованы в быстром завершении работы, а прибор и технология не могут получиться дешёвыми, поскольку все затраты должны окупиться, т.е. должны быть включены в стоимость прибора и расходных материалов :щееп:.


всюду враги, козни и "откаты" smile.gif читай дугина smile.gif
Участник оффлайн! Guest-111




 прочитанное сообщение 06.02.2010 16:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

По поводу:

Кроме сомнительного преимущества "сиквенса на отдельных молекулах" Helicos не может предложить ничего, что делало бы технологию лучше, чем уже есть у Illumina (а длина сиквенса у Helicos существенно меньше, чем у Illumina). Язык не поворачивается относить технологию к следующему поколению и непонятно, где найдёт применение машина Heliscop.

Секвенирование на отдельных молекулах - преимущество весьма существенное для определенных задач. В частности, для анализа минорных мутаций, что открывает принципиально новые возможности для минимально инвазивной ранней диагностики рака и мониторинга остаточной болезни, а также в миимально инвазивной пренатальной диагностике. Получится усовершенствованный и максимально информативный вариант digital PCR.
Правда, неясно, насколько для этой цели подойдут аппараты фирмы Helicos (и тем более Pаcific Biosciences). Тем не менее, Mayo Clinic начала тестирование Helsicope на пригодность для молекулярного скрининга рака толстого кишечника (Ahlquist, et al., 2009)
Участник оффлайн! Daemonarchestratygos
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 07.02.2010 08:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Занимательно.
guest: Константин
IP-штамп: frM1p/H99Ug/Q
гость



 прочитанное сообщение 13.03.2010 23:14     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

сИквенатор и сЕквенатор

Это один и тот же прибор?-))
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.03.2010 18:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

через год ABI сделает свой прибор для сиквенса с одной молекулы, а Пасифика продаст себя и (или)свой портфолио той же Иллюмине или Рошу, сами они ничего на рынок не выпустят, да и не купит никто прибор за пол-лимона у фирме их гаража, времена HP прошли

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 23.02.19 23:07
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft