Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
-Alex- |
Столкнулся с такой проблемой: не идет амплификация ДНК вируса (ДНК содержащий!) без проведения обратной транскрипции. После проведения обратной транскрипции получаются адекватные результаты, соответствующие действительности (положительный и отрицательный контроль проходит). В чем может быть причина??? ________________________________________ ОТ проводится набором Рувурта-L (Интерлабсервис) с использованием рендом-праймеров. Праймеры для проведения ПЦР: Forvard 5'-CGGATATTGTAGTCCTGGTCG-3' Revers 5'-CGCACCTTCGGATATACTGTC-3' Фрагмент: 5'- cggatattgtagtcctggtcgtatatactgttttcgaacgcagtgccgaggcctacgtggtctacatttctagaggtttgtatcctcagccaaagctgat tccttttgttatttggttggaagtaatcaatagtggagtcaagaacaggtttgggtgtgaagtaacgggagtggtaggagaagggttgggggattgtatg gcgggaggagtagtttacatatgggtcataggttagggctgtggcctttgttacaaagttgtcatctagaataatagcactggatccaactcccctgtca ccctgggtgatcggggagcagggccagaattcaaccttaacctttcttattctgtagtattcaaagggtatagagattttgttggtcccccctcccgggg gaacaaagtcgtcaagattaaatctcagcatgtccaccgcccaggagggcgtgctgactgtggtagccttgacagtatatccgaaggtgcg-3' _________________________________________ Заранее благодарен. -Alex- |
distemper Постоянный участник |
|
-Alex- |
|
Andrew Постоянный участник Москва |
|
Andrew Постоянный участник Москва |
|
-Alex- |
1. 95C - 3 минуты 2. 35 циклов 95С - 15 сек 64С - 25 сек 72С - 30 сек 3. 72С - 1 минута Попробую увеличить количество циклов... Можно было бы попробовать Nested PCR, но хотелось бы стандартный вариант... |
Andrew Постоянный участник Москва |
|
distemper Постоянный участник |
(-Alex- @ 14.07.2010 08:08) Да, согласен, обратная транскрипция "накапливает" кДНК. Но при постановке ПЦР с достаточным количеством вируса положительного результата не происходит. Дело в том, что параллельно проводилась ПЦР с коммерческой тест-системой (для сравнения). Результат утвержденной тест-системы - положительный. а отрицательный контроль на коммерческой тест-системе отрицательный??? |
-Alex- |
С указанными выше праймерами 1) с ОТ - получаю аналогичные результаты (при Т отжига 64); 2) без ОТ - на электрофорезе все чисто, даже никаких следов амплификации. Такое ощущение, что праймеры вовсе не работают... |
-Alex- |
|
Guest IP-штамп: frPqLNtfUIYa. гость |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
При какой Т оС ставится ОТ и сколько берете "ДНК для ОТ"? В той крутой тест-системе те же праймеры? Все-таки, Т отж. очень высокая, хотя она тоже зависит от состава мастермикса. |
Andrew Постоянный участник Москва |
|
-Alex- |
Обычно для ПЦР использую 2,5х ПЦР-смесь-2-blue (Интерлабсервис), в состав которого входят dNTP, Mg и пр. Пробовал и следующий состав для ПЦР: OT-буфер (х5) - 5 мкл dNTP (х10) - 2,5 мкл MgSO4 (50 мМ) - 1-2 мкл Taq-pol - 0,25 мкл DNA - 5 мкл Праймеры (10 пкмоль) - по 1 мкл каждого Н2О - до 25 мкл Результат тот же... Для ОТ беру 10 мкл выделенной ДНК/РНК. Обратная транскрипция идет при 37С в течение 30 минут. Затем полученную смесь разбавляю в 2 раза (1:1) и использую для ПЦР 5 мкл ДНК (кДНК). В коммерческой тест-системе, которая использовалась для контроля, скорее всего использованы другие праймеры. Достоверно не известно, производитель не указывает... |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
- ДНК грязная, содержит ингибиторы - нужно разбавить насколько возможно - Можно допустить, что после ОТ Mg/dNTP оптимизировалось, случайно. - Т отж. очень высокая... Идея ставить ОТ откуда? Я могу дать ПЦР Мастермиксы "очень устойчивые к ингибированию" Используйте свой шанс (халява!). П.С. мкл ни о чем не говорят. Нужны конечные концентрации компонентов |
-Alex- |
-Ъ-, С большим удовольствием попробую "очень устойчивые к ингибированию" мастермиксы. Как с Вами связаться? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(-Alex- @ 14.07.2010 16:36) Так не долго открытие какое-нить сделать. Все они делаются случайно... Со мной можно связаться по мейлу. |
-Alex- |
Всем большое спасибо за советы и идеи. Очень помогли!!!!!! |
artemka Участник |
(-Alex- @ 14.07.2010 10:49) Уважаемые коллеги! Столкнулся с такой проблемой: не идет амплификация ДНК вируса (ДНК содержащий!) без проведения обратной транскрипции. После проведения обратной транскрипции получаются адекватные результаты, соответствующие действительности (положительный и отрицательный контроль проходит). В чем может быть причина??? ________________________________________ ОТ проводится набором Рувурта-Л (Интерлабсервис) с использованием рендом-праймеров. Праймеры для проведения ПЦР: Форвард 5ь-ЦГГАТАТТГТАГТЦЦТГГТЦГ-3ь Реверс 5ь-ЦГЦАЦЦТТЦГГАТАТАЦТГТЦ-3ь Фрагмент: 5ь- цггататтгтагтццтггтцгтататацтгттттцгаацгцагтгццгаггццтацгтггтцтацатттцтагаггтттгтатццтцагццааагцтгат тццттттгттатттггттггаагтаатцаатагтггагтцаагаацаггтттгггтгтгаагтаацгггагтггтаггагаагггттгггггаттгтатг гцгггаггагтагтттацататгггтцатаггттагггцтгтггццтттгттацааагттгтцатцтагаатаатагцацтггатццаацтццццтгтца цццтгггтгатцггггагцагггццагааттцааццттааццтттцттаттцтгтагтаттцааагггтатагагаттттгттггтццццццтцццгггг гаацааагтцгтцаагаттааатцтцагцатгтццаццгцццаггагггцгтгцтгацтгтггтагццттгацагтататццгааггтгцг-3ь _________________________________________ Заранее благодарен. -Алех- добей праймеры с ТМ примерно 60-63 градуса - возми ампликон примерно 90 бп потом Такара СПЕЕДстар 95 градусов - 5 секунд , 60 градусов -20 секунд - 40 циклов -потом на 2% агарозе с ГельСтаром с голубым трансом и содиум боратном буффере при 20 вольт на сантиметр их прекрасно видно - и будет тебе счастье ЧУВСТВИТЕЛьНЕЙ , чем РеалТайм ПЦР с Такманами или СИБР Гринами |
artemka Участник |
(-Alex- @ 14.07.2010 10:49) Уважаемые коллеги! Столкнулся с такой проблемой: не идет амплификация ДНК вируса (ДНК содержащий!) без проведения обратной транскрипции. После проведения обратной транскрипции получаются адекватные результаты, соответствующие действительности (положительный и отрицательный контроль проходит). В чем может быть причина??? ________________________________________ ОТ проводится набором Рувурта-Л (Интерлабсервис) с использованием рендом-праймеров. Праймеры для проведения ПЦР: Форвард 5ь-ЦГГАТАТТГТАГТЦЦТГГТЦГ-3ь Реверс 5ь-ЦГЦАЦЦТТЦГГАТАТАЦТГТЦ-3ь Фрагмент: 5ь- цггататтгтагтццтггтцгтататацтгттттцгаацгцагтгццгаггццтацгтггтцтацатттцтагаггтттгтатццтцагццааагцтгат тццттттгттатттггттггаагтаатцаатагтггагтцаагаацаггтттгггтгтгаагтаацгггагтггтаггагаагггттгггггаттгтатг гцгггаггагтагтттацататгггтцатаггттагггцтгтггццтттгттацааагттгтцатцтагаатаатагцацтггатццаацтццццтгтца цццтгггтгатцггггагцагггццагааттцааццттааццтттцттаттцтгтагтаттцааагггтатагагаттттгттггтццццццтцццгггг гаацааагтцгтцаагаттааатцтцагцатгтццаццгцццаггагггцгтгцтгацтгтггтагццттгацагтататццгааггтгцг-3ь _________________________________________ Заранее благодарен. -Алех- я тебе этот тест на хвирус сделаю в 5 минут - не долбись с ампликонами длиннее 100 бп |
artemka Участник |
(-Alex- @ 14.07.2010 10:49) Уважаемые коллеги! Столкнулся с такой проблемой: не идет амплификация ДНК вируса (ДНК содержащий!) без проведения обратной транскрипции. После проведения обратной транскрипции получаются адекватные результаты, соответствующие действительности (положительный и отрицательный контроль проходит). В чем может быть причина??? ________________________________________ ОТ проводится набором Рувурта-Л (Интерлабсервис) с использованием рендом-праймеров. Праймеры для проведения ПЦР: Форвард 5ь-ЦГГАТАТТГТАГТЦЦТГГТЦГ-3ь Реверс 5ь-ЦГЦАЦЦТТЦГГАТАТАЦТГТЦ-3ь Фрагмент: 5ь- цггататтгтагтццтггтцгтататацтгттттцгаацгцагтгццгаггццтацгтггтцтацатттцтагаггтттгтатццтцагццааагцтгат тццттттгттатттггттггаагтаатцаатагтггагтцаагаацаггтттгггтгтгаагтаацгггагтггтаггагаагггттгггггаттгтатг гцгггаггагтагтттацататгггтцатаггттагггцтгтггццтттгттацааагттгтцатцтагаатаатагцацтггатццаацтццццтгтца цццтгггтгатцггггагцагггццагааттцааццттааццтттцттаттцтгтагтаттцааагггтатагагаттттгттггтццццццтцццгггг гаацааагтцгтцаагаттааатцтцагцатгтццаццгцццаггагггцгтгцтгацтгтггтагццттгацагтататццгааггтгцг-3ь _________________________________________ Заранее благодарен. -Алех- это что за херня ? полный геном ДНКа хвируса ? |
artemka Участник |
(-Alex- @ 14.07.2010 10:49) Уважаемые коллеги! Столкнулся с такой проблемой: не идет амплификация ДНК вируса (ДНК содержащий!) без проведения обратной транскрипции. После проведения обратной транскрипции получаются адекватные результаты, соответствующие действительности (положительный и отрицательный контроль проходит). В чем может быть причина??? ________________________________________ ОТ проводится набором Рувурта-L (Интерлабсервис) с использованием рендом-праймеров. Праймеры для проведения ПЦР: Forvard 5'-CGGATATTGTAGTCCTGGTCG-3' Revers 5'-CGCACCTTCGGATATACTGTC-3' Фрагмент: 5'- cggatattgtagtcctggtcgtatatactgttttcgaacgcagtgccgaggcctacgtggtctacatttctagaggtttgtatcctcagccaaagctgat tccttttgttatttggttggaagtaatcaatagtggagtcaagaacaggtttgggtgtgaagtaacgggagtggtaggagaagggttgggggattgtatg gcgggaggagtagtttacatatgggtcataggttagggctgtggcctttgttacaaagttgtcatctagaataatagcactggatccaactcccctgtca ccctgggtgatcggggagcagggccagaattcaaccttaacctttcttattctgtagtattcaaagggtatagagattttgttggtcccccctcccgggg gaacaaagtcgtcaagattaaatctcagcatgtccaccgcccaggagggcgtgctgactgtggtagccttgacagtatatccgaaggtgcg-3' _________________________________________ Заранее благодарен. -Alex- J Virol Methods. 2010 May 13. [Epub ahead of print] Fast short-fragment PCR for rapid and sensitive detection of shrimp viruses. Mrotzek G, Haryanti, Koesharyani I, Tretyakov AN, Sugama K, Saluz HP. Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology, Hans Knoell Institute, Beutenbergstrasse 11a, 07745 Jena, Germany; Friedrich-Schiller-University, Jena, Germany. Abstract This article describes a fast short-fragment PCR method for the detection of white spot syndrome virus (WSSV), infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV), and monodon baculovirus (MBV). Fast two-temperature (95 degrees C denaturation and 60 degrees C annealing/extension) PCRs were performed in 5-10mul volume samples in miniaturized microplates using a fast Peltier thermal cycler. 40 cycles were completed in 25-30min. Rapid high-resolution agarose gel electrophoresis of 70-150bp PCR fragments was performed in 10min. High sensitivity of PCR product detection (50-100pg) was obtained using ultra sensitive dyes such as GelStar(®) and a gel documentation system equipped with a blue-light transilluminator. This novel method is faster and more sensitive than its TaqMan(®) real-time PCR counterparts. Copyright © 2010. Published by Elsevier B.V. PMID: 20471423 [PubMed - as supplied by publisher] LinkOut - more resources |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(-Alex- @ 15.07.2010 21:47) Коллеги! Вопрос практически решен... ПЦР не шла в виду отсутствия какого-то компонента, который входит в состав реакционной смеси для ОТ. Выяснить какой именно думаю будет не сложно. Всем большое спасибо за советы и идеи. Очень помогли!!!!!! Или дНТП. или же Магния, очевидно, не было совсем или был дефицит большой. |
artemka Участник |
(-Ъ- @ 15.07.2010 23:12) похоже у тебя "дефицит в башке" от перегрева в масскве |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Как сказал бы один мой знакомый - Такие времена. |
artemka Участник |
(-Ъ- @ 15.07.2010 23:28) Чувак сунулся почему-то (говорит - случайно) с ПЦР мастермиксом в ОТ и черпанул оттуда чего-то недостящего. И реакция пошла родимая. Как сказал бы один мой знакомый - Такие времена. так сказал наш "ПЦР-ный Гуру" , которого ПЦРу учил Олег Кабоев из Гатчины - не трепыхайси |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(artemka @ 16.07.2010 00:04) Как же не трепыхаться! Надо же разобраться чтоб знать чего далее ожидать - может клиенту вздумается перед ПЦР исполнить арию из оперы... или поплясать вокруг термоциклера... |
artemka Участник |
(-Alex- @ 14.07.2010 15:32) Спасибо за идею. Обязательно сделаю. Обычно для ПЦР использую 2,5х ПЦР-смесь-2-блуе (Интерлабсервис), в состав которого входят дНТП, Мг и пр. Пробовал и следующий состав для ПЦР: ОТ-буфер (х5) - 5 мкл дНТП (х10) - 2,5 мкл МгСО4 (50 мМ) - 1-2 мкл Тая-пол - 0,25 мкл ДНА - 5 мкл Праймеры (10 пкмоль) - по 1 мкл каждого Н2О - до 25 мкл Результат тот же... Для ОТ беру 10 мкл выделенной ДНК/РНК. Обратная транскрипция идет при 37С в течение 30 минут. Затем полученную смесь разбавляю в 2 раза (1:1) и использую для ПЦР 5 мкл ДНК (кДНК). В коммерческой тест-системе, которая использовалась для контроля, скорее всего использованы другие праймеры. Достоверно не известно, производитель не указывает... Не читайте перед обедом советские газеты - по поводу "производитель не указывает" |
nigoal123 IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE гость |
If you’ve ever jotted down a |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |