Rambler's Top100
 		Lo-Fi Version* Virtual Russian keyboard  Russian  
Molbiol.ru | Project | Protocols | Programs | Literature
Web | Companies | Marketplace | Labor exchange
Today's active topics  [ Log In* | Register* ]  
   



Forum: 
 

Click to add to Selected Topics* Доморощенные магносорбенты -- Где можно использовать? --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Topic Curators:* genseq
Black list: inch5
     NB! members included in the Black list cannot be discussed in the topic
Options: I want to be curator* · Track this topic* · Email this topic · Print this topic*
Topic view:* Outline · [ Standard ] · Linear+

pages (5):  1 2 3 > »  
 Reply to this topicStart new topicStart Poll
User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 11.09.2013 20:11     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #1 multiquote
На днях наловчился получать магносорбенты. Пока сделал три варианта:
1. Силикатные.
2. Фосфатные.
3. Цинковые.
С первыми - силикатными - всё более или менее понятно. Нужны для выделения ДНК, и проверка их работоспособности - вопрос времени. А вот зачем могут понадобиться фосфатные? confused.gif Не исключено, что их можно использовать вместо фосфоцеллюлозы. Да и просто в качестве ионообменника.
Цинковые, похоже, нигде пока не используются, но они должны очень хорошо связывать и ДНК, и РНК, и все прочие низко- и высокомолекулярные фосфат-содержащие соединения. Возможно и гистидин-содержащие.

Буду признателен за любые предложения. Если предложения будут не теоретические, а практические (по их испытаниям), то берусь обеспечить и магносорбентами, и магнитными штативами:
http://molbiol.ru/forums/index.php?act=Att...=post&id=181131
User is offline! comp3v
Advanced Member
Москва
 old post 12.09.2013 07:49     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #2 multiquote
а для пришивания антител никакие из них не подходят? чтобы иммунопреципитацию делать
User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 12.09.2013 09:17     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #3 multiquote
(comp3v @ 12.09.2013 05:49)
Link to the original post  а для пришивания антител никакие из них не подходят? чтобы иммунопреципитацию делать


Хорошая идея! Фосфатные должны неплохо сшиваться с аминными группами карободимидом. Только для активации такой сшивки, в отличие от карбоксильных, используется не гидроксисукцинимид, а какая-то другая фиговинкаconfused.gif (забыл название). Связь P-N кислотолабильная, но в обычных условиях вполне стабильная.

This post has been edited by genseq: 13.09.2013 09:13
User is offline! comp3v
Advanced Member
Москва
 old post 12.09.2013 13:57     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #4 multiquote
в общем, если удастся такое сделать, было бы вполне востребовано.
Ещё вот, вариация на ту же тему - кобальтовые (Co2+ или Ni2+) магнитные бидсы для выделения His-меченых белков, как альтернатива TALON'у - это вот мы бы хоть прямщас купили.
User is offline! inview
 old post 12.09.2013 15:27     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #5 multiquote
(comp3v @ 12.09.2013 14:57)
Link to the original post  в общем, если удастся такое сделать, было бы вполне востребовано.
Ещё вот, вариация на ту же тему - кобальтовые (Co2+ или Ni2+) магнитные бидсы для выделения His-меченых белков, как альтернатива TALON'у - это вот мы бы хоть прямщас купили.
Тоже подумал про кобальтовые и никелевые сорбенты, но не для гистидиновых гибридов, а для выделения некоторых металл-связывающих белков из биожидкостей. Такое было бы интересно потестить. Цинк в этом смысле менее подходящ.
User is offline! comp3v
Advanced Member
Москва
 old post 12.09.2013 15:29     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #6 multiquote
(genseq @ 12.09.2013 15:42)
Link to the original post  Подозреваю, что His-тэги с цинком будут связываться не хуже, чем с никелем. Эти подозрения вселяют некоторые публикации. Например:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P.../BCA-02-125.pdf
хммм, вот тут не уверен. Всё-таки один факт наличия взаимодействия, показанного в статье, вовсе не означает, что это взаимодействие будет достаточно сильным для выделения белков. Да и неспроста, наверное, все производители делают только кобальтовые либо никелевые сорбенты.

Поэкспериментировать - можно попробовать, месяца через полтора планирую снова вернуться к выделениям His-меченых белков. Да, забыл сказать - у меня протокол выделения в денатурирующих условиях (6M гуанидин-хлорид) - выдержат ваши сорбенты такое?

This post has been edited by comp3v: 12.09.2013 15:31
User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 12.09.2013 16:01     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #7 multiquote
(comp3v @ 12.09.2013 13:29)
Link to the original post  хммм, вот тут не уверен. Всё-таки один факт наличия взаимодействия, показанного в статье, вовсе не означает, что это взаимодействие будет достаточно сильным для выделения белков. Да и неспроста, наверное, все производители делают только кобальтовые либо никелевые сорбенты.

Поэкспериментировать - можно попробовать, месяца через полтора планирую снова вернуться к выделениям His-меченых белков. Да, забыл сказать - у меня протокол выделения в денатурирующих условиях (6M гуанидин-хлорид) - выдержат ваши сорбенты такое?


Уговорили. Сделаю и никелевые. smile.gif
Сорбенты сферические, но сугубо неорганические. Теоретически гуанидин на них действовать не должен. rolleyes.gif
User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 12.09.2013 21:20     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #8 multiquote
Цинк связывает His6 лучше никеля в 20 раз!
http://peds.oxfordjournals.org/content/21/8/529.long

This post has been edited by genseq: 12.09.2013 21:41

Attached File(s)

Download attachment Fluorescence_imaging_of_His_tag_fused_proteins.pdf
Size:: 1.87mb
Number of downloads: 863

User is offline! comp3v
Advanced Member
Москва
 old post 13.09.2013 06:54     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #9 multiquote
ну, вот в этом обзоре по IMAC пишут, что с цинком тоже вполне себе работало, хотя и немного похуже чем с никелем - см. Fig. 27.9
guest: ммм
IP-stamp: frQlBxj4iQSg.
guest
 old post 13.09.2013 07:49     Report Post  Report Post for topic curator     
Quote Post Put in the news column  URL #10 multiquote
Если вы собираетесь использовать неорганическую матрицу для сорбции белков, моут быть проблемы, как с неспецифической сорбцией, так и с необратимой сорбцией на матрице.
User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 13.09.2013 07:50     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #11 multiquote
Судя по всему, Zn связывает His6 не хуже (или лучше) Ni, но последний, в отличии от первого, не реагирует на фосфаты (см. табл. 27.2 этого обзора) и на бета-меркаптоэтанол. А цинк, похоже, вяжется и с сульфгидрильными группами, и с нуклеотидами, и с РНК. Т.е. при недостатке сорбента они могут мешать связыванию His6-рекомбинантов и потребуется предварительная очистка. Хотя в обзоре Zn работал очень неплохо. Правда, они чистили белок, содержащий Zn-finger.

Zn_Ni.JPG - Attached Image (Click thumbnail to expand)

This post has been edited by genseq: 13.09.2013 08:01

Attached File(s)

Download attachment IMAC_Review.pdf
Size:: 1.33mb
Number of downloads: 38335

User is offline! avial
Advanced Member
 old post 13.09.2013 13:39     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #12 multiquote
А банальные силикатные на пробу поюзать можно для ДНК? Сейчас как раз играюсь с различными типами частиц.
User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 13.09.2013 17:37     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #13 multiquote
(avial @ 13.09.2013 11:39)
Link to the original post  А банальные силикатные на пробу поюзать можно для ДНК? Сейчас как раз играюсь с различными типами частиц.


Можно, но не сегодня. Препарат сможете забрать следующей неделе. Явки и пароли передам по E-mail.
User is offline! avial
Advanced Member
 old post 13.09.2013 23:48     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #14 multiquote
Спасибо!

В процессе игр выяснил, что в отмывочном буфере Силекса явно содержится что-то типа эфира (по запаху) - а для чего?
User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 14.09.2013 08:01     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #15 multiquote
(avial @ 13.09.2013 21:48)
Link to the original post  Спасибо!

В процессе игр выяснил, что в отмывочном буфере Силекса явно содержится что-то типа эфира (по запаху) - а для чего?


Не знаю как у Силекса, но за бугром "отмывочный буфер" - это, как правило, 70% этанол. Вместо этанола можно использовать изопропанол (ИПС), который я покупаю в лакокрасочном отделе хозяйственного магазина и использую вместо этанола на стадии силиконизации магносорбентов. Правда, сейчас ИПС завозить перестали и пришлось перейти на ацетон. Кстати, об ацетоне. Можно попытаться заменить им спирт в отмывочном буфере. shuffle.gif

This post has been edited by genseq: 14.09.2013 08:06
User is offline! avial
Advanced Member
 old post 14.09.2013 23:52     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #16 multiquote
С этанолом никогда нельзя убрать носиком полностью последнюю каплю жидкости со дна пробирки, а с буфером Силекса пробирка остается почти сухой - подозреваю, что эфир там именно для этого, поверхностное натяжение менять.
Но в составе ничего такого нет, обманывают?
User is offline! T2006
 old post 23.09.2013 12:06     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #17 multiquote
(genseq @ 11.09.2013 21:11)
Link to the original post  
Буду признателен за любые предложения. Если предложения будут не теоретические, а практические (по их испытаниям), то берусь обеспечить и магносорбентами, и магнитными штативами:
http://molbiol.ru/forums/index.php?act=Att...=post&id=181131[/url]


Genseq, нас интересуют магносорбенты на пробу, беремся их проверить )))
Как с Вами связаться?
User is offline! -Ъ-
Advanced Member
Москва
 old post 23.09.2013 15:42     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message
Quote Post Put in the news column  URL #18 multiquote
Генсек мне давал на испытание (то бишь сравнить с моими магносорбентом и нат. силикой), а мне все некогда frown.gif . Приходите, отолью, если, конечно, Генсек не возражает. smile.gif
Баба с возу - потехе час. rolleyes.gif

This post has been edited by -Ъ-: 23.09.2013 15:54
User is offline! kblag
Advanced Member
 old post 26.09.2013 08:05     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #19 multiquote
Я бы тоже хотел попробовать.
Ещё есть возможность?
User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 02.10.2013 08:37     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #20 multiquote
Пузырёк, отправленный обычной посылкой в Новосибирск, застрял в Москве. Наверное, не понравился рентгеновскому аппарату. frown.gif
А вот отправленные одновременно с ним магнитные штативы на Казанском вокзале отметились 25 сентября и должны быть уже где-то на подходе к Новосибирску. beer.gif

Появилась идея магносорбенты рассылать в письмах - в пакетиках, содержащих по 1...2 г. сухого порошка, похожего на обычную глину. Интересно, письма рентгеном проверяют? confused.gif

This post has been edited by genseq: 10.10.2013 17:50
User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 10.10.2013 17:49     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #21 multiquote
Первая проверка силикатных сорбентов прошла успешно. Превосходят магносорбенты Промеги и Силекса. jump.gif Не уступают ИзоГеновским. beer.gif
Guest
IP-stamp: fr45uHVgO7WZ2
guest
 old post 11.10.2013 08:24     Report Post  Report Post for topic curator     
Quote Post Put in the news column  URL #22 multiquote
(genseq @ 10.10.2013 17:49)
Link to the original post  Первая проверка силикатных сорбентов прошла успешно. Превосходят магносорбенты Промеги и Силекса.  jump.gif Не уступают ИзоГеновским. beer.gif


ну и сколко ДНКа из 30 миклов кровушки ? smile.gif

http://www.lifetechnologies.com/us/en/home...-universal.html
User is offline! -Ъ-
Advanced Member
Москва
 old post 15.10.2013 10:36     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message
Quote Post Put in the news column  URL #23 multiquote
(genseq @ 10.10.2013 18:49)
Link to the original post  Первая проверка силикатных сорбентов прошла успешно. Превосходят магносорбенты Промеги и Силекса.  jump.gif Не уступают ИзоГеновским. beer.gif

Как бы ознакомиться с протоколом испытаний? Ведь магносорбенты из одного кита могут не работать с растворами кита другого производителя. Я такое наблюдал когда сравнивал "все своё" с промеговским магносорбентом.
User is offline! -Ъ-
Advanced Member
Москва
 old post 15.10.2013 10:41     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message
Quote Post Put in the news column  URL #24 multiquote
(Guest @ 11.10.2013 09:24)
Link to the original post  ну и сколко ДНКа из 30 миклов кровушки ? smile.gif

http://www.lifetechnologies.com/us/en/home...-universal.html

Потери - не более 20%, многое зависит от состояния "кровушки".
В этой ссылке не совсем аналог, того что делает Генсек.
User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 15.10.2013 10:59     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #25 multiquote
Вторые испытания с той же партией сорбентов провалились. Похоже, из-за зарастания какой-то микрофлорой. Сорбент норовил закупорить носик пипетки, да ещё и ингибировал ПЦР. Правда, в них участвовала ещё одна партия, приготовленная позднее. С ней всё прошло отлично.

Похоже, зря я в этот раз отмыл сорбенты фосфатным буфером. В сочетании со следами аммония буферный раствор оказался весьма питательным. И похоже, что не зря Силекс консервирует свои сорбенты азидом натрия. Теперь тоже буду всё консервировать.

Attached File(s)

Download attachment 091013_xy__________1.pdf
Size:: 371.38k
Number of downloads: 841

User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 15.10.2013 11:22     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #26 multiquote
С протоколами Real-time дела не имел и даже не пытался в них вглядываться. Показалось всё очень запутанным, поэтому целиком доверился выводам испытателя (kblag). Кстати, это он разрешил выложить здесь протокол целиком, за что приношу ему свою искреннюю благодарность. beer.gif

Сейчас попытался вглядеться. Если ограничиться только рассмотрением результатов с bACT, то даже первая партия (0,8...0,9) выглядит вполне конкурентоспособно. Вторая там обозначена как 1,5...2,0. Кажется, выглядит тоже вполне достойно. Цифры в обозначении указывают на средний размер частиц магносорбента. rolleyes.gif

This post has been edited by genseq: 15.10.2013 11:52
User is offline! -Ъ-
Advanced Member
Москва
 old post 15.10.2013 11:43     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message
Quote Post Put in the news column  URL #27 multiquote
(genseq @ 15.10.2013 12:22)
Link to the original post  С протоколами Real-time дела не имел и даже не пытался в них вглядываться. Показалось всё очень запутанным, поэтому целиком доверился выводам испытателя (kblag). Кстати, это он разрешил выложить здесь протокол целиком, за что приношу еме свою благодарность.

Сейчас попытался вглядеться. Если ограничиться только рассмотрением результатов с bACT, то даже первая партия (0,8...0,9) выглядит вполне конкурентоспособно. Вторая там обозначена как 1,5...2,0. Кажется, выглядит тоже вполне достойно. Цифры в обозначении указывают на средний размер частиц магносорбента.

Протокол явно "ДСП". smile.gif Чтобы разбираться, нужно знать "шриф-код" обозначений. Короче, без бутылки не разобраться. wink.gif
User is offline! -Ъ-
Advanced Member
Москва
 old post 15.10.2013 13:18     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message
Quote Post Put in the news column  URL #28 multiquote
Реал-тайм это, конечно, хорошо, но в лаборатории должны быть еще и классические методы - необходимо смотреть в первую очередь как выглядит ДНК на агарозном форезе. Тем более что сорбенты имеют привычку рвать на кусочки высокомолекулярную ДНК, особенно если размер сорбента существенно меньше микрона.
Сомневаюсь что они успели так быстро зарасти в холодильнике. У тебя же есть Проклин, в нейтральных и кислых средах лучше не придумаешь. NaN3 тоже не помешает.
User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 15.10.2013 15:57     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #29 multiquote
В зарастании я и сам сильно сомневаюсь. Скорее всего, мелкие частички после отстаивания хуже суспендируются. На ощупь магносорбенты не отличаются от глины. Если хорошенько не протрясти на вортексе, то могут остаться комочки, забивающие носики. Если причина в этом, то их проверку нельзя считать неудачной. Точнее - их проверка показала, что не следует делать силикатные сорбенты слишком мелкими (< 1 мкм).

Что касается результатов с сорбентами 1,5...2 мкм, то мне они кажутся вполне достойными. Попытался обобщить данные протокола испытаний. Не уверен, что сделал это правильно, но получил такую табличку значений Cq Mean (среднее количество циклов) для своего сорбента (1,5...2) и сорбентов сравнения (126 и 320). Различия незначительны и находятся в пределах статистической достоверности:
Cq_Mean.JPG - Attached Image (Click thumbnail to expand)

This post has been edited by genseq: 16.10.2013 08:32
User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 16.10.2013 10:34     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #30 multiquote
Кажется, проясняется механизм связывания ДНК/РНК с силикатами.
Нейтрально заряженные силанольные группы (Si-OH) образуют с отрицательно заряженными фосфатными группами (P-O) в кислой среде диэфирные связи (Si-0-P). Такие связи стабильны в кислой среде, но легко гиролизуются в щелочных условиях.

Интересно, что этот известный в неорганической химии факт почему-то никто не ассоциирует с механизмом сорбции ДНК/РНК силикатами. Или я это просто не нашёл?
User is offline! -Ъ-
Advanced Member
Москва
 old post 16.10.2013 11:12     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message
Quote Post Put in the news column  URL #31 multiquote
(genseq @ 16.10.2013 11:34)
Link to the original post  Кажется, проясняется механизм связывания ДНК/РНК с силикатами.
Нейтрально заряженные силанольные группы (Si-OH) образуют с отрицательно заряженными фосфатными группами (P-O) в кислой среде диэфирные связи (Si-0-P). Такие связи стабильны в кислой среде, но легко гиролизуются в щелочных условиях.

Интересно, что этот известный в неорганической химии факт почему-то никто не ассоциирует с механизмом сорбции ДНК/РНК силикатами. Или я это просто не нашёл?

На самом деле механизм сорбции другой, где кроме рН среды не менее важную роль играет ионная сила.
А какова роль 5 М хаотропных агентов? Причем не все хаотропы годятся для этого! Ты не нашел, все давно расписано. smile.gif

This post has been edited by -Ъ-: 16.10.2013 12:00
User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 16.10.2013 18:53     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #32 multiquote
(-Ъ- @ 16.10.2013 09:12)
Link to the original post  На самом деле механизм сорбции другой, где кроме рН среды не менее важную роль играет ионная сила.
А какова роль 5 М хаотропных агентов? Причем не все хаотропы годятся для этого!  Ты не нашел, все давно расписано. smile.gif


Всё давно расписано:
1. Высокая ионная сила нейтрализует отталкивание ДНК/РНК отрицательно заряженной силикатной поверхностью.
2. Хаотропы к сорбции вообще отношения не имеют. Они лизируют вирусы и денатурируют белки, связанные с нуклеиновыми кислотами. Ещё они денатурируют ДНКазы и РНКазы.

Давно описаны методики выделения без хаотропов. Например:
Attached ImageBuffers.JPG

Attached File(s)

Download attachment Germany_2005.pdf
Size:: 141.22k
Number of downloads: 804

User is offline! T2006
 old post 17.10.2013 08:22     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #33 multiquote
(-Ъ- @ 15.10.2013 11:36)
Link to the original post  Как бы ознакомиться с протоколом испытаний? Ведь магносорбенты из одного кита могут не работать с растворами кита другого производителя. Я такое наблюдал когда сравнивал "все своё" с промеговским магносорбентом.


Просто заменили маг. сорбенты из кита Промеги на другие различные. И если со своими "родными" растворами промеговские частицы заметно хуже работали, чем магносорбенты от Генсека и из Изогена - это тоже ведь о чем-то говорит?
Проблема возникает с нормированием по концентрации и размеру частиц разного производства - одни растворы частиц более концентрированные, др. менее, одни частицы крупнее, др. мельче. Пока брали так, чтобы частиц для сорбции было заведомо достаточно.
Number of thanks: 1These members thanked the author (1): -Ъ-
User is offline! -Ъ-
Advanced Member
Москва
 old post 17.10.2013 11:24     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message
Quote Post Put in the news column  URL #34 multiquote
(T2006 @ 17.10.2013 09:22)
Link to the original post  Просто заменили маг. сорбенты из кита Промеги на другие различные. И если со своими "родными" растворами промеговские частицы заметно хуже работали, чем магносорбенты от Генсека и из Изогена - это тоже ведь о чем-то говорит?
Проблема возникает с нормированием по концентрации и размеру частиц разного производства - одни растворы частиц более концентрированные, др. менее, одни частицы крупнее, др. мельче. Пока брали так, чтобы  частиц для сорбции было заведомо достаточно.

Спасибо, очень ценная инфа. Я тоже сравнивал в свое время все доступные магносорбенты на своем ките, со своими растворами, доведенными "до ума" на нативной силике. При всем уважении к Промеге, их сорбент рвал ДНК на мелкие куски (ДНК фага Лямбда превращалась в шмерок) и выход был меньше 30%.

Очень мелкий сорбент , меньше микрона, оптимально использовать при выделении ДНК/РНК из плазмы, сыворотки или др., а более крупный, 2-10 мкм, - из образцов с избытком материала (кровь, гомогенаты тканей и т.п.).
Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и варьировать его количество в зависимости от природы иссл. образца (количества ДНК в образце).
Если возникнут вопросы при испытании - обращайтесь, можно в личку.
Number of thanks: 1These members thanked the author (1): T2006
User is offline! -Ъ-
Advanced Member
Москва
 old post 17.10.2013 12:07     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message
Quote Post Put in the news column  URL #35 multiquote
(genseq @ 16.10.2013 19:53)
Link to the original post  Всё давно расписано:
1. Высокая ионная сила нейтрализует отталкивание ДНК/РНК отрицательно заряженной силикатной поверхностью.
2. Хаотропы к сорбции вообще отношения не имеют. Они лизируют вирусы и денатурируют белки, связанные с нуклеиновыми кислотами. Ещё они денатурируют ДНКазы и РНКазы.

Давно описаны методики выделения без хаотропов. Например:
Attached ImageBuffers.JPG

Генсек, мы с тобой сравниванием "мягкое" с "теплым" - посмотри какой
в статье рН - 4!!!! А я всегда работаю в нейтральной среде. Поэтому можешь дальше теоретизировать, но без меня. wink.gif - механизмы отличаются как земля и небо.
Кстати, статья так себе хоть и новая. Нет доверия авторам использующим Трис-ацетат буфер с рН = 4. Трис - буферы с рН меньше 7 это не буферы. tongue.gif

Еще добавлю - элюция ДНК с сорбента 10 мин при 80 оС - это "финиш", а использование Протеиназы К в современных китах для автоматизации процесса - тоже шаг не вперед. Так что думай, Чапай... smile.gif

This post has been edited by -Ъ-: 17.10.2013 12:28
User is offline! arndt
Advanced Member
 old post 17.10.2013 12:28     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #36 multiquote
(-Ъ- @ 17.10.2013 12:24)
Link to the original post  Спасибо, очень ценная инфа. Я тоже сравнивал в свое время все доступные магносорбенты на своем ките, со своими растворами, доведенными "до ума" на нативной силике. При всем уважении к Промеге, их сорбент рвал ДНК на мелкие куски (ДНК фага Лямбда превращалась в шмерок) и выход был меньше 30%.

Очень мелкий сорбент , меньше микрона, оптимально использовать при выделении ДНК/РНК из плазмы, сыворотки или др., а более крупный, 2-10 мкм, - из образцов с избытком материала (кровь, гомогенаты тканей и т.п.).
Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и варьировать его количество в зависимости от природы иссл. образца (количества ДНК в образце).
Если возникнут вопросы при испытании - обращайтесь, можно в личку.


Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и smile.gif

ПротеинА/Г магнитные шарики для ИП smile.gif

можно в такие вляпатся smile.gif
User is offline! -Ъ-
Advanced Member
Москва
 old post 17.10.2013 12:47     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message
Quote Post Put in the news column  URL #37 multiquote
(arndt @ 17.10.2013 13:28)
Link to the original post  Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и  smile.gif

ПротеинА/Г магнитные шарики для ИП smile.gif

можно в такие вляпатся smile.gif

Мне должно наверное присниться что это такое А/Г и ИП. confused.gif
Ты же любишь на каждый звук ссылку кидать! confused.gif Неисправим чел. no.gif
User is offline! comp3v
Advanced Member
Москва
 old post 17.10.2013 12:51     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #38 multiquote
это всего лишь Protein A/Protein G - для иммунопреципитации
Number of thanks: 1These members thanked the author (1): -Ъ-
User is offline! arndt
Advanced Member
 old post 17.10.2013 12:51     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #39 multiquote
(-Ъ- @ 17.10.2013 13:47)
Link to the original post  Мне должно наверное присниться что это такое А/Г и ИП. confused.gif
Ты же любишь на каждый звук ссылку кидать! confused.gif  Неисправим чел. no.gif

http://www.lifetechnologies.com/de/de/home...cipitation.html
Number of thanks: 1These members thanked the author (1): -Ъ-
User is offline! -Ъ-
Advanced Member
Москва
 old post 17.10.2013 13:40     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message
Quote Post Put in the news column  URL #40 multiquote
Пока в этой теме речь не идет о SPRI-магношариках с -СООН группой. Ты вечно витаешь в облаках - мы пока говорим о сорбенте с Si-OH и выделении тотальной ДНК или РНК.
И причем тут это? http://www.lifetechnologies.com/de/de/home...cipitation.html
Мало ли на свете магносорбентов. confused.gif
User is offline! arndt
Advanced Member
 old post 17.10.2013 15:17     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #41 multiquote
(-Ъ- @ 17.10.2013 14:40)
Link to the original post  Пока в этой теме речь не идет о СПРИ-магношариках с -СООН группой. Ты вечно витаешь в облаках - мы пока говорим о сорбенте с Си-ОХ и выделении тотальной ДНК или РНК.
И причем тут это? хттп://щщщ.лифетечнологиес.цом/де/де/хоме...ципитатион.хтмл
Мало ли на свете магносорбентов. confused.gif


сколко можно о стекляшках говорить smile.gif
Number of thanks: 1These members thanked the author (1): R.J.Dio
User is offline! genseq
Advanced Member
 old post 17.10.2013 15:32     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail  Web site
Quote Post Put in the news column  URL #42 multiquote
(-Ъ- @ 17.10.2013 10:07)
Link to the original post  Генсек, мы с тобой сравниванием "мягкое" с "теплым" - посмотри какой
в статье рН - 4!!!! А я всегда работаю в нейтральной среде. Поэтому можешь дальше теоретизировать, но без меня. wink.gif - механизмы отличаются как земля и небо.
Кстати, статья так себе хоть и новая. Нет доверия авторам использующим Трис-ацетат буфер с рН = 4. Трис - буферы с рН меньше 7 это не буферы. tongue.gif

Еще добавлю - элюция ДНК с сорбента 10 мин при 80 оС - это "финиш", а использование Протеиназы К в современных китах для автоматизации процесса - тоже шаг не вперед. Так что думай, Чапай... smile.gif


Статья старенькая (2005 г.). Огрехов в ней много, но и изюминка имеется. Даже две. Первая - отсутствие хаотропов, причём не случайное, а вполне обоснованное. Вторая - низкий pH (4,0), что обеспечивает ингибирование РНКаз не хуже хаотропов. umnik.gif

Понятно, что Tris нужно заменить ацетатом, а дорогую протеиназу К дешёвыми аптечными таблетками ацидин-пепсина. shuffle.gif

В нейтральной среде (pH 7,0) сорбировать можно, но есть риск нарваться на плохое связывание при небольшом защелачивании: rolleyes.gif
Attached ImagepH.JPG

Так что думай, Чапай ... smile.gif

This post has been edited by genseq: 17.10.2013 15:35
User is offline! -Ъ-
Advanced Member
Москва
 old post 17.10.2013 16:46     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message
Quote Post Put in the news column  URL #43 multiquote
Ингибировать Нуклеазы, особенно РНК-азы, при рН 4, в присутствии сульфата аммония такой низкой конц.ции еще никому не удавалось. В RNA Later (это подкисленный сульфат аммония с высокой концентрацией, 60-ые годы) РНК-азы действительно инактивируются, но обратимо, т.е не денатурируют. Только Протеназа К или хаотропы.
А использование его, RNA Later, напрямую как связывающую ДНК с силикафильтром среду не увенчалось успехом.
Про аптечные реактивы вообще не серьезно говорить - неуважение к себе, пардон. В свое время, собрав кучу сериновых протеаз, пытался изобразить замену протеиназе К - фиг вам - лучше протеиназы К против нуклеаз нет НИЧЕГО. Но как она будет работать в кислой среде - это еще бАльшой вопрос.
Кстати, у меня кривая получается ровно наоборот. tongue.gif
Я при выделении ДНК полностью избавляюсь от гемоглобина и гепарина. И еще, в том же связывающем растворе очень легко солюбилизируется агароза, свернувшаяся кровь и мягкие ткани. Так что, дерзай, если не хочешь прислушаться к 20-летнему опыту совершенствования одного метода. smile.gif
Многие беды от избытка знаний. umnik.gif
Я недавно говорил - надо уметь фильтровать инфу из литературы. cool.gif

This post has been edited by -Ъ-: 17.10.2013 16:56
User is offline! -Ъ-
Advanced Member
Москва
 old post 17.10.2013 16:54     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message
Quote Post Put in the news column  URL #44 multiquote
(arndt @ 17.10.2013 16:17)
Link to the original post  сколко можно о стекляшках говорить smile.gif

Ну займи себя чем-нибудь confused.gif
User is offline! arndt
Advanced Member
 old post 17.10.2013 17:13     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #45 multiquote
(-Ъ- @ 17.10.2013 17:54)
Link to the original post  Ну займи себя чем-нибудь confused.gif


магношарики имеют смысл когда робот - у меня генмол в основном простаивает -
пару раз включали smile.gif

а так - колонки Зимо или Квакаген smile.gif

http://www.biotechniques.com/multimedia/ar...tion_44229a.pdf
User is offline! -Ъ-
Advanced Member
Москва
 old post 17.10.2013 17:33     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message
Quote Post Put in the news column  URL #46 multiquote
(arndt @ 17.10.2013 18:13)
Link to the original post  магношарики имеют смысл когда робот - у меня генмол в основном простаивает -
пару раз включали smile.gif

а так - колонки Зимо или Квакаген smile.gif

http://www.biotechniques.com/multimedia/ar...tion_44229a.pdf

(arndt @ 15.10.2013 17:56)
Link to the original post  
на магносорбентах китах нет чистой ДНК - иногда на ТакМанах при 100 - 50 нанограмм нифига нет - потом разводиш до 1 нанограмм - все OK
у тебя термин "ингибировал" достаточно старомодный в реал-тайм ПЦР - если я развожу матрицу в 10 раз а у меня цикл скачет с 38 на 28 eek.gif
кабутто на твоих менше постав 10-кратные разведения против плазмиды и покажи народу

Заметьте, не я это предложил ©. no.gif (Покровские Ворота)
User is offline! avial
Advanced Member
 old post Post on English  17.10.2013 23:33     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #47 multiquote
http://www.nexttec.biz/
Number of thanks: 1These members thanked the author (1): genseq
User is offline! arndt
Advanced Member
 old post 18.10.2013 10:31     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #48 multiquote
(avial @ 18.10.2013 00:33)
Link to the original post  хттп://щщщ.нехттец.биз/


100 рублей на пробу smile.gif

http://www.biozym.com/desktopmodules/websh...aus%20Bakterien
User is offline! arndt
Advanced Member
 old post 18.10.2013 12:00     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message  Send an e-mail
Quote Post Put in the news column  URL #49 multiquote
(avial @ 18.10.2013 12:24)
Link to the original post  Ну кто не хочет обращаться к разработчикам - тратит по 100 рублей на пробу. А вообще этот сорбент родом из ИБХ.


я уже заказал пробнички этих "чудо-колонок" - посмотрим на цена-качество smile.gif
User is offline! -Ъ-
Advanced Member
Москва
 old post 18.10.2013 15:54     Report Post  Report Post for topic curator       Personal message
Quote Post Put in the news column  URL #50 multiquote
Принцип метода тот же - сорбция на силике и последующие отмывки, но с использованием МАНИФОЛДа с вакуумом. Тот же микроколоночный метод с силикафильтрами и ничего нового. Если это не так и сорбент это особенный и родом и ИБХ - дайте ссылку, посмотрим что за новинка. Но я уверен, что это манифолдный вариант в комплекте с многоканальной (8) пипеткой - самый оптимальный для масштабирования пробоподготовки и не нужно покупать роботизированные станции. Дороговизна из-за манифолда с готовым сорбентом. Вот все. smile.gif
Это мы уже обсуждалы на этом форуме...

*
Name:

 Enable Smilies · Show Smilies Pop Up Window 		Icons designation:
   Say THANKS to the author — say THANKS to the author
   Delete Post — delete
   Edit Post — edit
   Put in the news column — put in the news column
   Quote Post — quote the post
   multiquote not included/multiquote included — quote several posts
   Report SPAM — mark spam message
   Report Post — report post to the moderator
   User is online!/User is offline! — author online/offline
   Photo — photo of the author

   - other designations -  
   *
« Next Oldest · Molecular and cellular biology · Next Newest »
pages (5):  1 2 3 > » 
 Fast ReplyReply to this topicStart new topic

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Helicon · Dia-m · InterLabService · Beckman Coulter · SkyGen · OPTEC · BIOCAD · Evrogen · Syntol · Bioline · Sartorius · Khimexpert · SibEnzyme · Tecan · Danies · NPP «TRIS» · Bialexa · FizLabPribor · Genotek · ATG Service Gene · Biogen-Analitika
Your forum  ·  editor@zbio.net  ·  Time is now: 21.09.24 05:38
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024  IPS, Inc.