Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* ELISA дизайн протокол
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 13.09.2017 18:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Здравствуйте друзья!

У меня очередной технический вопрос.
Как мне провести ELISA эксперимент, чтобы определить связывающую активность заданного антитела и заданного белка, который Fc?

На ночь инкубирую плитку с неспецифическим антителом, потом блокирую заданым белком (при расчете концентрации неизвестного, блокировал BSA), потом инкубирую с заданым антителом, далее - меченное антитело HRP. Поправьте меня, пожалуйста, если эта схема не верна.

Благодарю
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.09.2017 21:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Под связывающей активностью вы что подразумеваете?
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 13.09.2017 22:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

(vb @ 13.09.2017 22:16)
Ссылка на исходное сообщение  Под связывающей активностью вы что подразумеваете?


Подразумеваю, как будет антитело связываться с белком.

Покрываю плитку анти-человеческим неспецифич. антителом...потом блокирую BSA...потом, белок Fc человеческий...потом, антитело человеческое, произведенное в мышках...и сверху HRP ani-human (или может надо HRP-anti mouse?).
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.09.2017 23:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

(Rob @ 13.09.2017 20:45)
Ссылка на исходное сообщение  Подразумеваю, как будет антитело связываться с белком.

хорошо, в каких единицах измерения вы это планируете выражать?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.09.2017 12:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Интересно, а что такое человеческое антитело из мышки?
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 14.09.2017 16:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

(vb @ 14.09.2017 00:21)
Ссылка на исходное сообщение  хорошо, в каких единицах измерения вы это планируете выражать?


в молярной концентрации
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 14.09.2017 16:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(MMM @ 14.09.2017 13:07)
Ссылка на исходное сообщение  Интересно, а что такое человеческое антитело из мышки?


human Fc, произведенной в мыше
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.09.2017 19:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

(Rob @ 14.09.2017 17:28)
Ссылка на исходное сообщение  human Fc, произведенной в мыше

Правильно ли я понимаю из вашего ответа, что это не антитело, а только Fc фрагмент человеческого антитела?
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 14.09.2017 20:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(MMM @ 14.09.2017 20:02)
Ссылка на исходное сообщение  Правильно ли я понимаю из вашего ответа, что это не антитело, а только Fc фрагмент человеческого антитела?


это антитело, а не фрагмент
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 14.09.2017 20:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Хочу добавить деталей...

покрываю пластик плитки goat anti-human UNLB антителом...инкубирую ночь
потом, белок, у которого human Fc....инкубирую
потом, антитело human Fc (mouse origin)...инкубирую
потом, goat anti-human HRP..инкубирую...

крашу

Не будет ли HRP антитело вязаться к UNLB антителу?
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.09.2017 21:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(Rob @ 14.09.2017 14:28)
Ссылка на исходное сообщение  в молярной концентрации

Концентрации чего?
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.09.2017 21:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(Rob @ 14.09.2017 18:20)
Ссылка на исходное сообщение  Хочу добавить деталей...

покрываю пластик плитки goat anti-human UNLB антителом...инкубирую ночь
потом, белок, у которого human Fc....инкубирую
потом, антитело human Fc (mouse origin)...инкубирую
потом, goat anti-human HRP..инкубирую...

крашу

Не будет ли HRP антитело вязаться к UNLB антителу?


Нет не будет.
вот только с чем у вас связывается, антитело human Fc (mouse origin?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.09.2017 22:35     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(Rob @ 14.09.2017 21:20)
Ссылка на исходное сообщение  
Не будет ли HRP антитело вязаться к UNLB антителу?

Неа! Козлы с козлами не связываются.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.09.2017 22:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(Rob @ 14.09.2017 21:20)
Ссылка на исходное сообщение
покрываю пластик плитки goat anti-human UNLB антителом...инкубирую ночь

Я конечно понимаю, что вы русский язык узнали от мамы с папой, которые уехали из России лет эдак 30-40 назад. Но ваша "плитка" очень режет уши. plate у нас называют планшет или микропланшет и еще иногда планшет для микротитрования ну и вульгарно плашка.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.09.2017 22:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

(vb @ 14.09.2017 22:59)
Ссылка на исходное сообщение
вот только с чем у вас связывается, антитело human Fc (mouse origin?


Как с чем? Оно должно вытеснить тестируемый Fc-белок (продукт ГМО) с анти-человеческих козлов. И тем самым показать превосходство мышинных натуральных ГМО химер перед рекомбинантными Fc-продуктами ГМО. smile.gif
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.09.2017 23:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Значит в чем ваша проблема: Если вы будете в конце инкубировать с античеловеческим коньюгатом, то он сможет узнавать только человеческий Fc фрагмент(не важно чей мышинных химер или рекомбинантного Fc), потому что в вашем бутерброде снизу под этим коньюгатом, больше ничего человеческого, кроме Fc - нет. А это значит что все что теоретически могло бы удерживать коньюгат на плашке, что бы связаться с коньюгатом должно от этих якорей отвалится, ибо держится оно за плашку Fc-фрагментом. Либо все будет строится на том, что заякорить коньюгат можно будет только за ту часть Fc, которая не связана с самыми нижними античеловеками, а будет ли такая часть узнаваться коньюгатом неизвестно. В любом случае античеловеческий коньюгат ни при каких условиях вашего бутерброда не сможет отличить Fc рекомбоминанта от Fc - мышыинной химеры. Вот если вы будете использовать антимышинный коньюгат, то тогда та часть этого коньюгата, которая узнает Fab фрагменты мыши сможет связаться с оставшимися связанными с нижними античеловеками мышинными химерами.

Но на самом деле вам надо сделать не так. Вам надо мышинную химеру или просто человеческий нативный Fc пометить биотином связать ее с нижними античеловеками, а потом вытеснять тестируемым белком и белком сравнения (тем же нативным Fc или мышинной химерой, но не меченными биотином) и вытеснять эквимолярными количествами и сравнивать результаты вытеснения с помощью стрептавидин пероксидазы.

Сообщение было отредактировано MMM - 14.09.2017 23:09
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 15.09.2017 17:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

(MMM @ 14.09.2017 23:40)
Ссылка на исходное сообщение  Я конечно понимаю, что вы русский язык узнали от мамы с папой, которые уехали из России лет эдак 30-40 назад. Но ваша "плитка" очень режет уши. plate  у нас называют планшет или микропланшет и еще иногда планшет для микротитрования ну и  вульгарно плашка.


Спасибо за понимание...
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 15.09.2017 17:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

(MMM @ 14.09.2017 23:46)
Ссылка на исходное сообщение  Как с чем? Оно должно вытеснить тестируемый Fc-белок (продукт ГМО)  с анти-человеческих козлов. И тем самым показать превосходство мышинных натуральных ГМО химер перед рекомбинантными Fc-продуктами ГМО. smile.gif


Я вообще то предполагаю, что антитело должно прицепиться к белку-Fc, а не бороться за козлиное антитело.
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 15.09.2017 18:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

Или я провел вчера второй эксперимент...на планшет положил антитело человеческое..инкубировал...потом белок Fc....инкубировал...потом ... анти-человеческое HRP...и все..
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 15.09.2017 18:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

(MMM @ 15.09.2017 00:06)
Ссылка на исходное сообщение  Значит в чем ваша проблема: Если вы будете в конце инкубировать с античеловеческим коньюгатом, то он сможет узнавать только человеческий Fc фрагмент(не важно чей мышинных химер или рекомбинантного Fc), потому что в вашем бутерброде снизу под этим коньюгатом, больше ничего человеческого, кроме Fc -  нет. А это значит что все что теоретически могло бы удерживать коньюгат на плашке, что бы связаться с коньюгатом должно от этих якорей отвалится, ибо держится оно за плашку Fc-фрагментом. Либо все будет строится на том, что заякорить коньюгат можно будет только за ту часть Fc, которая не связана с самыми нижними античеловеками, а будет ли такая часть узнаваться коньюгатом неизвестно. В любом случае античеловеческий коньюгат ни при каких условиях вашего бутерброда не сможет отличить Fc рекомбоминанта от Fc - мышыинной химеры. Вот если вы будете использовать антимышинный коньюгат, то тогда та часть этого коньюгата, которая узнает Fab фрагменты мыши сможет связаться с оставшимися связанными с нижними античеловеками  мышинными  химерами.

Но на самом деле вам надо сделать не так. Вам надо мышинную химеру  или просто человеческий нативный Fc пометить биотином связать ее с нижними античеловеками, а потом вытеснять тестируемым белком и белком сравнения (тем же нативным Fc или мышинной химерой, но не меченными биотином) и вытеснять эквимолярными количествами и сравнивать результаты вытеснения с помощью стрептавидин пероксидазы.


Перечитываю нескольк раз....
если антитело связывается с белком...то ведь HRP прицепиться к антителу...и будет у меня сигнал...
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 15.09.2017 18:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

Козлиное UNLB немеченное антитело на плитке разпознает все, что можно разпознать или только какую то спец. область, как примеру, Fc?
Если узнает Fc, то белок Fc прицепится, а потом, антитело узнает этот белок и тоже свяжеться, а потом....HRP козлиное увидит Fc антитела и так будет видна картина связывание белка с антителом
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.09.2017 20:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

Вопервых, человечье антитело не свяжется с челокечьим Fc. С чего бы ему связываться?
Или у вас мышиное античелрвеческое?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.09.2017 20:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

(Rob @ 15.09.2017 18:59)
Ссылка на исходное сообщение  Я вообще то предполагаю, что антитело должно прицепиться к белку-Fc, а не бороться за козлиное антитело.


Даааа? А почему в таком случае ему не прицепится и к химерным мышечеловекам, у которых Fc тоже человеческий?

Сообщение было отредактировано MMM - 15.09.2017 20:51
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.09.2017 20:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

(Rob @ 15.09.2017 19:04)
Ссылка на исходное сообщение  Перечитываю нескольк раз....
если антитело связывается с белком...то ведь HRP прицепиться к антителу...и будет у меня сигнал...


Вы сами-то поняли че спросили.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.09.2017 20:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

(Rob @ 15.09.2017 19:11)
Ссылка на исходное сообщение  Козлиное UNLB немеченное антитело на плитке разпознает все, что можно разпознать или только какую то спец. область, как примеру, Fc?

Пожалуйста!: не меченное антитело на ПЛАНШЕТЕ.....

(Rob @ 15.09.2017 19:11)
Ссылка на исходное сообщениеЕсли узнает Fc, то белок Fc прицепится, а потом, антитело узнает этот белок и тоже свяжеться, а потом....HRP козлиное увидит Fc антитела и так будет видна картина связывание белка с антителом


Во первых кто вам сказал, что если к Fc причепилось одно антитело, то к нему же причепится и второе антитело. Если так рассуждать, то к нему может и третье прицепится и четвертое. Но Fc фрагмент не резиновый он не может нести на себе скольугодно много антител.

Если нижние античеловеки поликлоны и верхние коньюгированные античеловеки тоже поликлоны. То в этих поликлональных пулах, есть пулы практически на все антигенные детерминанты, которые имеются на Fc фрагменте. Это значит что в верхних коньюгатах всегда может найтись клон антител, который будет конкурировать с нижним клоном за антигенную детерминанту. А это означает, что такие иммунные комплексы рискуют быть снятыми с иммобилизованных антител и перейти в раствор в комплексе с коньюгатом и следовательно не будут впоследствии детектированы.

Сообщение было отредактировано MMM - 15.09.2017 20:48
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 15.09.2017 21:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

(MMM @ 15.09.2017 21:30)
Ссылка на исходное сообщение  Даааа? А почему в таком случае ему не прицепится и к химерным мышечеловекам, у которых Fc тоже человеческий?


НУ я так и говорю, что белок Fc должен связаться с антителом....и активность этого связывания я и хочу узнать.
Итак нижний козел прицепит к себе белок за Fc...потом, антитело Fab регион узнает комплиментарно белок и свяжется с ним....потом верхний козел HRP распознает Fc регион антитела....
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 15.09.2017 21:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

(vb @ 15.09.2017 21:16)
Ссылка на исходное сообщение  Вопервых, человечье антитело не свяжется с челокечьим Fc. С чего бы ему связываться?
Или у вас мышиное античелрвеческое?


ПРостите, уточните, пожалуйста, какое антитело вы имеете ввиду? Одно козлиное UNLB неспецифическое, второе- козлиное HRP меченое, третье - исследуемое.
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.09.2017 22:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

(Rob @ 15.09.2017 19:18)
Ссылка на исходное сообщение  ПРостите, уточните, пожалуйста, какое антитело вы имеете ввиду? Одно козлиное UNLB неспецифическое, второе- козлиное HRP меченое, третье - исследуемое.

Покрываю плитку анти-человеческим неспецифич. антителом...потом блокирую BSA...потом, белок Fc человеческий...потом, антитело человеческое, произведенное в мышках...и сверху HRP ani-human (или может надо HRP-anti mouse?).
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.09.2017 13:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

Ну давайте попорядку.
1) Мы сенсебилизируем планшет поликлональными козячьими антителами против человеческих антител
2)Наносим анализируемый белок, содержащий Fc фрагмент антител человека.
Ок! Что происходит?Априорно поликлональные антитела содержат клоны, направленные на антигенные детерминанты как Fc, так Fab фрагментов. Но против анализируемого белка будут задействованы клоны направленные только против Fc фрагмента причем только те, для которых на данном анализируемом фрагменте найдутся антигенные детерминанты.
3)Мы наносим гуманизованные антитела мыши - этакую химеру Fc - фрагмент человеческий, а Fab-фрагмент мышинный. Что происходит? Вы не пишите о специфичности этих химер, но вряд ли они направлены против Fc-фрагмента человека, ибо тогда бы они были бы напрвлены сами против себя и очень быстренько образовали бы гигантский нерастворимый иммунный комплекс. Так что допустим, что их специфичность никакак не связана ни с какими антителами, тогда для антител, которыми сенсибилизирован планшет они будут представлять все тот же Fc фрагмент человека и некий индиферентный балластный кусок(мышинный Fab фрагмент) и тогда Fc фрагмент мышинных химер начнет конкурировать за связывание с уже нанесенным ранее Fc -фрагментом за связывание с антителами, которыми сенсебилизирован планшет. Т.е. начинается конкурентная борба между тестируемым белком и мышинными химерами за места на скамейке антител, которыми сенсибилизирован планшет. Побеждает тот кого больше и кто сильнее держится за скамейку. В зависимости от концентраций и свойств анализируемых молекул мы можем получить скамейку со смесью молекул химер и анализируемых молекул в разных соотношениях или скамейку, на которой молекулы только одного из участников борьбы за места на скамейке.

4) Теперь сверху мы наносим коньюгат и это опять поликлональная сыворотка против человеческого Fc фрагмента. Вопрос-смогут ли эти антитела как-то отличить химеры мышы от анализируемого Fc- белка? Ответ-нет не смогут.
Вопрос смогут ли антитела коньюгата конкурировать за связывание Fc фрагмента с антителами , которыми сенсебилизирован планшет? Ответ - да, смогут.

И наконец глобальный вопрос сможем ли мы такой схемой ELISA извлечь какую-то информацию о характере связывания с изучаемого белка с антителами против антител человека. Отвечаем - нет. Потому что используемые для проявления результата коньюгаты не обладают специфичностью ни к одному из участников конкурентной борьбы - это раз. И два они сами являются конкурентами тем антителам, которые заякоривают имунный комплекс на планшете и тем самым разрушают заякоренный комплекс и смывают его в педальное ведро.

Сообщение было отредактировано MMM - 16.09.2017 15:37

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): CowDoc
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 17.09.2017 22:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

(MMM @ 16.09.2017 14:42)
Ссылка на исходное сообщение  Ну давайте попорядку.
1) Мы сенсебилизируем планшет поликлональными козячьими антителами против человеческих антител
2)Наносим анализируемый белок, содержащий Fc фрагмент антител человека.
Ок! Что происходит?Априорно поликлональные антитела содержат клоны, направленные на антигенные детерминанты как Fc, так Fab фрагментов. Но против анализируемого белка будут задействованы клоны направленные только против Fc фрагмента причем только те, для которых на данном анализируемом фрагменте найдутся антигенные детерминанты.
3)Мы наносим гуманизованные антитела мыши - этакую химеру Fc - фрагмент человеческий, а Fab-фрагмент мышинный.  Что происходит? Вы не пишите о специфичности этих химер, но вряд ли они направлены против Fc-фрагмента человека, ибо тогда бы они были бы напрвлены сами против себя и очень быстренько образовали бы гигантский нерастворимый иммунный комплекс. Так что допустим, что их специфичность никакак не связана ни с какими антителами, тогда для антител, которыми сенсибилизирован планшет они будут представлять все тот же Fc фрагмент человека и некий индиферентный балластный кусок(мышинный Fab фрагмент) и тогда Fc фрагмент мышинных химер начнет конкурировать за связывание с уже нанесенным ранее Fc -фрагментом за связывание с антителами, которыми сенсебилизирован планшет. Т.е. начинается конкурентная борба между тестируемым белком и мышинными химерами за места на скамейке антител, которыми сенсибилизирован планшет. Побеждает тот кого больше и кто сильнее держится за скамейку. В зависимости от концентраций и свойств анализируемых молекул мы можем получить скамейку со смесью молекул химер и анализируемых молекул в разных соотношениях или скамейку, на которой молекулы только одного из участников борьбы за места на скамейке.

4) Теперь сверху мы наносим коньюгат и это опять поликлональная сыворотка против человеческого Fc фрагмента. Вопрос-смогут ли эти антитела как-то отличить химеры мышы от анализируемого Fc- белка? Ответ-нет не смогут.
Вопрос смогут ли антитела коньюгата конкурировать за связывание Fc фрагмента с антителами , которыми сенсебилизирован планшет? Ответ - да, смогут.
[b]
И наконец глобальный вопрос сможем ли мы такой схемой ELISA извлечь какую-то информацию о характере связывания с изучаемого белка с антителами против антител человека. Отвечаем - нет. Потому что используемые для проявления результата коньюгаты не обладают специфичностью ни к одному из участников конкурентной борьбы - это раз. И два они сами являются  конкурентами тем антителам, которые заякоривают имунный комплекс на планшете и тем самым разрушают заякоренный комплекс и смывают его в педальное ведро.


Вы же мне писали, что козлы с козлами не связываются. У меня был вопрос о связывании верхнего HRP anti-human к поликлональному нижнему anti-human. А тут говорите, что обратное
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 17.09.2017 22:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

а если мне верхнее HRP взять не козлиное, а кроликовое, или не anti-human, а anti-mouse?

Почему вы утверждаете, что исследуюемое человеческое антитело захочет вязаться к поликлональному коньюгированному?. Оно же сконструировано на связь с белоком, зачем ему бороться за связывание с поликлональным антителом?
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 17.09.2017 22:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

И вот, что я еще подумал...

Если я сделаю вот таким путем...
На планшетик поставлю исследуемое антитело напрямую....проинкубирую...потом, белочек Fc....проинкубирую...и потом поликлональное анти-человеческое....

Что скажете?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.09.2017 23:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #33 множественное цитирование

-- А тут говорите, что обратное
Нет НЕ говорю.
Либо вы плохо понимаете русский, либо вы не понимаете о чем я вам толкую.

Верхние коньюгаты с нижними поликлонами НЕ связываются! они связываются с Fc-фрагментами. И нижние с Fc и верхние с Fc. Вам не кажется это интересным и важным для анализа, для понимания, что же будет в этом случае происходить.

Сообщение было отредактировано MMM - 17.09.2017 23:51
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.09.2017 23:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #34 множественное цитирование

(Rob @ 17.09.2017 23:30)
 а если мне верхнее HRP взять не козлиное, а кроликовое,

Не поможет ни кроликовое, ни мышинное, ни лошадинное, ни ослинное.

(Rob @ 17.09.2017 23:30)
или не anti-human, а anti-mouse?


А это уже обсуждалось.
Самоцитируюсь:

(MMM)
Вот если вы будете использовать антимышинный коньюгат, то тогда та часть этого коньюгата, которая узнает Fab фрагменты мыши сможет связаться с оставшимися связанными с нижними античеловеками мышинными химерами.


В этом есть смысл. В этом случае вы увидите только мышинные химеры оставшиеся связанными с нижними антителами.

(Rob @ 17.09.2017 23:30)
Почему вы утверждаете, что исследуюемое человеческое антитело захочет вязаться к поликлональному коньюгированному?.

Потому что поликлональные антитела были получены на человеческие антитела. В состав человеческих антител входит Fc-фрагмент антител человека. В состав исследуемого белка входит,по вашему утверждению, Fc-фрагмент человека. Значит среди клонов поликлональных антител, будут клоны против человеческого Fc- фрагмента и значит они будут связываться с Fc-фрагментом анализируемого белка.

(Rob @ 17.09.2017 23:30)
Оно же сконструировано на связь с белоком, зачем ему бороться за связывание с поликлональным антителом?

На что оно там сконструировано НЕ важно. ВАЖНО, что в нем есть человеческий Fc-фрагмент и он будет узнаваться любыми поликлональным антителами полученными на полную молекулу человеческих антител.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.09.2017 23:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #35 множественное цитирование

(Rob @ 17.09.2017 23:32)
На планшетик поставлю исследуемое антитело напрямую....проинкубирую...потом, белочек Fc....проинкубирую...и потом поликлональное анти-человеческое....
Что скажете?

Фигня!
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 18.09.2017 15:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #36 множественное цитирование

(MMM @ 18.09.2017 00:49)
Ссылка на исходное сообщение  Фигня!


Почему фигня?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.09.2017 16:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #37 множественное цитирование

(Rob @ 18.09.2017 16:16)
Ссылка на исходное сообщение  Почему фигня?

1)Когда вы пытаетесь пришлепнуть белок к пластику здесь не работает биоспецифичность здесь скорее играют роль физико-химические параметры белка.
2)Античеловеческими антителами вы не поймете - где у вас мышечеловеческая химера, а где Fc-содержащий белок.
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 18.09.2017 17:44     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #38 множественное цитирование

Честно вам скажу, что такого конфьюза я еще не встречал..Ведь Директ Элайза, как раз и работает по такой схеме, как я написал. Для чего тогда вообще Элайза тест проводится, если всегда могут возникать противоречия в том, что к чего цепляется.
По классике, на пластик цепляется исследуемый антиген (белокFc), к нему антитело исследуемое, а сверху HRP анти-человеческое.
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 18.09.2017 17:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #39 множественное цитирование

В Элайзе, которую я проводил на предмет определения концентрации, с Вашей помощью....получается, что тоже все наперекосяк!

Покрывал планшетик анти-человеческим UNLB антителом, потом плазма Fc-человеческий из мышки (концентрацию, которого я опрделелял), потом HRP анти-человеческое....Нет, тут вроде все нормально.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.09.2017 18:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #40 множественное цитирование

-Ведь Директ Элайза, как раз и работает по такой схеме, как я написал.

Директ ELISA она для определения антител к антигену.
В ней планшет сенсебилизируется антигеном.
И в данном случае нам плевать, как он там будет на плашку прилипать.
А вот антитела из тестируемой сыворотки к антигену будут прилипать уже биоспецифически и дозозависимо. Так что в такой ИФА никаких претензий.
Вы же таким способом пытаетесь не антитела определить, а антиген, да еще и в смеси с другим антигеном, причем имеющими на определенном участке чуть ли не 100% гомологию.

--Покрывал планшетик анти-человеческим UNLB антителом, потом плазма Fc-человеческий из мышки (концентрацию, которого я опрделелял), потом HRP анти-человеческое....Нет, тут вроде все нормально.

На самом деле там тоже вопрос есть, потому что там и нижние и верхние антитела против одного и того же антигена человеческих антител. И что бы такая схема работала, необходимо что бы нижние антитела узнавали на антигене антигенную детерминанту отличную от антигенной детерминанты, узнаваемой верхними антителами, в противном случае они будут конкурировать за связывание с антигеном.
Но там вообще закрытая система была. Производитель не указывает, что за антитела и против каких антигенных детерминант он использует в своем наборе.

Сообщение было отредактировано MMM - 18.09.2017 18:29
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 18.09.2017 19:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #41 множественное цитирование

(MMM @ 18.09.2017 19:27)
Ссылка на исходное сообщение  -Ведь Директ Элайза, как раз и работает по такой схеме, как я написал.

Директ ELISA она для определения антител к антигену.
В ней планшет сенсебилизируется антигеном.
И в данном случае нам плевать, как он там будет на плашку прилипать.
А вот антитела из тестируемой сыворотки к антигену будут прилипать уже биоспецифически и дозозависимо. Так что в такой ИФА никаких претензий.
Вы же таким способом пытаетесь не антитела определить, а антиген, да еще и в смеси с другим антигеном, причем имеющими на определенном участке чуть ли не 100% гомологию.

[i][/i]



Т.е. если я правильно вас понимаю, если бы сначала на плитку поставил белок, а сверху антитело, то было бы все хорошо. А если вначале антитело, а потом белок, но не правильно? А если негативный контроль....антитело плюс HRP анти-чел антитело не показало связывания. То это как считается? Я это принял, как за правильно спланированный эксперимент, в котором исследуемый белок и исследуемое антитело показали результат связывания.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.09.2017 20:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #42 множественное цитирование

--Т.е. если я правильно вас понимаю, если бы сначала на плитку поставил белок, а сверху антитело, то было бы все хорошо. А если вначале антитело, а потом белок, но не правильно?

Что у вас за каша в голове! Вы определяете антитело и тогда антиген(чистый) можно нанести на планшет. А если вы определяете антиген(грязный в смеси с другими белками) то так не получится.
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 18.09.2017 21:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #43 множественное цитирование

(MMM @ 18.09.2017 21:14)
Ссылка на исходное сообщение  --Т.е. если я правильно вас понимаю, если бы сначала на плитку поставил белок, а сверху антитело, то было бы все хорошо. А если вначале антитело, а потом белок, но не правильно?

Что у вас за каша в голове! Вы определяете антитело и тогда антиген(чистый) можно нанести на планшет. А если вы определяете антиген(грязный в смеси с другими белками) то так не получится.


Полностью с вами согласен...такой каши у меня в голове давно не было...

В случае с директ Элайзой, белок чистый....И какая разница, что наносить в первую очередь...исследуемый белок или исследуемое антитело?
Негативный контроль не показал связывание исследуемого антитела с HRP коньгатом.

Извините, я пока занялся перечитыванием этого топика с самого начала и чем дальше, тем все мрачнее....
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 20.11.2017 16:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #44 множественное цитирование

Здравствуйте друзья!

Есть антитело и есть протеин - Fc. Надо посмотреть их связывающую активность.
Подойдет ли этот кит для измерения?
Т.е. на подготовленный планшет я добавляю свое антитело, инкубирую...потом добавляю белок-Fc, инкубирую...потом биотинилированное антитело, инкубирую...потом стрептавидин, инкубирую...

http://www.abcam.com/ps/products/100/ab100...20(website).pdf
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 20.11.2017 16:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #45 множественное цитирование

Вот схема протокола

Картинки:
картинка: Picture1.png
Picture1.png — (263.93к)   

Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.11.2017 20:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #46 множественное цитирование

Угу! Все по кругу ходите.
Вопрос:
Вы хотите найти некую эффективную концентрацию своего Fc белка?
Или вы хотите сравнить аффинность вашего белка с неким стандартом.

--Т.е. на подготовленный планшет я добавляю свое антитело
Этот номер не пройдет! В данном наборе планшет уже сенсебилизирован и добавить на него чего-то своего не удастся.
Вот нанести свой Fc-белок вы можете. А дальше вас может ждать либо удача, либо разочарование. Если в данном наборе антитела, которыми сенсебилизирован планшет и которые биотинилированы оба работают против Fc фрагмента, но на направлены против разных его участков - все будет хорошо, а вот если хотя бы одно из них направлено против Fab, то вы ничего не увидите.
Участник оффлайн! затвор




 прочитанное сообщение 20.11.2017 21:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #47 множественное цитирование

(MMM @ 14.09.2017 23:40)
Ссылка на исходное сообщение  Я конечно понимаю, что вы русский язык узнали от мамы с папой, которые уехали из России лет эдак 30-40 назад. Но ваша "плитка" очень режет уши. plate  у нас называют планшет или микропланшет и еще иногда планшет для микротитрования ну и  вульгарно плашка.



Затвор




В начале 90-х птички, когда-то упорхнувшие из Физтеха в дальние страны
, стали на недельку - другую наведываться в родные края. Как правило, они
садились на край родного гнезда, заглядывали в него со смесью брезгливости и
жалости, что-то неодобрительно чирикали - и улетали к новым и уже родным
берегам.
Однако- же, дух Физтеха жил почти в каждом: все, или почти все почитали
долгом рассказать о своей работе на семинаре.
Иногда выяснялось, что докладчик подзабыл русскую терминологию. Иногда,
- что ему пришлось полностью сменить тематику, и все термины он учил и знает
только по-английски. Кто немного стеснялся такой ситуации, кто вместе со
слушателями смеялся необходимости переводить слова на родной язык...
Одна из птичек делала доклад по новому прибору, который должен был, по
мнению автора, затмить собой все остальные приборы и, наконец-то, принести
счастье измученному человечеству. Важным элементом нового прибора была
деталь, по-английски называвшаяся gate. Слово это, в зависимости от
контекста, может быть переведено, как "ворота", или " выход", или "застава"
и.т.д. В данном случае русским эквивалентом было слово "затвор".
Когда в первый раз докладчик запнулся и спросил: "Ребята, как нужно
сказать по-русски?", - секретарь семинара подсказал - "затвор". Через минуту
сцена повторилась. Докладчик защелкал пальцами, и сразу несколько голосов из
первого ряда с готовностью помогли: "затвор". Еще через минуту повторение
вызвало смех у аудитории и беспорядочные подсказки со всех сторон. Наконец,
буквально через несколько секунд докладчик споткнулся на тех же граблях. И
тогда откуда-то из середины зала густой бас отчетливо и неторопливо
выговорил: " Затвор, жопа ".
И, о чудо, докладчик продолжил рассказ без всяких затруднений.
Заколдованное слово с легкостью необыкновенной вылетало из уст его. Заодно и
все остальные русские термины с полной отчетливостью всплыли в памяти
докладчика. И, сосредоточившись на принципе работы прибора, слушатели вполне
смогли оценить изящество и красоту идеи.

Это СПАМ!
Это сообщение — спам.
Rob
Участник оффлайн! затвор




 прочитанное сообщение 20.11.2017 21:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #48 множественное цитирование

(MMM @ 14.09.2017 23:40)
Ссылка на исходное сообщение  Я конечно понимаю, что вы русский язык узнали от мамы с папой, которые уехали из России лет эдак 30-40 назад. Но ваша "плитка" очень режет уши. plate  у нас называют планшет или микропланшет и еще иногда планшет для микротитрования ну и  вульгарно плашка.



ммм у меня в принципе папа лет ендак в 1945 брал Берлин eek.gif confused.gif

Это СПАМ!
Это сообщение — спам.
Rob
Участник оффлайн! затвор




 прочитанное сообщение 20.11.2017 22:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #49 множественное цитирование

(MMM @ 18.09.2017 00:49)
Ссылка на исходное сообщение  Фигня!


ммм полностью с Вами согласен у меня дятька моего папы свалил в Париж в Сорбону ссука smile.gif

Это СПАМ!
Это сообщение — спам.
Rob
Участник оффлайн! Rob
Участник



 прочитанное сообщение 20.11.2017 22:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #50 множественное цитирование

(MMM @ 20.11.2017 21:24)
Ссылка на исходное сообщение  Угу! Все по кругу ходите.
Вопрос:
Вы хотите найти некую эффективную концентрацию своего Fc белка?
Или вы хотите сравнить аффинность вашего белка с неким стандартом.

--Т.е. на подготовленный планшет я добавляю свое антитело
Этот номер не пройдет! В данном наборе планшет уже сенсебилизирован и добавить на него чего-то своего не удастся.
Вот нанести свой Fc-белок вы можете. А дальше вас может ждать либо удача, либо разочарование. Если в данном наборе антитела, которыми сенсебилизирован планшет и которые биотинилированы оба работают против Fc  фрагмента, но на направлены против разных его участков - все будет хорошо, а вот если хотя бы одно из них направлено против Fab, то вы ничего не увидите.


Спасибо за ответ...Я верил, что именно Вы мне ответите.
Я хочу посмотреть будет ли мой белок Fc связываться с моим антителом т.к. это антитело сделано с целью споймать именно этот белок Fc...Если смотреть ту картинку, которую я прицепил...Там показала идея, что образец биотинилируется и вуаля...читается...ТАк вот у меня этот "образец" состоит из двух частей: моего антитела, которое я наношу на подготовленный планшет и потом сверху белок Fc...и на него биотинилированное антитело.

Сообщение было отредактировано Rob - 20.11.2017 22:28

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 13.12.17 14:17
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft