![]() | ![]() ![]() |
Molbiol.ru | Project | Protocols | Programs | Literature Web | Companies | Marketplace | Labor exchange Today's active topics [ Log In* | Register* ] Forum: | |
![]() ![]() ![]() |
![]() Advanced Member ![]() |
1. Силикатные. 2. Фосфатные. 3. Цинковые. С первыми - силикатными - всё более или менее понятно. Нужны для выделения ДНК, и проверка их работоспособности - вопрос времени. А вот зачем могут понадобиться фосфатные? ![]() Цинковые, похоже, нигде пока не используются, но они должны очень хорошо связывать и ДНК, и РНК, и все прочие низко- и высокомолекулярные фосфат-содержащие соединения. Возможно и гистидин-содержащие. Буду признателен за любые предложения. Если предложения будут не теоретические, а практические (по их испытаниям), то берусь обеспечить и магносорбентами, и магнитными штативами: |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
|
![]() Advanced Member ![]() |
(comp3v @ 12.09.2013 05:49) Хорошая идея! Фосфатные должны неплохо сшиваться с аминными группами карободимидом. Только для активации такой сшивки, в отличие от карбоксильных, используется не гидроксисукцинимид, а какая-то другая фиговинка ![]() This post has been edited by genseq: 13.09.2013 09:13 |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
Ещё вот, вариация на ту же тему - кобальтовые (Co2+ или Ni2+) магнитные бидсы для выделения His-меченых белков, как альтернатива |
![]() ![]() |
(comp3v @ 12.09.2013 14:57) ![]() Ещё вот, вариация на ту же тему - кобальтовые (Co2+ или Ni2+) магнитные бидсы для выделения His-меченых белков, как альтернатива |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
(genseq @ 12.09.2013 15:42) ![]() Поэкспериментировать - можно попробовать, месяца через полтора планирую снова вернуться к выделениям His-меченых белков. Да, забыл сказать - у меня протокол выделения в денатурирующих условиях (6M гуанидин-хлорид) - выдержат ваши сорбенты такое? This post has been edited by comp3v: 12.09.2013 15:31 |
![]() Advanced Member ![]() |
(comp3v @ 12.09.2013 13:29) ![]() Поэкспериментировать - можно попробовать, месяца через полтора планирую снова вернуться к выделениям His-меченых белков. Да, забыл сказать - у меня протокол выделения в денатурирующих условиях (6M гуанидин-хлорид) - выдержат ваши сорбенты такое? Уговорили. Сделаю и никелевые. ![]() Сорбенты сферические, но сугубо неорганические. Теоретически гуанидин на них действовать не должен. ![]() |
![]() Advanced Member ![]() |
This post has been edited by genseq: 12.09.2013 21:41 Attached File(s)
|
![]() Advanced Member Москва ![]() |
|
guest: ммм IP-stamp: frQlBxj4iQSg. guest ![]() |
|
![]() Advanced Member ![]() |
![]() This post has been edited by genseq: 13.09.2013 08:01 Attached File(s)
|
![]() Advanced Member ![]() |
|
![]() Advanced Member ![]() |
(avial @ 13.09.2013 11:39) ![]() Можно, но не сегодня. Препарат сможете забрать следующей неделе. Явки и пароли передам по E-mail. |
![]() Advanced Member ![]() |
В процессе игр выяснил, что в отмывочном буфере Силекса явно содержится что-то типа эфира (по запаху) - а для чего? |
![]() Advanced Member ![]() |
(avial @ 13.09.2013 21:48) ![]() В процессе игр выяснил, что в отмывочном буфере Силекса явно содержится что-то типа эфира (по запаху) - а для чего? Не знаю как у Силекса, но за бугром "отмывочный буфер" - это, как правило, 70% этанол. Вместо этанола можно использовать изопропанол (ИПС), который я покупаю в лакокрасочном отделе хозяйственного магазина и использую вместо этанола на стадии силиконизации магносорбентов. Правда, сейчас ИПС завозить перестали и пришлось перейти на ацетон. Кстати, об ацетоне. Можно попытаться заменить им спирт в отмывочном буфере. ![]() This post has been edited by genseq: 14.09.2013 08:06 |
![]() Advanced Member ![]() |
Но в составе ничего такого нет, обманывают? |
![]() ![]() |
(genseq @ 11.09.2013 21:11) ![]() Буду признателен за любые предложения. Если предложения будут не теоретические, а практические (по их испытаниям), то берусь обеспечить и магносорбентами, и магнитными штативами: Genseq, нас интересуют магносорбенты на пробу, беремся их проверить ))) Как с Вами связаться? |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
![]() ![]() Баба с возу - потехе час. ![]() This post has been edited by -Ъ-: 23.09.2013 15:54 |
![]() Advanced Member ![]() |
Ещё есть возможность? |
![]() Advanced Member ![]() |
![]() А вот отправленные одновременно с ним магнитные штативы на Казанском вокзале отметились 25 сентября и должны быть уже где-то на подходе к Новосибирску. ![]() Появилась идея магносорбенты рассылать в письмах - в пакетиках, содержащих по 1...2 г. сухого порошка, похожего на обычную глину. Интересно, письма рентгеном проверяют? ![]() This post has been edited by genseq: 10.10.2013 17:50 |
![]() Advanced Member ![]() |
![]() ![]() |
Guest IP-stamp: fr45uHVgO7WZ2 guest ![]() |
(genseq @ 10.10.2013 17:49) ![]() ![]() ![]() ну и сколко ДНКа из 30 миклов кровушки ? ![]() |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
(genseq @ 10.10.2013 18:49) ![]() ![]() ![]() Как бы ознакомиться с протоколом испытаний? Ведь магносорбенты из одного кита могут не работать с растворами кита другого производителя. Я такое наблюдал когда сравнивал "все своё" с промеговским магносорбентом. |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
(Guest @ 11.10.2013 09:24) ![]() ![]() Потери - не более 20%, многое зависит от состояния "кровушки". В этой ссылке не совсем аналог, того что делает Генсек. |
![]() Advanced Member ![]() |
Похоже, зря я в этот раз отмыл сорбенты фосфатным буфером. В сочетании со следами аммония буферный раствор оказался весьма питательным. И похоже, что не зря Силекс консервирует свои сорбенты азидом натрия. Теперь тоже буду всё консервировать. Attached File(s)
|
![]() Advanced Member ![]() |
![]() Сейчас попытался вглядеться. Если ограничиться только рассмотрением результатов с bACT, то даже первая партия (0,8...0,9) выглядит вполне конкурентоспособно. Вторая там обозначена как 1,5...2,0. Кажется, выглядит тоже вполне достойно. Цифры в обозначении указывают на средний размер частиц магносорбента. ![]() This post has been edited by genseq: 15.10.2013 11:52 |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
(genseq @ 15.10.2013 12:22) ![]() Сейчас попытался вглядеться. Если ограничиться только рассмотрением результатов с bACT, то даже первая партия (0,8...0,9) выглядит вполне конкурентоспособно. Вторая там обозначена как 1,5...2,0. Кажется, выглядит тоже вполне достойно. Цифры в обозначении указывают на средний размер частиц магносорбента. Протокол явно "ДСП". ![]() ![]() |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
Сомневаюсь что они успели так быстро зарасти в холодильнике. У тебя же есть Проклин, в нейтральных и кислых средах лучше не придумаешь. NaN3 тоже не помешает. |
![]() Advanced Member ![]() |
Что касается результатов с сорбентами 1,5...2 мкм, то мне они кажутся вполне достойными. Попытался обобщить данные протокола испытаний. Не уверен, что сделал это правильно, но получил такую табличку значений Cq Mean (среднее количество циклов) для своего сорбента (1,5...2) и сорбентов сравнения (126 и 320). Различия незначительны и находятся в пределах статистической достоверности: ![]() This post has been edited by genseq: 16.10.2013 08:32 |
![]() Advanced Member ![]() |
Нейтрально заряженные силанольные группы (Si-OH) образуют с отрицательно заряженными фосфатными группами (P-O) в кислой среде диэфирные связи (Si-0-P). Такие связи стабильны в кислой среде, но легко гиролизуются в щелочных условиях. Интересно, что этот известный в неорганической химии факт почему-то никто не ассоциирует с механизмом сорбции ДНК/РНК силикатами. Или я это просто не нашёл? |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
(genseq @ 16.10.2013 11:34) ![]() Нейтрально заряженные силанольные группы (Si-OH) образуют с отрицательно заряженными фосфатными группами (P-O) в кислой среде диэфирные связи (Si-0-P). Такие связи стабильны в кислой среде, но легко гиролизуются в щелочных условиях. Интересно, что этот известный в неорганической химии факт почему-то никто не ассоциирует с механизмом сорбции ДНК/РНК силикатами. Или я это просто не нашёл? На самом деле механизм сорбции другой, где кроме рН среды не менее важную роль играет ионная сила. А какова роль 5 М хаотропных агентов? Причем не все хаотропы годятся для этого! Ты не нашел, все давно расписано. ![]() This post has been edited by -Ъ-: 16.10.2013 12:00 |
![]() Advanced Member ![]() |
(-Ъ- @ 16.10.2013 09:12) ![]() А какова роль 5 М хаотропных агентов? Причем не все хаотропы годятся для этого! Ты не нашел, все давно расписано. ![]() Всё давно расписано: 1. Высокая ионная сила нейтрализует отталкивание ДНК/РНК отрицательно заряженной силикатной поверхностью. 2. Хаотропы к сорбции вообще отношения не имеют. Они лизируют вирусы и денатурируют белки, связанные с нуклеиновыми кислотами. Ещё они денатурируют ДНКазы и РНКазы. Давно описаны методики выделения без хаотропов. Например: ![]() Attached File(s)
|
![]() ![]() |
(-Ъ- @ 15.10.2013 11:36) ![]() Просто заменили маг. сорбенты из кита Промеги на другие различные. И если со своими "родными" растворами промеговские частицы заметно хуже работали, чем магносорбенты от Генсека и из Изогена - это тоже ведь о чем-то говорит? Проблема возникает с нормированием по концентрации и размеру частиц разного производства - одни растворы частиц более концентрированные, др. менее, одни частицы крупнее, др. мельче. Пока брали так, чтобы частиц для сорбции было заведомо достаточно.
|
![]() Advanced Member Москва ![]() |
(T2006 @ 17.10.2013 09:22) ![]() Проблема возникает с нормированием по концентрации и размеру частиц разного производства - одни растворы частиц более концентрированные, др. менее, одни частицы крупнее, др. мельче. Пока брали так, чтобы частиц для сорбции было заведомо достаточно. Спасибо, очень ценная инфа. Я тоже сравнивал в свое время все доступные магносорбенты на своем ките, со своими растворами, доведенными "до ума" на нативной силике. При всем уважении к Промеге, их сорбент рвал ДНК на мелкие куски (ДНК фага Лямбда превращалась в шмерок) и выход был меньше 30%. Очень мелкий сорбент , меньше микрона, оптимально использовать при выделении ДНК/РНК из плазмы, сыворотки или др., а более крупный, 2-10 мкм, - из образцов с избытком материала (кровь, гомогенаты тканей и т.п.). Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и варьировать его количество в зависимости от природы иссл. образца (количества ДНК в образце). Если возникнут вопросы при испытании - обращайтесь, можно в личку.
|
![]() Advanced Member Москва ![]() |
(genseq @ 16.10.2013 19:53) ![]() 1. Высокая ионная сила нейтрализует отталкивание ДНК/РНК отрицательно заряженной силикатной поверхностью. 2. Хаотропы к сорбции вообще отношения не имеют. Они лизируют вирусы и денатурируют белки, связанные с нуклеиновыми кислотами. Ещё они денатурируют ДНКазы и РНКазы. Давно описаны методики выделения без хаотропов. Например: ![]() Генсек, мы с тобой сравниванием "мягкое" с "теплым" - посмотри какой в статье рН - 4!!!! А я всегда работаю в нейтральной среде. Поэтому можешь дальше теоретизировать, но без меня. ![]() Кстати, статья так себе хоть и новая. Нет доверия авторам использующим Трис-ацетат буфер с рН = 4. Трис - буферы с рН меньше 7 это не буферы. ![]() Еще добавлю - элюция ДНК с сорбента 10 мин при 80 оС - это "финиш", а использование Протеиназы К в современных китах для автоматизации процесса - тоже шаг не вперед. Так что думай, Чапай... ![]() This post has been edited by -Ъ-: 17.10.2013 12:28 |
![]() Advanced Member ![]() |
(-Ъ- @ 17.10.2013 12:24) ![]() Очень мелкий сорбент , меньше микрона, оптимально использовать при выделении ДНК/РНК из плазмы, сыворотки или др., а более крупный, 2-10 мкм, - из образцов с избытком материала (кровь, гомогенаты тканей и т.п.). Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и варьировать его количество в зависимости от природы иссл. образца (количества ДНК в образце). Если возникнут вопросы при испытании - обращайтесь, можно в личку. Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и ![]() ПротеинА/Г магнитные шарики для ИП ![]() можно в такие вляпатся ![]() |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
(arndt @ 17.10.2013 13:28) ![]() ![]() ПротеинА/Г магнитные шарики для ИП ![]() можно в такие вляпатся ![]() Мне должно наверное присниться что это такое А/Г и ИП. ![]() Ты же любишь на каждый звук ссылку кидать! ![]() ![]() |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
|
![]() Advanced Member ![]() |
(-Ъ- @ 17.10.2013 13:47) ![]() ![]() Ты же любишь на каждый звук ссылку кидать! ![]() ![]()
|
![]() Advanced Member Москва ![]() |
И причем тут это? Мало ли на свете магносорбентов. ![]() |
![]() Advanced Member ![]() |
(-Ъ- @ 17.10.2013 14:40) ![]() И причем тут это? Мало ли на свете магносорбентов. ![]() сколко можно о стекляшках говорить ![]()
|
![]() Advanced Member ![]() |
(-Ъ- @ 17.10.2013 10:07) ![]() в статье рН - 4!!!! А я всегда работаю в нейтральной среде. Поэтому можешь дальше теоретизировать, но без меня. ![]() Кстати, статья так себе хоть и новая. Нет доверия авторам использующим Трис-ацетат буфер с рН = 4. Трис - буферы с рН меньше 7 это не буферы. ![]() Еще добавлю - элюция ДНК с сорбента 10 мин при 80 оС - это "финиш", а использование Протеиназы К в современных китах для автоматизации процесса - тоже шаг не вперед. Так что думай, Чапай... ![]() Статья старенькая (2005 г.). Огрехов в ней много, но и изюминка имеется. Даже две. Первая - отсутствие хаотропов, причём не случайное, а вполне обоснованное. Вторая - низкий pH (4,0), что обеспечивает ингибирование РНКаз не хуже хаотропов. ![]() Понятно, что Tris нужно заменить ацетатом, а дорогую протеиназу К дешёвыми аптечными таблетками ацидин-пепсина. ![]() В нейтральной среде (pH 7,0) сорбировать можно, но есть риск нарваться на плохое связывание при небольшом защелачивании: ![]() ![]() Так что думай, Чапай ... ![]() This post has been edited by genseq: 17.10.2013 15:35 |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
А использование его, RNA Later, напрямую как связывающую ДНК с силикафильтром среду не увенчалось успехом. Про аптечные реактивы вообще не серьезно говорить - неуважение к себе, пардон. В свое время, собрав кучу сериновых протеаз, пытался изобразить замену протеиназе К - фиг вам - лучше протеиназы К против нуклеаз нет НИЧЕГО. Но как она будет работать в кислой среде - это еще бАльшой вопрос. Кстати, у меня кривая получается ровно наоборот. ![]() Я при выделении ДНК полностью избавляюсь от гемоглобина и гепарина. И еще, в том же связывающем растворе очень легко солюбилизируется агароза, свернувшаяся кровь и мягкие ткани. Так что, дерзай, если не хочешь прислушаться к 20-летнему опыту совершенствования одного метода. ![]() Многие беды от избытка знаний. ![]() Я недавно говорил - надо уметь фильтровать инфу из литературы. ![]() This post has been edited by -Ъ-: 17.10.2013 16:56 |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
(arndt @ 17.10.2013 16:17) Ну займи себя чем-нибудь ![]() |
![]() Advanced Member ![]() |
(-Ъ- @ 17.10.2013 17:54) магношарики имеют смысл когда робот - у меня генмол в основном простаивает - пару раз включали ![]() а так - колонки Зимо или Квакаген ![]() |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
(arndt @ 17.10.2013 18:13) ![]() пару раз включали ![]() а так - колонки Зимо или Квакаген ![]() (arndt @ 15.10.2013 17:56) ![]() на магносорбентах китах нет чистой ДНК - иногда на ТакМанах при 100 - 50 нанограмм нифига нет - потом разводиш до 1 нанограмм - все OK у тебя термин "ингибировал" достаточно старомодный в реал-тайм ПЦР - если я развожу матрицу в 10 раз а у меня цикл скачет с 38 на 28 ![]() кабутто на твоих менше постав 10-кратные разведения против плазмиды и покажи народу Заметьте, не я это предложил ©. ![]() |
![]() Advanced Member ![]() |
|
![]() Advanced Member ![]() |
(avial @ 18.10.2013 00:33) 100 рублей на пробу ![]() |
![]() Advanced Member ![]() |
(avial @ 18.10.2013 12:24) ![]() я уже заказал пробнички этих "чудо-колонок" - посмотрим на цена-качество ![]() |
![]() Advanced Member Москва ![]() |
![]() Это мы уже обсуждалы на этом форуме... |
« Next Oldest · Molecular and cellular biology · Next Newest » |
![]() ![]() ![]() |