Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Доморощенные магносорбенты -- Где можно использовать? --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Кураторы темы:* genseq
Чёрный список: R.J.Dio, R.J. Dio
     NB! в теме нельзя обсуждать тех, кто внесён в чёрный список
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.09.2013 20:11     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

На днях наловчился получать магносорбенты. Пока сделал три варианта:
1. Силикатные.
2. Фосфатные.
3. Цинковые.
С первыми - силикатными - всё более или менее понятно. Нужны для выделения ДНК, и проверка их работоспособности - вопрос времени. А вот зачем могут понадобиться фосфатные? confused.gif Не исключено, что их можно использовать вместо фосфоцеллюлозы. Да и просто в качестве ионообменника.
Цинковые, похоже, нигде пока не используются, но они должны очень хорошо связывать и ДНК, и РНК, и все прочие низко- и высокомолекулярные фосфат-содержащие соединения. Возможно и гистидин-содержащие.

Буду признателен за любые предложения. Если предложения будут не теоретические, а практические (по их испытаниям), то берусь обеспечить и магносорбентами, и магнитными штативами:
http://molbiol.ru/forums/index.php?act=Att...=post&id=181131
Участник оффлайн! comp3v
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 12.09.2013 07:49     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

а для пришивания антител никакие из них не подходят? чтобы иммунопреципитацию делать
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.09.2013 09:17     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

(comp3v @ 12.09.2013 05:49)
Ссылка на исходное сообщение  а для пришивания антител никакие из них не подходят? чтобы иммунопреципитацию делать


Хорошая идея! Фосфатные должны неплохо сшиваться с аминными группами карободимидом. Только для активации такой сшивки, в отличие от карбоксильных, используется не гидроксисукцинимид, а какая-то другая фиговинкаconfused.gif (забыл название). Связь P-N кислотолабильная, но в обычных условиях вполне стабильная.

Сообщение было отредактировано genseq - 13.09.2013 09:13
Участник оффлайн! comp3v
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 12.09.2013 13:57     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

в общем, если удастся такое сделать, было бы вполне востребовано.
Ещё вот, вариация на ту же тему - кобальтовые (Co2+ или Ni2+) магнитные бидсы для выделения His-меченых белков, как альтернатива TALON'у - это вот мы бы хоть прямщас купили.
Участник оффлайн! inview




 прочитанное сообщение 12.09.2013 15:27     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

(comp3v @ 12.09.2013 14:57)
Ссылка на исходное сообщение  в общем, если удастся такое сделать, было бы вполне востребовано.
Ещё вот, вариация на ту же тему - кобальтовые (Co2+ или Ni2+) магнитные бидсы для выделения His-меченых белков, как альтернатива TALON'у - это вот мы бы хоть прямщас купили.
Тоже подумал про кобальтовые и никелевые сорбенты, но не для гистидиновых гибридов, а для выделения некоторых металл-связывающих белков из биожидкостей. Такое было бы интересно потестить. Цинк в этом смысле менее подходящ.
Участник оффлайн! comp3v
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 12.09.2013 15:29     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

(genseq @ 12.09.2013 15:42)
Ссылка на исходное сообщение  Подозреваю, что His-тэги с цинком будут связываться не хуже, чем с никелем. Эти подозрения вселяют некоторые публикации. Например:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P.../BCA-02-125.pdf
хммм, вот тут не уверен. Всё-таки один факт наличия взаимодействия, показанного в статье, вовсе не означает, что это взаимодействие будет достаточно сильным для выделения белков. Да и неспроста, наверное, все производители делают только кобальтовые либо никелевые сорбенты.

Поэкспериментировать - можно попробовать, месяца через полтора планирую снова вернуться к выделениям His-меченых белков. Да, забыл сказать - у меня протокол выделения в денатурирующих условиях (6M гуанидин-хлорид) - выдержат ваши сорбенты такое?

Сообщение было отредактировано comp3v - 12.09.2013 15:31
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.09.2013 16:01     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(comp3v @ 12.09.2013 13:29)
Ссылка на исходное сообщение  хммм, вот тут не уверен. Всё-таки один факт наличия взаимодействия, показанного в статье, вовсе не означает, что это взаимодействие будет достаточно сильным для выделения белков. Да и неспроста, наверное, все производители делают только кобальтовые либо никелевые сорбенты.

Поэкспериментировать - можно попробовать, месяца через полтора планирую снова вернуться к выделениям His-меченых белков. Да, забыл сказать - у меня протокол выделения в денатурирующих условиях (6M гуанидин-хлорид) - выдержат ваши сорбенты такое?


Уговорили. Сделаю и никелевые. smile.gif
Сорбенты сферические, но сугубо неорганические. Теоретически гуанидин на них действовать не должен. rolleyes.gif
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.09.2013 21:20     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Цинк связывает His6 лучше никеля в 20 раз!
http://peds.oxfordjournals.org/content/21/8/529.long

Сообщение было отредактировано genseq - 12.09.2013 21:41

Файл/ы:

скачать файл Fluorescence_imaging_of_His_tag_fused_proteins.pdf
размер: 1.87мб
кол-во скачиваний: 248


Участник оффлайн! comp3v
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 13.09.2013 06:54     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

ну, вот в этом обзоре по IMAC пишут, что с цинком тоже вполне себе работало, хотя и немного похуже чем с никелем - см. Fig. 27.9
guest: ммм
IP-штамп: frQlBxj4iQSg.
гость



 прочитанное сообщение 13.09.2013 07:49     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы     
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Если вы собираетесь использовать неорганическую матрицу для сорбции белков, моут быть проблемы, как с неспецифической сорбцией, так и с необратимой сорбцией на матрице.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.09.2013 07:50     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Судя по всему, Zn связывает His6 не хуже (или лучше) Ni, но последний, в отличии от первого, не реагирует на фосфаты (см. табл. 27.2 этого обзора) и на бета-меркаптоэтанол. А цинк, похоже, вяжется и с сульфгидрильными группами, и с нуклеотидами, и с РНК. Т.е. при недостатке сорбента они могут мешать связыванию His6-рекомбинантов и потребуется предварительная очистка. Хотя в обзоре Zn работал очень неплохо. Правда, они чистили белок, содержащий Zn-finger.

Zn_Ni.JPG - кликните, чтобы открыть увеличенную картинку

Сообщение было отредактировано genseq - 13.09.2013 08:01

Файл/ы:

скачать файл IMAC_Review.pdf
размер: 1.33мб
кол-во скачиваний: 31766


Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.09.2013 13:39     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

А банальные силикатные на пробу поюзать можно для ДНК? Сейчас как раз играюсь с различными типами частиц.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.09.2013 17:37     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(avial @ 13.09.2013 11:39)
Ссылка на исходное сообщение  А банальные силикатные на пробу поюзать можно для ДНК? Сейчас как раз играюсь с различными типами частиц.


Можно, но не сегодня. Препарат сможете забрать следующей неделе. Явки и пароли передам по E-mail.
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.09.2013 23:48     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Спасибо!

В процессе игр выяснил, что в отмывочном буфере Силекса явно содержится что-то типа эфира (по запаху) - а для чего?
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.09.2013 08:01     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

(avial @ 13.09.2013 21:48)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо!

В процессе игр выяснил, что в отмывочном буфере Силекса явно содержится что-то типа эфира (по запаху) - а для чего?


Не знаю как у Силекса, но за бугром "отмывочный буфер" - это, как правило, 70% этанол. Вместо этанола можно использовать изопропанол (ИПС), который я покупаю в лакокрасочном отделе хозяйственного магазина и использую вместо этанола на стадии силиконизации магносорбентов. Правда, сейчас ИПС завозить перестали и пришлось перейти на ацетон. Кстати, об ацетоне. Можно попытаться заменить им спирт в отмывочном буфере. shuffle.gif

Сообщение было отредактировано genseq - 14.09.2013 08:06
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.09.2013 23:52     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

С этанолом никогда нельзя убрать носиком полностью последнюю каплю жидкости со дна пробирки, а с буфером Силекса пробирка остается почти сухой - подозреваю, что эфир там именно для этого, поверхностное натяжение менять.
Но в составе ничего такого нет, обманывают?
Участник оффлайн! T2006




 прочитанное сообщение 23.09.2013 12:06     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

(genseq @ 11.09.2013 21:11)
Ссылка на исходное сообщение  
Буду признателен за любые предложения. Если предложения будут не теоретические, а практические (по их испытаниям), то берусь обеспечить и магносорбентами, и магнитными штативами:
http://molbiol.ru/forums/index.php?act=Att...=post&id=181131[/url]


Genseq, нас интересуют магносорбенты на пробу, беремся их проверить )))
Как с Вами связаться?
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 23.09.2013 15:42     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Генсек мне давал на испытание (то бишь сравнить с моими магносорбентом и нат. силикой), а мне все некогда frown.gif . Приходите, отолью, если, конечно, Генсек не возражает. smile.gif
Баба с возу - потехе час. rolleyes.gif

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 23.09.2013 15:54
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 26.09.2013 08:05     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

Я бы тоже хотел попробовать.
Ещё есть возможность?
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 02.10.2013 08:37     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

Пузырёк, отправленный обычной посылкой в Новосибирск, застрял в Москве. Наверное, не понравился рентгеновскому аппарату. frown.gif
А вот отправленные одновременно с ним магнитные штативы на Казанском вокзале отметились 25 сентября и должны быть уже где-то на подходе к Новосибирску. beer.gif

Появилась идея магносорбенты рассылать в письмах - в пакетиках, содержащих по 1...2 г. сухого порошка, похожего на обычную глину. Интересно, письма рентгеном проверяют? confused.gif

Сообщение было отредактировано genseq - 10.10.2013 17:50
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.10.2013 17:49     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

Первая проверка силикатных сорбентов прошла успешно. Превосходят магносорбенты Промеги и Силекса. jump.gif Не уступают ИзоГеновским. beer.gif
Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость



 прочитанное сообщение 11.10.2013 08:24     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы     
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

(genseq @ 10.10.2013 17:49)
Ссылка на исходное сообщение  Первая проверка силикатных сорбентов прошла успешно. Превосходят магносорбенты Промеги и Силекса.  jump.gif Не уступают ИзоГеновским. beer.gif


ну и сколко ДНКа из 30 миклов кровушки ? smile.gif

http://www.lifetechnologies.com/us/en/home...-universal.html
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 15.10.2013 10:36     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

(genseq @ 10.10.2013 18:49)
Ссылка на исходное сообщение  Первая проверка силикатных сорбентов прошла успешно. Превосходят магносорбенты Промеги и Силекса.  jump.gif Не уступают ИзоГеновским. beer.gif

Как бы ознакомиться с протоколом испытаний? Ведь магносорбенты из одного кита могут не работать с растворами кита другого производителя. Я такое наблюдал когда сравнивал "все своё" с промеговским магносорбентом.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 15.10.2013 10:41     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

(Guest @ 11.10.2013 09:24)
Ссылка на исходное сообщение  ну и сколко ДНКа из 30 миклов кровушки ? smile.gif

http://www.lifetechnologies.com/us/en/home...-universal.html

Потери - не более 20%, многое зависит от состояния "кровушки".
В этой ссылке не совсем аналог, того что делает Генсек.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.10.2013 10:59     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

Вторые испытания с той же партией сорбентов провалились. Похоже, из-за зарастания какой-то микрофлорой. Сорбент норовил закупорить носик пипетки, да ещё и ингибировал ПЦР. Правда, в них участвовала ещё одна партия, приготовленная позднее. С ней всё прошло отлично.

Похоже, зря я в этот раз отмыл сорбенты фосфатным буфером. В сочетании со следами аммония буферный раствор оказался весьма питательным. И похоже, что не зря Силекс консервирует свои сорбенты азидом натрия. Теперь тоже буду всё консервировать.

Файл/ы:

скачать файл 091013_xy__________1.pdf
размер: 371.38к
кол-во скачиваний: 318


Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.10.2013 11:22     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

С протоколами Real-time дела не имел и даже не пытался в них вглядываться. Показалось всё очень запутанным, поэтому целиком доверился выводам испытателя (kblag). Кстати, это он разрешил выложить здесь протокол целиком, за что приношу ему свою искреннюю благодарность. beer.gif

Сейчас попытался вглядеться. Если ограничиться только рассмотрением результатов с bACT, то даже первая партия (0,8...0,9) выглядит вполне конкурентоспособно. Вторая там обозначена как 1,5...2,0. Кажется, выглядит тоже вполне достойно. Цифры в обозначении указывают на средний размер частиц магносорбента. rolleyes.gif

Сообщение было отредактировано genseq - 15.10.2013 11:52
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 15.10.2013 11:43     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

(genseq @ 15.10.2013 12:22)
Ссылка на исходное сообщение  С протоколами Real-time дела не имел и даже не пытался в них вглядываться. Показалось всё очень запутанным, поэтому целиком доверился выводам испытателя (kblag). Кстати, это он разрешил выложить здесь протокол целиком, за что приношу еме свою благодарность.

Сейчас попытался вглядеться. Если ограничиться только рассмотрением результатов с bACT, то даже первая партия (0,8...0,9) выглядит вполне конкурентоспособно. Вторая там обозначена как 1,5...2,0. Кажется, выглядит тоже вполне достойно. Цифры в обозначении указывают на средний размер частиц магносорбента.

Протокол явно "ДСП". smile.gif Чтобы разбираться, нужно знать "шриф-код" обозначений. Короче, без бутылки не разобраться. wink.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 15.10.2013 13:18     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

Реал-тайм это, конечно, хорошо, но в лаборатории должны быть еще и классические методы - необходимо смотреть в первую очередь как выглядит ДНК на агарозном форезе. Тем более что сорбенты имеют привычку рвать на кусочки высокомолекулярную ДНК, особенно если размер сорбента существенно меньше микрона.
Сомневаюсь что они успели так быстро зарасти в холодильнике. У тебя же есть Проклин, в нейтральных и кислых средах лучше не придумаешь. NaN3 тоже не помешает.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.10.2013 15:57     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

В зарастании я и сам сильно сомневаюсь. Скорее всего, мелкие частички после отстаивания хуже суспендируются. На ощупь магносорбенты не отличаются от глины. Если хорошенько не протрясти на вортексе, то могут остаться комочки, забивающие носики. Если причина в этом, то их проверку нельзя считать неудачной. Точнее - их проверка показала, что не следует делать силикатные сорбенты слишком мелкими (< 1 мкм).

Что касается результатов с сорбентами 1,5...2 мкм, то мне они кажутся вполне достойными. Попытался обобщить данные протокола испытаний. Не уверен, что сделал это правильно, но получил такую табличку значений Cq Mean (среднее количество циклов) для своего сорбента (1,5...2) и сорбентов сравнения (126 и 320). Различия незначительны и находятся в пределах статистической достоверности:
Cq_Mean.JPG - кликните, чтобы открыть увеличенную картинку

Сообщение было отредактировано genseq - 16.10.2013 08:32
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.10.2013 10:34     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

Кажется, проясняется механизм связывания ДНК/РНК с силикатами.
Нейтрально заряженные силанольные группы (Si-OH) образуют с отрицательно заряженными фосфатными группами (P-O) в кислой среде диэфирные связи (Si-0-P). Такие связи стабильны в кислой среде, но легко гиролизуются в щелочных условиях.

Интересно, что этот известный в неорганической химии факт почему-то никто не ассоциирует с механизмом сорбции ДНК/РНК силикатами. Или я это просто не нашёл?
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 16.10.2013 11:12     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

(genseq @ 16.10.2013 11:34)
Ссылка на исходное сообщение  Кажется, проясняется механизм связывания ДНК/РНК с силикатами.
Нейтрально заряженные силанольные группы (Si-OH) образуют с отрицательно заряженными фосфатными группами (P-O) в кислой среде диэфирные связи (Si-0-P). Такие связи стабильны в кислой среде, но легко гиролизуются в щелочных условиях.

Интересно, что этот известный в неорганической химии факт почему-то никто не ассоциирует с механизмом сорбции ДНК/РНК силикатами. Или я это просто не нашёл?

На самом деле механизм сорбции другой, где кроме рН среды не менее важную роль играет ионная сила.
А какова роль 5 М хаотропных агентов? Причем не все хаотропы годятся для этого! Ты не нашел, все давно расписано. smile.gif

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 16.10.2013 12:00
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.10.2013 18:53     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

(-Ъ- @ 16.10.2013 09:12)
Ссылка на исходное сообщение  На самом деле механизм сорбции другой, где кроме рН среды не менее важную роль играет ионная сила.
А какова роль 5 М хаотропных агентов? Причем не все хаотропы годятся для этого!  Ты не нашел, все давно расписано. smile.gif


Всё давно расписано:
1. Высокая ионная сила нейтрализует отталкивание ДНК/РНК отрицательно заряженной силикатной поверхностью.
2. Хаотропы к сорбции вообще отношения не имеют. Они лизируют вирусы и денатурируют белки, связанные с нуклеиновыми кислотами. Ещё они денатурируют ДНКазы и РНКазы.

Давно описаны методики выделения без хаотропов. Например:
картинка: Buffers.JPG

Файл/ы:

скачать файл Germany_2005.pdf
размер: 141.22к
кол-во скачиваний: 261


Участник оффлайн! T2006




 прочитанное сообщение 17.10.2013 08:22     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #33 множественное цитирование

(-Ъ- @ 15.10.2013 11:36)
Ссылка на исходное сообщение  Как бы ознакомиться с протоколом испытаний? Ведь магносорбенты из одного кита могут не работать с растворами кита другого производителя. Я такое наблюдал когда сравнивал "все своё" с промеговским магносорбентом.


Просто заменили маг. сорбенты из кита Промеги на другие различные. И если со своими "родными" растворами промеговские частицы заметно хуже работали, чем магносорбенты от Генсека и из Изогена - это тоже ведь о чем-то говорит?
Проблема возникает с нормированием по концентрации и размеру частиц разного производства - одни растворы частиц более концентрированные, др. менее, одни частицы крупнее, др. мельче. Пока брали так, чтобы частиц для сорбции было заведомо достаточно.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): -Ъ-
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 17.10.2013 11:24     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #34 множественное цитирование

(T2006 @ 17.10.2013 09:22)
Ссылка на исходное сообщение  Просто заменили маг. сорбенты из кита Промеги на другие различные. И если со своими "родными" растворами промеговские частицы заметно хуже работали, чем магносорбенты от Генсека и из Изогена - это тоже ведь о чем-то говорит?
Проблема возникает с нормированием по концентрации и размеру частиц разного производства - одни растворы частиц более концентрированные, др. менее, одни частицы крупнее, др. мельче. Пока брали так, чтобы  частиц для сорбции было заведомо достаточно.

Спасибо, очень ценная инфа. Я тоже сравнивал в свое время все доступные магносорбенты на своем ките, со своими растворами, доведенными "до ума" на нативной силике. При всем уважении к Промеге, их сорбент рвал ДНК на мелкие куски (ДНК фага Лямбда превращалась в шмерок) и выход был меньше 30%.

Очень мелкий сорбент , меньше микрона, оптимально использовать при выделении ДНК/РНК из плазмы, сыворотки или др., а более крупный, 2-10 мкм, - из образцов с избытком материала (кровь, гомогенаты тканей и т.п.).
Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и варьировать его количество в зависимости от природы иссл. образца (количества ДНК в образце).
Если возникнут вопросы при испытании - обращайтесь, можно в личку.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): T2006
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 17.10.2013 12:07     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #35 множественное цитирование

(genseq @ 16.10.2013 19:53)
Ссылка на исходное сообщение  Всё давно расписано:
1. Высокая ионная сила нейтрализует отталкивание ДНК/РНК отрицательно заряженной силикатной поверхностью.
2. Хаотропы к сорбции вообще отношения не имеют. Они лизируют вирусы и денатурируют белки, связанные с нуклеиновыми кислотами. Ещё они денатурируют ДНКазы и РНКазы.

Давно описаны методики выделения без хаотропов. Например:
картинка: Buffers.JPG

Генсек, мы с тобой сравниванием "мягкое" с "теплым" - посмотри какой
в статье рН - 4!!!! А я всегда работаю в нейтральной среде. Поэтому можешь дальше теоретизировать, но без меня. wink.gif - механизмы отличаются как земля и небо.
Кстати, статья так себе хоть и новая. Нет доверия авторам использующим Трис-ацетат буфер с рН = 4. Трис - буферы с рН меньше 7 это не буферы. tongue.gif

Еще добавлю - элюция ДНК с сорбента 10 мин при 80 оС - это "финиш", а использование Протеиназы К в современных китах для автоматизации процесса - тоже шаг не вперед. Так что думай, Чапай... smile.gif

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 17.10.2013 12:28
Участник оффлайн! arndt
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.10.2013 12:28     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #36 множественное цитирование

(-Ъ- @ 17.10.2013 12:24)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо, очень ценная инфа. Я тоже сравнивал в свое время все доступные магносорбенты на своем ките, со своими растворами, доведенными "до ума" на нативной силике. При всем уважении к Промеге, их сорбент рвал ДНК на мелкие куски (ДНК фага Лямбда превращалась в шмерок) и выход был меньше 30%.

Очень мелкий сорбент , меньше микрона, оптимально использовать при выделении ДНК/РНК из плазмы, сыворотки или др., а более крупный, 2-10 мкм, - из образцов с избытком материала (кровь, гомогенаты тканей и т.п.).
Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и варьировать его количество в зависимости от природы иссл. образца (количества ДНК в образце).
Если возникнут вопросы при испытании - обращайтесь, можно в личку.


Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и smile.gif

ПротеинА/Г магнитные шарики для ИП smile.gif

можно в такие вляпатся smile.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 17.10.2013 12:47     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #37 множественное цитирование

(arndt @ 17.10.2013 13:28)
Ссылка на исходное сообщение  Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и  smile.gif

ПротеинА/Г магнитные шарики для ИП smile.gif

можно в такие вляпатся smile.gif

Мне должно наверное присниться что это такое А/Г и ИП. confused.gif
Ты же любишь на каждый звук ссылку кидать! confused.gif Неисправим чел. no.gif
Участник оффлайн! comp3v
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 17.10.2013 12:51     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #38 множественное цитирование

это всего лишь Protein A/Protein G - для иммунопреципитации

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): -Ъ-
Участник оффлайн! arndt
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.10.2013 12:51     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #39 множественное цитирование

(-Ъ- @ 17.10.2013 13:47)
Ссылка на исходное сообщение  Мне должно наверное присниться что это такое А/Г и ИП. confused.gif
Ты же любишь на каждый звук ссылку кидать! confused.gif  Неисправим чел. no.gif

http://www.lifetechnologies.com/de/de/home...cipitation.html

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): -Ъ-
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 17.10.2013 13:40     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #40 множественное цитирование

Пока в этой теме речь не идет о SPRI-магношариках с -СООН группой. Ты вечно витаешь в облаках - мы пока говорим о сорбенте с Si-OH и выделении тотальной ДНК или РНК.
И причем тут это? http://www.lifetechnologies.com/de/de/home...cipitation.html
Мало ли на свете магносорбентов. confused.gif
Участник оффлайн! arndt
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.10.2013 15:17     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #41 множественное цитирование

(-Ъ- @ 17.10.2013 14:40)
Ссылка на исходное сообщение  Пока в этой теме речь не идет о СПРИ-магношариках с -СООН группой. Ты вечно витаешь в облаках - мы пока говорим о сорбенте с Си-ОХ и выделении тотальной ДНК или РНК.
И причем тут это? хттп://щщщ.лифетечнологиес.цом/де/де/хоме...ципитатион.хтмл
Мало ли на свете магносорбентов. confused.gif


сколко можно о стекляшках говорить smile.gif

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): R.J.Dio
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.10.2013 15:32     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #42 множественное цитирование

(-Ъ- @ 17.10.2013 10:07)
Ссылка на исходное сообщение  Генсек, мы с тобой сравниванием "мягкое" с "теплым" - посмотри какой
в статье рН - 4!!!! А я всегда работаю в нейтральной среде. Поэтому можешь дальше теоретизировать, но без меня. wink.gif - механизмы отличаются как земля и небо.
Кстати, статья так себе хоть и новая. Нет доверия авторам использующим Трис-ацетат буфер с рН = 4. Трис - буферы с рН меньше 7 это не буферы. tongue.gif

Еще добавлю - элюция ДНК с сорбента 10 мин при 80 оС - это "финиш", а использование Протеиназы К в современных китах для автоматизации процесса - тоже шаг не вперед. Так что думай, Чапай... smile.gif


Статья старенькая (2005 г.). Огрехов в ней много, но и изюминка имеется. Даже две. Первая - отсутствие хаотропов, причём не случайное, а вполне обоснованное. Вторая - низкий pH (4,0), что обеспечивает ингибирование РНКаз не хуже хаотропов. umnik.gif

Понятно, что Tris нужно заменить ацетатом, а дорогую протеиназу К дешёвыми аптечными таблетками ацидин-пепсина. shuffle.gif

В нейтральной среде (pH 7,0) сорбировать можно, но есть риск нарваться на плохое связывание при небольшом защелачивании: rolleyes.gif
картинка: pH.JPG

Так что думай, Чапай ... smile.gif

Сообщение было отредактировано genseq - 17.10.2013 15:35
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 17.10.2013 16:46     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #43 множественное цитирование

Ингибировать Нуклеазы, особенно РНК-азы, при рН 4, в присутствии сульфата аммония такой низкой конц.ции еще никому не удавалось. В RNA Later (это подкисленный сульфат аммония с высокой концентрацией, 60-ые годы) РНК-азы действительно инактивируются, но обратимо, т.е не денатурируют. Только Протеназа К или хаотропы.
А использование его, RNA Later, напрямую как связывающую ДНК с силикафильтром среду не увенчалось успехом.
Про аптечные реактивы вообще не серьезно говорить - неуважение к себе, пардон. В свое время, собрав кучу сериновых протеаз, пытался изобразить замену протеиназе К - фиг вам - лучше протеиназы К против нуклеаз нет НИЧЕГО. Но как она будет работать в кислой среде - это еще бАльшой вопрос.
Кстати, у меня кривая получается ровно наоборот. tongue.gif
Я при выделении ДНК полностью избавляюсь от гемоглобина и гепарина. И еще, в том же связывающем растворе очень легко солюбилизируется агароза, свернувшаяся кровь и мягкие ткани. Так что, дерзай, если не хочешь прислушаться к 20-летнему опыту совершенствования одного метода. smile.gif
Многие беды от избытка знаний. umnik.gif
Я недавно говорил - надо уметь фильтровать инфу из литературы. cool.gif

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 17.10.2013 16:56
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 17.10.2013 16:54     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #44 множественное цитирование

(arndt @ 17.10.2013 16:17)
Ссылка на исходное сообщение  сколко можно о стекляшках говорить smile.gif

Ну займи себя чем-нибудь confused.gif
Участник оффлайн! arndt
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.10.2013 17:13     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #45 множественное цитирование

(-Ъ- @ 17.10.2013 17:54)
Ссылка на исходное сообщение  Ну займи себя чем-нибудь confused.gif


магношарики имеют смысл когда робот - у меня генмол в основном простаивает -
пару раз включали smile.gif

а так - колонки Зимо или Квакаген smile.gif

http://www.biotechniques.com/multimedia/ar...tion_44229a.pdf
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 17.10.2013 17:33     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #46 множественное цитирование

(arndt @ 17.10.2013 18:13)
Ссылка на исходное сообщение  магношарики имеют смысл когда робот - у меня генмол в основном простаивает -
пару раз включали smile.gif

а так - колонки Зимо или Квакаген smile.gif

http://www.biotechniques.com/multimedia/ar...tion_44229a.pdf

(arndt @ 15.10.2013 17:56)
Ссылка на исходное сообщение  
на магносорбентах китах нет чистой ДНК - иногда на ТакМанах при 100 - 50 нанограмм нифига нет - потом разводиш до 1 нанограмм - все OK
у тебя термин "ингибировал" достаточно старомодный в реал-тайм ПЦР - если я развожу матрицу в 10 раз а у меня цикл скачет с 38 на 28 eek.gif
кабутто на твоих менше постав 10-кратные разведения против плазмиды и покажи народу

Заметьте, не я это предложил ©. no.gif (Покровские Ворота)
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  17.10.2013 23:33     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #47 множественное цитирование

http://www.nexttec.biz/

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): genseq
Участник оффлайн! arndt
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.10.2013 10:31     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #48 множественное цитирование

(avial @ 18.10.2013 00:33)


100 рублей на пробу smile.gif

http://www.biozym.com/desktopmodules/websh...aus%20Bakterien
Участник оффлайн! arndt
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.10.2013 12:00     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #49 множественное цитирование

(avial @ 18.10.2013 12:24)
Ссылка на исходное сообщение  Ну кто не хочет обращаться к разработчикам - тратит по 100 рублей на пробу. А вообще этот сорбент родом из ИБХ.


я уже заказал пробнички этих "чудо-колонок" - посмотрим на цена-качество smile.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.10.2013 15:54     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #50 множественное цитирование

Принцип метода тот же - сорбция на силике и последующие отмывки, но с использованием МАНИФОЛДа с вакуумом. Тот же микроколоночный метод с силикафильтрами и ничего нового. Если это не так и сорбент это особенный и родом и ИБХ - дайте ссылку, посмотрим что за новинка. Но я уверен, что это манифолдный вариант в комплекте с многоканальной (8) пипеткой - самый оптимальный для масштабирования пробоподготовки и не нужно покупать роботизированные станции. Дороговизна из-за манифолда с готовым сорбентом. Вот все. smile.gif
Это мы уже обсуждалы на этом форуме...

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 16.12.17 12:21
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft