Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Экспрессия в неэкспрессирующих штаммах
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! plotter
Постоянный участник
Стыдно признаваться о том, где живу...



 прочитанное сообщение 10.09.2017 13:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Протрансформировал XL1 blue вектором пет28 с егфп. Получились зелено-желтые клетки. Бледненькие, но все же уверенно флуоресцирующие. Это получается, что Т7 промотор пусть и немного, но все же распознается нативной колийной полимеразой?
Участник оффлайн! R-J-Dio




 прочитанное сообщение 11.09.2017 12:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

а что Вы удивляетесь? В принципе, нет ничего невозможного. В плазмиде всегда найдутся промоторо-подобные элементы, которые наработают Вам РНК по кольцу, а много ли надо мРНК для нетоксичного и крайне стабильного белка. Я бы для чистоты эксперимента спектр бы снял, конечно же, чтобы исключить фоновую автофлуоресценцию колоний и рассеяние света
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 11.09.2017 15:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

а еще лучше сделать Вестерн блот с анти-Egfp

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): sceptique
Участник оффлайн! R-J-Dio




 прочитанное сообщение 11.09.2017 16:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

может не хватить чувствительности
Участник оффлайн! ASDF
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.09.2017 22:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

А какой нибудь терминатор нельзя перед Т7 промотором вставить? У меня другая проблема, но похожая - вставка под Т7про (кусок генома вируса) похоже токсична и растут только клоны со сбитой рамкой.
Участник оффлайн! R-J-Dio




 прочитанное сообщение 12.09.2017 10:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

после MCS уже стоит терминатор, при добавлении еще одного спереди может получиться кривоватенькая плазмидка. Мда-с, интересный эффект. помнится, барназа у меня в нативном виде тоже не клонировалась. Стоит задуматься
Участник оффлайн! plotter
Постоянный участник
Стыдно признаваться о том, где живу...



 прочитанное сообщение 13.09.2017 11:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

ASDF, пошукайте у зиморесёрча среду, по их утверждениям полностью блокирующую экспрессию с т7.
R-J-Dio, зачем спектр? Когда соскоб с чашки (для выделения вектора) имеет лимоново-зеленый оттенок, это наводит на вполне определенные мысли smile.gif

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Esya
Участник оффлайн! criplenie
Участник



 прочитанное сообщение 13.09.2017 11:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

pET-28 по идее должен еще содержать сайт lac-репрессора. Да и остальные промоторы на плазмиде направлены в противоположную сторону. Что, впрочем, не исключает наличие промоторо-подобных последовательностей в самих генах.
Как минимум должно помочь добавление глюкозы в среду (хотя эффект может быть и обратным). А еще лучше - выращивание на минимальной среде типа M9.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): sceptique
Участник оффлайн! R-J-Dio




 прочитанное сообщение 13.09.2017 11:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(criplenie @ 13.09.2017 12:10)
Ссылка на исходное сообщение  pET-28 по идее должен еще содержать сайт lac-репрессора. Да и остальные промоторы на плазмиде направлены в противоположную сторону. Что, впрочем, не исключает наличие промоторо-подобных последовательностей в самих генах.
Как минимум должно помочь добавление глюкозы в среду (хотя эффект может быть и обратным). А еще лучше - выращивание на минимальной среде типа M9.

lac I есть, но это репрессор lac-пр, а тут непонятно с чего. И глюкоза тоже потому не поможет (по идее). Минималку, да, попробовать стОит

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): criplenie
Участник оффлайн! R-J-Dio




 прочитанное сообщение 13.09.2017 11:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(plotter @ 13.09.2017 12:09)
Ссылка на исходное сообщение  ASDF, пошукайте у зиморесёрча среду, по их утверждениям полностью блокирующую экспрессию с т7.
R-J-Dio, зачем спектр? Когда соскоб с чашки (для выделения вектора) имеет лимоново-зеленый оттенок, это наводит на вполне определенные мысли smile.gif

когда зеленое, тады да, сомнений нет. а ссылку на среду можно?
Участник оффлайн! plotter
Постоянный участник
Стыдно признаваться о том, где живу...



 прочитанное сообщение 13.09.2017 13:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Тут поглядеть можно. http://www.zymoresearch.com/protein/growth...media-set-eb-ob
Соседи с этого набора кипятком писают. Но лично я вообще не впечатлился.
Участник оффлайн! R-J-Dio




 прочитанное сообщение 13.09.2017 14:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

кажись, с глюкозой-лактозой поигрались. Тов. Студиеру с его induction without induction привет.

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): Esya, sceptique
Участник оффлайн! criplenie
Участник



 прочитанное сообщение 14.09.2017 12:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(R-J-Dio @ 13.09.2017 12:40)
Ссылка на исходное сообщение  lac I есть, но это репрессор lac-пр, а тут непонятно с чего. И глюкоза тоже потому не поможет (по идее). Минималку, да, попробовать стОит

pETы начиная с pET-11 имеют модифицированный T7-промотор, который дополнительно регулируется lac-репрессором. Но по идее это именно защита от протекания промотора на DE3-лизогенах.
One approach is to use vectors that contain what is termed a T7lac promoter (Studier et al., 1990;
Dubendorff and Studier, 1991; see table on p. 7). These plasmids contain a lac operator sequence
just downstream of the T7 promoter. They also carry the natural promoter and coding sequence
for the lac repressor (lacI), oriented so that the T7lac and lacI promoters diverge.

См. новагеновский мануал - https://research.fhcrc.org/content/dam/stri...biochem/pet.pdf
Там же вопросы терминаторов разобраны.
Участник оффлайн! qwatra




 прочитанное сообщение 18.09.2017 16:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Замороженные компетентные клетки E. coli штамм XL1-Blue предназначены для химической трансформации неочищенной лигазной смесью (или другой ДНК, находящейся в умеренно солевом буфере).
Компетентные клетки обеспечивают:
- высокую эффективность трансформации большинством плазмидных и λ- векторов
- возможность бело-голубой селекции
XL1-Blue генотип: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]
Эффективность трансформации: 1-5х107 cfu/μg
Участник оффлайн! R-J-Dio




 прочитанное сообщение 19.09.2017 11:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

это вы к чему, читать умеете и копи-пастом владеете? Возьмите с полки пирожок!

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 18.10.17 10:37
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft