Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Western Blot
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 06.09.2017 20:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Здравствуйте друзья,

провожу очередной эксперимент Вестерн Блот, который должен подтвердить концентрацию образцов плазмы, полученную на ELISA тесте.

Блокирую BSA, потом инкубирую с HRP антителом...и смотрю на ChemiDoc Image.

И такие вопросы:
1. В качестве Стандарта корректно ли брать очищенный белок, делать несколько концентраций, грузить на гель и сравнивать с разведенными образцами плазмы?

2. Один и тот же образец при повторных проведениях Вестерна показывает различной интенсивности линию на мембранах.

Спасибо
Участник онлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 06.09.2017 22:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

1. Корректно, если у вас белок той же природы и мало-мальски аттестован. Надеюсь вы определили его концентрацию?
2. Это не вопрос, а констатация факта. Ну показывает разную, и?
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 07.09.2017 11:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

(Rob @ 06.09.2017 18:39)
Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте друзья,



2. Один и тот же образец при повторных проведениях Вестерна показывает различной интенсивности линию на мембранах.

Спасибо

Вестерн блот - не количественный метод, так что у это нормально.

Если хотите посчитать чтото - то делать надо три повтора и считать среднее, но и это не гарантирует точности.
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 07.09.2017 18:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

[quote=vb,06.09.2017 23:22]Ссылка на исходное сообщение  1. Корректно, если у вас белок той же природы и мало-мальски аттестован. Надеюсь вы определили его концентрацию?

Да, концентрацию определили...как мне думается. Компания производитель настаивает на том, что они дают корректную концентрацию...А в лабе, на нанодропе, могут быть погрешности, на этом и остановился я .


2. Это не вопрос, а констатация факта. Ну показывает разную, и?

В этом и есть вопрос. Почему один и тот же образец показывает бэнд различной интенсивности при повторах Вэстерн эксперимента...то он есть и очень яркий, а в другой раз - только намек на присутсвие.
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 07.09.2017 18:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

(ship @ 07.09.2017 12:59)
Ссылка на исходное сообщение  Вестерн блот - не количественный метод, так что у это нормально.

Если хотите посчитать чтото - то делать надо три повтора и считать среднее, но и это не гарантирует точности.



Цель Вестерна, в моем случае, сравнить между собой образцы, и также сравнить их в отношении к стандарту, который разводиться в несколько концентраций.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 07.09.2017 18:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Сравнивать можно только в одном геле. В разных гелях можно пытаться сравнивать после нормирования по стандарту.

Изменения интенсивности окраски могут быть из-за:
1)Изменений условий переноса(Время, токи/напряжения, расстояния между электродами, изменения состава буфера, разная температура.)
2)Изменения в условиях инкубации с антителами, время инкубации, температура инкубации, разведения антител, возможные повторные использования. Так же возможны разные результаты из -за изменения рН используемых растворов и тд.
3)Изменения в субстратах они могут попросту сдыхать при хранении, хотя это редкость и если все остальное хорошо, то можно просто заметить постепенной ухудшение сигнала со временем.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Rob
Участник онлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 07.09.2017 22:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

[quote=Rob,07.09.2017 16:06]Ссылка на исходное сообщение  [quote=vb,06.09.2017 23:22]Ссылка на исходное сообщение  1. Корректно, если у вас белок той же природы и мало-мальски аттестован. Надеюсь вы определили его концентрацию?

Да, концентрацию определили...как мне думается. Компания производитель настаивает на том, что они дают корректную концентрацию...А в лабе, на нанодропе, могут быть погрешности, на этом и остановился я .
2. Это не вопрос, а констатация факта. Ну показывает разную, и?

В этом и есть вопрос. Почему один и тот же образец показывает бэнд различной интенсивности при повторах Вэстерн эксперимента...то он есть и очень яркий, а в другой раз - только намек на присутсвие.
[/quote]
1.Нанодроп не тот инструмент, которым можно аттестовывать стандарты.

2. Потому что результаты метода зависят от огромного количества факторов, которые трудно стандартизовать и контролировать.
ммм в общем изложил.
я больое скажу - даже внутри одного геля интенсивность окраски может быть неоднородной. Зависит от того как и где мыли, не сложилась ли мембрана при покачивании, ну и от непонятных вещей. Еще напряженность при переносе может быть разной в разных участках мембраны. В общем вестерн для количественной оценки нужно осторожно применять. А лучше вообще не применять.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Rob
Участник оффлайн! SwetaEvgesha




 прочитанное сообщение 11.09.2017 09:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

а зачем просчет делать?
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 11.09.2017 15:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(MMM @ 07.09.2017 19:54)
Ссылка на исходное сообщение  Сравнивать можно только в одном геле. В разных гелях можно пытаться сравнивать после нормирования по стандарту.

Изменения интенсивности окраски могут быть из-за:
1)Изменений условий переноса(Время, токи/напряжения, расстояния между электродами, изменения состава буфера, разная температура.)
2)Изменения в условиях инкубации с антителами, время инкубации, температура инкубации, разведения антител, возможные повторные использования. Так же возможны разные результаты из -за изменения рН используемых растворов и тд.
3)Изменения в субстратах они могут попросту сдыхать при хранении, хотя это редкость и если все остальное хорошо, то можно просто заметить постепенной ухудшение сигнала со временем.


Да, но не смотря на все это, Стандарт почему то на всех мембранах одинаково выглядит, а вот образцы, повторенные на этих мембранах, выглядят по разному...
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 11.09.2017 15:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

А вы картинки можете выложить? например, если стандарта у вас много нанесено, то сигнал насыщен и вы видите одинаковую жирную полосу каждый раз. А если в образцах белка сильно меньше - то отсюда и вариабельность.
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 11.09.2017 16:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

С превеликим удовольствием цепляю две картинки...
Первая, под именем 8_27_17...идет разведние образцов в 100 раз.
Вторая, 9_5_17...разведение в 200 раз.

Предположил сделать этот эксперимент, чтобы подтвердить концентрации по Элайзе.
Т.е. образец "2" ("4" и "7" примерно одинаковая концентрация)...Элайза выдает концентрацию около 1.5mg/mL, развел в 100 раз. Хотел увидить в сравнении со стандартом, но даже 5ug/mL показывает линию сильнее чем у образца.

На мембране 9_5_17...все бэнды образцов не подтверждаются даже близко,тот же образец "2", "4" и "7" - разные линии, или вообще не видно их.

Картинки:
картинка: 8_27_17.jpg
8_27_17.jpg — (41.32к)   

картинка: 9_5_17_2.jpg
9_5_17_2.jpg — (35.31к)   

Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 11.09.2017 17:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

у вас картинке не полосы, а пятна. это очень сильный перегруз по белку, как в стандартах,так и в образцах.
при таком перегрузе не может быть и речи о корректном сравнении.
вам надо найти более менее линейный диапазон, когда на блоте нет такого перегруза.
стандарты можно смело в 1000 раз разводить, ну и образцы раз в 500 от начальной концентрации (самые концентрированные).
нормально у вас выглядят лишь полосы 2, 5, 6 на первой картинке.

ну и стандарты тоже сильно различаются. плюс на хемидоке ставьте режим highlight saturated pixel, для обсчета пиксели не должны быть насыщены, иначе сигнал уже не будет линейно зависить от хемилюминесценции

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Rob
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 11.09.2017 17:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Спасибо за ответ..
Как я могу разводить в 1000 раз...если даже при разведение в 200 (вторая картинка) образцов уже не видно...
а предполагаемая концентрация по Элайзе около 1.5mg/mL...
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 11.09.2017 17:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

возьмите один самый конгцентрированный образец и один самый неконцентрированный,
сделайте серии разведений, и посмотрите при каких разведениях вы видите нрмальные полосы на блоте.

зато при 100х развденгии все видно, на первой картинке.
тут у вас еще и проблемы технического плана скорее всего были со вторым блотом.

может и белок повалился в образцах, кто его знает.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.09.2017 19:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

А я извиняюсь за дурацкий вопрос. Вот вы пишете на пробах стандарта концентрацию в микрограммах на мл. А сколько вы на форез наносите 1мкл 5,10, 25. И красите вы ECL(хемилюминесценция) или какая другая окраска. И если это хемилюминесценция то какая экспозиция у ваших картинок(какое время накапливался сигнал?)
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 11.09.2017 20:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

(MMM @ 11.09.2017 20:29)
Ссылка на исходное сообщение  А я извиняюсь за дурацкий вопрос. Вот вы пишете на пробах стандарта концентрацию в микрограммах на мл. А сколько вы на форез наносите 1мкл 5,10, 25. И красите вы ECL(хемилюминесценция) или какая  другая окраска. И если это хемилюминесценция то какая экспозиция у ваших картинок(какое время накапливался сигнал?)


И совсем не дурацкий вопрос у Вас...
Если концентрация 20ug/mL, то наношу 0.4ug в 20uL общего загружения.
Соответственно, 10ug/mL - это 0.2ug в 20uL, ну и так далее.

Краска хемилюминесценция..

Наношу на блот и сразу начинаю читать. Первая прочитка 2 секунды, потом всего 5 картинок за 5 секунд....
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.09.2017 21:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

Ну, эта, у вас дикий перегруз прядка эдак на 3 - 5.
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 11.09.2017 22:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

(MMM @ 11.09.2017 22:43)
Ссылка на исходное сообщение  Ну, эта, у вас дикий перегруз прядка эдак на 3 - 5.


Перегруз чего, стандарта?...надо еще ниже идти с загружаемым колличеством? К примеру, начать с 0.1ug на 20uL для одной лунки?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.09.2017 23:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

Усего и штандарту и проб. Разводить как минимум в тысячу раз и на люминесценции держать минут так 5-15.
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 12.09.2017 15:44     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

(MMM @ 12.09.2017 00:10)
Ссылка на исходное сообщение  Усего и штандарту и проб. Разводить как минимум в тысячу раз и на люминесценции держать минут так 5-15.


Как же могу разводить в тысячу раз, если уже даже при 300 кратном разведении полосы становятся слабо видны...
Почему Стандарт имеет такие как бы растянутые линии, а не аккуратные прямоугольнички?

Вот такая сегодня получилась картинка...Проявлял люминесценцию между 5-10 минут.
Какие то образцы, если сравнивать опять таки с предыдущими экспериментами, выглядят по разному. Почему так? Не аккуратно развел?

Картинки:
картинка: 9_11_17_in_vivo.jpg
9_11_17_in_vivo.jpg — (68.76к)   

Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.09.2017 16:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

--полосы становятся слабо видны.
Это от того что вы их экспонируете мало. Вы делаете дикую перегрузку потом дико коротко экспонируете сигнал естественно низкие концентрации вы не увидите.

Представьте что вы светите на фотоаппарат прожектором или солнцем, что бы вам не засветить пленку в выжжженный свет вы делаете соответствующую маленькую экспозицию, но при такой экспозиции обычные, нормально освещенные предметы оказываются практически как-будто в кромешной тьме их будет просто не видно.
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 12.09.2017 17:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

(MMM @ 12.09.2017 17:19)
Ссылка на исходное сообщение  --полосы становятся слабо видны.
Это от того что вы их экспонируете мало.  Вы делаете дикую перегрузку потом дико коротко экспонируете сигнал естественно низкие концентрации вы не увидите.

Представьте что вы светите на фотоаппарат прожектором или солнцем, что бы вам не засветить пленку в выжжженный свет вы делаете соответствующую маленькую экспозицию, но при такой экспозиции обычные, нормально освещенные предметы оказываются практически как-будто в кромешной тьме их будет просто не видно.


Вы запутали меня окончательно...Перегрузку чего я делаю, если концентрации низкие?
5-10 минут не достаточно? Если держу дольше, то мембрана начинает темнеть и получается такая картинка в сумерках.
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 12.09.2017 17:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

я же не могу экспонировать одни полосы дольше, а другие - быстрее...
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.09.2017 17:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

(Rob @ 12.09.2017 18:39)
Ссылка на исходное сообщение  я же не могу экспонировать одни полосы дольше, а другие - быстрее...

Вам это не к чему.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.09.2017 18:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

Какие у вас на хрен низкие концентрации у вас должны быть 10ки пикограмм на зону, может 100и.

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 23.10.17 10:56
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft