Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Не идет ПЦР ДНК без ОТ!?!
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! -Alex-




 прочитанное сообщение 14.07.2010 09:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Уважаемые коллеги!
Столкнулся с такой проблемой: не идет амплификация ДНК вируса (ДНК содержащий!) без проведения обратной транскрипции. После проведения обратной транскрипции получаются адекватные результаты, соответствующие действительности (положительный и отрицательный контроль проходит).

В чем может быть причина???

________________________________________
ОТ проводится набором Рувурта-L (Интерлабсервис) с использованием рендом-праймеров.
Праймеры для проведения ПЦР:
Forvard 5'-CGGATATTGTAGTCCTGGTCG-3'
Revers 5'-CGCACCTTCGGATATACTGTC-3'

Фрагмент:
5'- cggatattgtagtcctggtcgtatatactgttttcgaacgcagtgccgaggcctacgtggtctacatttctagaggtttgtatcctcagccaaagctgat
tccttttgttatttggttggaagtaatcaatagtggagtcaagaacaggtttgggtgtgaagtaacgggagtggtaggagaagggttgggggattgtatg
gcgggaggagtagtttacatatgggtcataggttagggctgtggcctttgttacaaagttgtcatctagaataatagcactggatccaactcccctgtca
ccctgggtgatcggggagcagggccagaattcaaccttaacctttcttattctgtagtattcaaagggtatagagattttgttggtcccccctcccgggg
gaacaaagtcgtcaagattaaatctcagcatgtccaccgcccaggagggcgtgctgactgtggtagccttgacagtatatccgaaggtgcg-3'
_________________________________________

Заранее благодарен. -Alex-
Участник оффлайн! distemper
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.07.2010 10:03     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

по всей видимости у вас самого вируса мало. тогда логично предположить что с ревертацией получается из-за того, что у вас РНКовой стадии вируса больше в образце
Участник оффлайн! -Alex-




 прочитанное сообщение 14.07.2010 10:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Да, согласен, обратная транскрипция "накапливает" кДНК. Но при постановке ПЦР с достаточным количеством вируса положительного результата не происходит. Дело в том, что параллельно проводилась ПЦР с коммерческой тест-системой (для сравнения). Результат утвержденной тест-системы - положительный.
Участник оффлайн! Andrew
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 14.07.2010 10:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Насколько я помню цирковирусы не имеют РНК-стадии, а реплицируются по типу катящегося кольца (как М13). Так что каким образом ОТ может влиять немонятно. Разве что мРНК?
Участник оффлайн! Andrew
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 14.07.2010 10:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

А если циклов добавить?
Участник оффлайн! -Alex-




 прочитанное сообщение 14.07.2010 10:35     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Использовалась следующая программа амплификации:

1. 95C - 3 минуты

2. 35 циклов
95С - 15 сек
64С - 25 сек
72С - 30 сек
3. 72С - 1 минута

Попробую увеличить количество циклов... Можно было бы попробовать Nested PCR, но хотелось бы стандартный вариант...
Участник оффлайн! Andrew
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 14.07.2010 10:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Мне кажется еще отжиг нужно понизить скажем до 60С
Участник оффлайн! distemper
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.07.2010 11:42     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

(-Alex- @ 14.07.2010 08:08)
Ссылка на исходное сообщение  Да, согласен, обратная транскрипция "накапливает" кДНК. Но при постановке ПЦР с достаточным количеством вируса положительного результата не происходит. Дело в том, что параллельно проводилась ПЦР с коммерческой тест-системой (для сравнения). Результат утвержденной тест-системы - положительный.

а отрицательный контроль на коммерческой тест-системе отрицательный??? shuffle.gif
Участник оффлайн! -Alex-




 прочитанное сообщение 14.07.2010 12:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

На коммерческой тест-системе все работает замечательно - отрицательный контроль отрицательный, положительный контроль соответственно положительный. ДНК из биол.материала - положительный результат.

С указанными выше праймерами 1) с ОТ - получаю аналогичные результаты (при Т отжига 64); 2) без ОТ - на электрофорезе все чисто, даже никаких следов амплификации. Такое ощущение, что праймеры вовсе не работают...
Участник оффлайн! -Alex-




 прочитанное сообщение 14.07.2010 12:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

А могут праймеры быть причиной всему этому??? wall.gif
Guest
IP-штамп: frPqLNtfUIYa.
гость



 прочитанное сообщение 14.07.2010 14:02     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Может имеет дело какая-нибудь досадная ошибка? И просто недостающие компаненты для ПЦР идут с ОТ буфера? Думаю нужно переправерить состав вашей ПЦР смеси. Если все Ок, то попробовать провести все тоже самое, но не добавляя ревертазу.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 14.07.2010 14:19     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Попробуйте для начала разбавить готовую для реакции ДНК на порядок.
При какой Т оС ставится ОТ и сколько берете "ДНК для ОТ"?
В той крутой тест-системе те же праймеры? Все-таки, Т отж. очень высокая, хотя она тоже зависит от состава мастермикса.
Участник оффлайн! Andrew
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 14.07.2010 14:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Ну если бы они совсем не работали, как бы вы получили продукт с кДНК?
Участник оффлайн! -Alex-




 прочитанное сообщение 14.07.2010 14:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Спасибо за идею. Обязательно сделаю.

Обычно для ПЦР использую 2,5х ПЦР-смесь-2-blue (Интерлабсервис), в состав которого входят dNTP, Mg и пр.

Пробовал и следующий состав для ПЦР:
OT-буфер (х5) - 5 мкл
dNTP (х10) - 2,5 мкл
MgSO4 (50 мМ) - 1-2 мкл
Taq-pol - 0,25 мкл
DNA - 5 мкл
Праймеры (10 пкмоль) - по 1 мкл каждого
Н2О - до 25 мкл
Результат тот же...

Для ОТ беру 10 мкл выделенной ДНК/РНК. Обратная транскрипция идет при 37С в течение 30 минут. Затем полученную смесь разбавляю в 2 раза (1:1) и использую для ПЦР 5 мкл ДНК (кДНК).

В коммерческой тест-системе, которая использовалась для контроля, скорее всего использованы другие праймеры. Достоверно не известно, производитель не указывает... shuffle.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 14.07.2010 15:17     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

Известно, что Ревертазы ингибируют ПЦР... Отметается. Почему не идет напрямую ПЦР confused.gif
- ДНК грязная, содержит ингибиторы - нужно разбавить насколько возможно
- Можно допустить, что после ОТ Mg/dNTP оптимизировалось, случайно.
- Т отж. очень высокая...

Идея ставить ОТ откуда? confused.gif Я могу дать ПЦР Мастермиксы "очень устойчивые к ингибированию" smile.gif Используйте свой шанс (халява!).

П.С. мкл ни о чем не говорят. frown.gif Нужны конечные концентрации компонентов yes.gif
Участник оффлайн! -Alex-




 прочитанное сообщение 14.07.2010 15:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Идея поставить ОТ пришла случайно. Сначала решил, что праймеры не качественные, даже писал рекламацию в фирму, которая мне их синтезировала.

-Ъ-, С большим удовольствием попробую "очень устойчивые к ингибированию" мастермиксы. Как с Вами связаться?
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 14.07.2010 16:20     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

(-Alex- @ 14.07.2010 16:36)
Ссылка на исходное сообщение  Идея поставить ОТ пришла случайно.

Так не долго открытие какое-нить сделать. lol.gif Все они делаются случайно...
Со мной можно связаться по мейлу.
Участник оффлайн! -Alex-




 прочитанное сообщение 15.07.2010 20:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Коллеги! Вопрос практически решен... ПЦР не шла в виду отсутствия какого-то компонента, который входит в состав реакционной смеси для ОТ. Выяснить какой именно думаю будет не сложно.

Всем большое спасибо за советы и идеи. Очень помогли!!!!!! jump.gif yes.gif jump.gif
Участник оффлайн! artemka
Участник



 прочитанное сообщение 15.07.2010 20:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

(-Alex- @ 14.07.2010 10:49)
Ссылка на исходное сообщение  Уважаемые коллеги!
Столкнулся с такой проблемой: не идет амплификация ДНК вируса (ДНК содержащий!) без проведения обратной транскрипции. После проведения обратной транскрипции получаются адекватные результаты, соответствующие действительности (положительный и отрицательный контроль проходит).

В чем может быть причина???

________________________________________
ОТ проводится набором Рувурта-Л (Интерлабсервис) с использованием рендом-праймеров.
Праймеры для проведения ПЦР:
Форвард 5ь-ЦГГАТАТТГТАГТЦЦТГГТЦГ-3ь
Реверс  5ь-ЦГЦАЦЦТТЦГГАТАТАЦТГТЦ-3ь

Фрагмент:
5ь- цггататтгтагтццтггтцгтататацтгттттцгаацгцагтгццгаггццтацгтггтцтацатттцтагаггтттгтатццтцагццааагцтгат
тццттттгттатттггттггаагтаатцаатагтггагтцаагаацаггтттгггтгтгаагтаацгггагтггтаггагаагггттгггггаттгтатг
гцгггаггагтагтттацататгггтцатаггттагггцтгтггццтттгттацааагттгтцатцтагаатаатагцацтггатццаацтццццтгтца
цццтгггтгатцггггагцагггццагааттцааццттааццтттцттаттцтгтагтаттцааагггтатагагаттттгттггтццццццтцццгггг
гаацааагтцгтцаагаттааатцтцагцатгтццаццгцццаггагггцгтгцтгацтгтггтагццттгацагтататццгааггтгцг-3ь
_________________________________________

Заранее благодарен. -Алех-


добей праймеры с ТМ примерно 60-63 градуса - возми ампликон примерно 90 бп потом Такара СПЕЕДстар 95 градусов - 5 секунд , 60 градусов -20 секунд - 40 циклов -потом на 2% агарозе с ГельСтаром с голубым трансом и содиум боратном буффере при 20 вольт на сантиметр их прекрасно видно - и будет тебе счастье ЧУВСТВИТЕЛьНЕЙ , чем РеалТайм ПЦР с Такманами или СИБР Гринами smile.gif
Участник оффлайн! artemka
Участник



 прочитанное сообщение 15.07.2010 21:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

(-Alex- @ 14.07.2010 10:49)
Ссылка на исходное сообщение  Уважаемые коллеги!
Столкнулся с такой проблемой: не идет амплификация ДНК вируса (ДНК содержащий!) без проведения обратной транскрипции. После проведения обратной транскрипции получаются адекватные результаты, соответствующие действительности (положительный и отрицательный контроль проходит).

В чем может быть причина???

________________________________________
ОТ проводится набором Рувурта-Л (Интерлабсервис) с использованием рендом-праймеров.
Праймеры для проведения ПЦР:
Форвард 5ь-ЦГГАТАТТГТАГТЦЦТГГТЦГ-3ь
Реверс  5ь-ЦГЦАЦЦТТЦГГАТАТАЦТГТЦ-3ь

Фрагмент:
5ь- цггататтгтагтццтггтцгтататацтгттттцгаацгцагтгццгаггццтацгтггтцтацатттцтагаггтттгтатццтцагццааагцтгат
тццттттгттатттггттггаагтаатцаатагтггагтцаагаацаггтттгггтгтгаагтаацгггагтггтаггагаагггттгггггаттгтатг
гцгггаггагтагтттацататгггтцатаггттагггцтгтггццтттгттацааагттгтцатцтагаатаатагцацтггатццаацтццццтгтца
цццтгггтгатцггггагцагггццагааттцааццттааццтттцттаттцтгтагтаттцааагггтатагагаттттгттггтццццццтцццгггг
гаацааагтцгтцаагаттааатцтцагцатгтццаццгцццаггагггцгтгцтгацтгтггтагццттгацагтататццгааггтгцг-3ь
_________________________________________

Заранее благодарен. -Алех-


я тебе этот тест на хвирус сделаю в 5 минут - не долбись с ампликонами длиннее 100 бп smile.gif
Участник оффлайн! artemka
Участник



 прочитанное сообщение 15.07.2010 21:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

(-Alex- @ 14.07.2010 10:49)
Ссылка на исходное сообщение  Уважаемые коллеги!
Столкнулся с такой проблемой: не идет амплификация ДНК вируса (ДНК содержащий!) без проведения обратной транскрипции. После проведения обратной транскрипции получаются адекватные результаты, соответствующие действительности (положительный и отрицательный контроль проходит).

В чем может быть причина???

________________________________________
ОТ проводится набором Рувурта-Л (Интерлабсервис) с использованием рендом-праймеров.
Праймеры для проведения ПЦР:
Форвард 5ь-ЦГГАТАТТГТАГТЦЦТГГТЦГ-3ь
Реверс  5ь-ЦГЦАЦЦТТЦГГАТАТАЦТГТЦ-3ь

Фрагмент:
5ь- цггататтгтагтццтггтцгтататацтгттттцгаацгцагтгццгаггццтацгтггтцтацатттцтагаггтттгтатццтцагццааагцтгат
тццттттгттатттггттггаагтаатцаатагтггагтцаагаацаггтттгггтгтгаагтаацгггагтггтаггагаагггттгггггаттгтатг
гцгггаггагтагтттацататгггтцатаггттагггцтгтггццтттгттацааагттгтцатцтагаатаатагцацтггатццаацтццццтгтца
цццтгггтгатцггггагцагггццагааттцааццттааццтттцттаттцтгтагтаттцааагггтатагагаттттгттггтццццццтцццгггг
гаацааагтцгтцаагаттааатцтцагцатгтццаццгцццаггагггцгтгцтгацтгтггтагццттгацагтататццгааггтгцг-3ь
_________________________________________

Заранее благодарен. -Алех-



это что за херня ? полный геном ДНКа хвируса ? smile.gif
Участник оффлайн! artemka
Участник



 прочитанное сообщение 15.07.2010 21:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

(-Alex- @ 14.07.2010 10:49)
Ссылка на исходное сообщение  Уважаемые коллеги!
Столкнулся с такой проблемой: не идет амплификация ДНК вируса (ДНК содержащий!) без проведения обратной транскрипции. После проведения обратной транскрипции получаются адекватные результаты, соответствующие действительности (положительный и отрицательный контроль проходит).

В чем может быть причина???



________________________________________
ОТ проводится набором Рувурта-L (Интерлабсервис) с использованием рендом-праймеров.
Праймеры для проведения ПЦР:
Forvard 5'-CGGATATTGTAGTCCTGGTCG-3'
Revers  5'-CGCACCTTCGGATATACTGTC-3'

Фрагмент:
5'- cggatattgtagtcctggtcgtatatactgttttcgaacgcagtgccgaggcctacgtggtctacatttctagaggtttgtatcctcagccaaagctgat
tccttttgttatttggttggaagtaatcaatagtggagtcaagaacaggtttgggtgtgaagtaacgggagtggtaggagaagggttgggggattgtatg
gcgggaggagtagtttacatatgggtcataggttagggctgtggcctttgttacaaagttgtcatctagaataatagcactggatccaactcccctgtca
ccctgggtgatcggggagcagggccagaattcaaccttaacctttcttattctgtagtattcaaagggtatagagattttgttggtcccccctcccgggg
gaacaaagtcgtcaagattaaatctcagcatgtccaccgcccaggagggcgtgctgactgtggtagccttgacagtatatccgaaggtgcg-3'
_________________________________________

Заранее благодарен. -Alex-





J Virol Methods. 2010 May 13. [Epub ahead of print]

Fast short-fragment PCR for rapid and sensitive detection of shrimp viruses.
Mrotzek G, Haryanti, Koesharyani I, Tretyakov AN, Sugama K, Saluz HP.

Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology, Hans Knoell Institute, Beutenbergstrasse 11a, 07745 Jena, Germany; Friedrich-Schiller-University, Jena, Germany.

Abstract
This article describes a fast short-fragment PCR method for the detection of white spot syndrome virus (WSSV), infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV), and monodon baculovirus (MBV). Fast two-temperature (95 degrees C denaturation and 60 degrees C annealing/extension) PCRs were performed in 5-10mul volume samples in miniaturized microplates using a fast Peltier thermal cycler. 40 cycles were completed in 25-30min. Rapid high-resolution agarose gel electrophoresis of 70-150bp PCR fragments was performed in 10min. High sensitivity of PCR product detection (50-100pg) was obtained using ultra sensitive dyes such as GelStar(®) and a gel documentation system equipped with a blue-light transilluminator. This novel method is faster and more sensitive than its TaqMan(®) real-time PCR counterparts. Copyright © 2010. Published by Elsevier B.V.

PMID: 20471423 [PubMed - as supplied by publisher]


LinkOut - more resources
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 15.07.2010 22:12     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

(-Alex- @ 15.07.2010 21:47)
Ссылка на исходное сообщение  Коллеги! Вопрос практически решен... ПЦР не шла в виду отсутствия какого-то компонента, который входит в состав реакционной смеси для ОТ. Выяснить какой именно думаю будет не сложно.

Всем большое спасибо за советы и идеи. Очень  помогли!!!!!! jump.gif  yes.gif  jump.gif

Или дНТП. или же Магния, очевидно, не было совсем или был дефицит большой.
Участник оффлайн! artemka
Участник



 прочитанное сообщение 15.07.2010 22:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

(-Ъ- @ 15.07.2010 23:12)
Ссылка на исходное сообщение  Или дНТП. или же Магния, очевидно, не было совсем или был дефицит большой.


похоже у тебя "дефицит в башке" от перегрева в масскве smile.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 15.07.2010 22:28     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

Чувак сунулся почему-то (говорит - случайно) с ПЦР мастермиксом в ОТ и черпанул оттуда чего-то недостящего. confused.gif И реакция пошла родимая. eek.gif
Как сказал бы один мой знакомый -
Такие времена.
Участник оффлайн! artemka
Участник



 прочитанное сообщение 15.07.2010 23:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

(-Ъ- @ 15.07.2010 23:28)
Ссылка на исходное сообщение  Чувак сунулся почему-то (говорит - случайно) с ПЦР мастермиксом в ОТ и черпанул оттуда чего-то недостящего. confused.gif И реакция пошла родимая. eek.gif
Как сказал бы один мой знакомый -
Такие времена.


так сказал наш "ПЦР-ный Гуру" , которого ПЦРу учил Олег Кабоев из Гатчины smile.gif - не трепыхайси smile.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.07.2010 09:37     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

(artemka @ 16.07.2010 00:04)
Ссылка на исходное сообщение  так сказал наш "ПЦР-ный Гуру" , которого ПЦРу учил Олег Кабоев из Гатчины smile.gif - не трепыхайси smile.gif

Как же не трепыхаться!
Надо же разобраться чтоб знать чего далее ожидать - может клиенту вздумается перед ПЦР исполнить арию из оперы... или поплясать вокруг термоциклера... confused.gif
Участник оффлайн! artemka
Участник



 прочитанное сообщение 17.07.2010 22:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

(-Alex- @ 14.07.2010 15:32)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо за идею. Обязательно сделаю.

Обычно для ПЦР использую  2,5х ПЦР-смесь-2-блуе (Интерлабсервис), в состав которого входят дНТП, Мг и пр.

Пробовал и следующий состав для ПЦР:
ОТ-буфер (х5) - 5 мкл
дНТП (х10)      - 2,5 мкл
МгСО4 (50 мМ) - 1-2 мкл
Тая-пол            - 0,25 мкл
ДНА                - 5 мкл
Праймеры (10 пкмоль) - по 1 мкл каждого
Н2О                - до 25 мкл
Результат тот же...

Для ОТ беру 10 мкл выделенной ДНК/РНК. Обратная транскрипция идет при 37С в течение 30 минут. Затем полученную смесь разбавляю в 2 раза (1:1) и использую для ПЦР 5 мкл ДНК (кДНК).

В коммерческой тест-системе, которая использовалась для контроля,  скорее всего использованы другие праймеры. Достоверно не известно, производитель не указывает... shuffle.gif



Не читайте перед обедом советские газеты - по поводу "производитель не указывает" smile.gif
nigoal123
IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  18.12.2021 11:58     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

Do you know how to แทงบอล prepare an exquisite turkey สล็อต123 dinner on a shoestring nigoal123 work in the child เซ็กซี่บาคาร่า Well you need to do some SA Gaming family and community services sectors.

If you’ve ever jotted down a หวย you already understand the QR Code the reader and can often สล็อตออนไลน์ inform be submitted to an editor Dream Gaming of another writer’s article. คาสิโนออนไลน์ with a simple cover letter.

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 19.03.24 10:39
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft