Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Нестабильность результатов ПЦР
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! TRIFOLIUM




 прочитанное сообщение 16.09.2017 10:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Добрый день, коллеги. Столкнулась с проблемой нестабильности воспроизводимость амплификации. В мультиплексной реакции есть микросателлит и маркер к целевому гену. Микросателлит как контроль ПЦР, а у маркера доминантная природа. Берем минус и плюс контроль, проводим ПЦР. Микросателлит есть всегда, а маркера к гену то появляется, то исчезает в разных повторностях даже в плюс контроле. В чем может быть причина? Используем смеси ДНК и уменьшенные объемы наборы реактивов для ПЦР. Погрешность реактивов?
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.09.2017 13:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

(TRIFOLIUM @ 16.09.2017 08:39)
Ссылка на исходное сообщение  Добрый день, коллеги. Столкнулась с проблемой нестабильности воспроизводимость амплификации. В мультиплексной реакции есть микросателлит и маркер к целевому гену. Микросателлит как контроль ПЦР, а у маркера доминантная природа. Берем минус и плюс контроль, проводим ПЦР. Микросателлит есть всегда, а маркера к гену то появляется, то исчезает в разных повторностях даже в плюс контроле. В чем может быть причина? Используем смеси ДНК и уменьшенные объемы наборы реактивов для ПЦР. Погрешность реактивов?


Не обращайте внимания на местные разборки.
Что касается Ваших проблем, то причин может быть несколько. Например:
1. Слишком высокая концентрация микросателлитных праймеров приводит к истощению реакционной смеси, и маркёрный апиликон не успевает размножиться.
2. Нестабильность результатов может быть связана со слишком низкой температурой плавления маркёрных праймеров.
3. Тугоплавкие шпильки на маркёрном ампликоне.
4. Неучтённые при расчёте праймеров снипы на матричной ДНК.
5. И т.д., и т.п.

Для решения этой проблемы желательно уменьшить количество микросателлитных праймеров (до 2...4 pM на 20 мкл), добавить энхансер и понизить на 2...4 градуса температуру отжига при термоциклировании. Если не поможет, то придётся проверять праймеры.

Сообщение было отредактировано genseq - 16.09.2017 13:03
Участник онлайн! sceptique
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 17.09.2017 02:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Погрешность дозирования, выделения ДНК, фрагментации ДНК до выделения, химической инактивации шаблона ДНК на любом этапе, недоочистка при выделении ДНК от того или иного ингибитора, потеря ДНК при элюции отмытого с силики в выделении, окисление на хранении полимеразы в связи с частым лазанием за ним в пробирку в атмосфере 20% кислорода и сгоранием всей DTT в буфере хранения, работа в разное время суток с разным температурным режимом термоциклера из-за дрейфа температуры окружающего воздуха (исключено если в лабе кондиционер и/или микроклимат-машина).

Но скорее всего у Вас просто праймеры хреновые. Удлинняйте их и не идите в поток, пока 9 из 10 не начнут получаться. Ваш плюс-контроль внутриреакционный - лажа, если вдуматься. Микросателлиты идут абсолютно всегда, даже когда реакция по спейцифике будет ломаться. Это, кстати, - еще одна причина, по которой ваш целевой продукт не амплифицируется - ферментативной активности в единице объёма хватает на амплификацию только контроля в части случаев (чуть ниже маргинальной границы эффективности по причинам с шаблоном ДНК, описанным выше). И если бы микросателлита не было - хватало бы и на каждую реакцию специфики.
Участник оффлайн! TRIFOLIUM




 прочитанное сообщение 21.09.2017 13:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Спасибо за помощь. В потоке получается 10 % несовпадений между повторностями. Это считается допустимым? Т.е. срабатывает 9 из 10 пробирок наборов реактивов.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 25.09.2017 12:10     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

(TRIFOLIUM @ 16.09.2017 11:39)
Ссылка на исходное сообщение  Добрый день, коллеги. Столкнулась с проблемой нестабильности воспроизводимость амплификации. В мультиплексной реакции есть микросателлит и маркер к целевому гену. Микросателлит как контроль ПЦР, а у маркера доминантная природа. Берем минус и плюс контроль, проводим ПЦР. Микросателлит есть всегда, а маркера к гену то появляется, то исчезает в разных повторностях даже в плюс контроле. В чем может быть причина? Используем смеси ДНК и уменьшенные объемы наборы реактивов для ПЦР. Погрешность реактивов?

Варьируйте количество праймеров для начала.
Например, на микросателлит оставьте количество как отработано, а на "маркер" берите два раз больше. А иногда приходится брать даже в 10 раз больше, но в 20-30-плексах.
А нафига инфа про доминантную природу "маркера"? Лучше бы про копийность что-нибь сказали. confused.gif

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 25.09.2017 12:28
Участник онлайн! sceptique
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 26.09.2017 15:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

автор не скажет, но я предположу за него:

- автор не может варьировать пары праймеров, поскольку работает как 90% его коллег готовым набором, думаю, лиофильно высушенным и "оптимизированнымсертифицированнымзарегистрированнымымдыбрЪ". Производитель не произвел оптимизацию по хранению, поскольку для этого год нужен, а у кого он есть сейчас? И плохо оптимизировал условия и скорее всего на другом приборе.
- кажущаяся копийность контролей у него раз в миллиард, думаю, превышает копийность геномки, которая, как и у всех, 10-70 тыс. копий на плохо оптимизированную реакцию. "Маркер" и "микросателлит" наверняка "выбраны" разные по длине и ГЦ-составу, что еще более усугубляет ситуацию. Подписи контроля качества на реагентах наверняка нет и предъявить претензии некому, или этот некто находится за границей и тихо ржет как эти русские еще что-то ПЦРят с передержанных на комнатной температуре 2 месяца при ввозе на таможне реагентов.

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 18.12.17 14:07
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft