Ув. коллеги!Некоторое время тому назад(29.06.01 - 10.01.02) на
Форуме состоялась дискуссия "PCR - странная кинетика".Основные
выводы сводились к следующему 1.В ходе PCR ,при нагревании до94 -
96 град. нет полной денатурации ДНК.Образуются однонитевые петли и расходятся нити на концах фрагмента.На однонитевые участки на
концах "шлепаются" праймеры,присоединяется полимераза.
2.По мере понижения температуры присходит практически мгновенная ренарурация(как застежка "молния").По достижении подходящей темп-
ературы начинается синтез ДНК.При этом реализуется "расплетающая"
активность полимеразы("Metalluger")и т.д.
Так вот.Когда я попытался докладывать все это у себя в конторе
,то отношение было весьма скептическое.При этом конкретных возра-
жений как бы не было, но слышен был рефрен - "мы что-то такого не
читали нигде".Вопрос - а как на самом деле - кто,где об этаком
читал ,и вообще - насколько банальна эта конструкция.
tamm

Я не молекулярный биолог, но по-моему при 96-94 градусах происходит Бета денатурация, т.е. не только раскручивание ДНК (Альфа денатурация), но и ее разделение на две цепи.А вдруг "Шлепаться" праймерам нужно не в разошедшемся конце фрагмента, а в его середине, который по вашей теории "Застегнутая молния"? О "Расплетающей" активности полимеразы тоже ничего не слышал, да и в конце-концов она полимераза, а не расплетаза. Было мнение других на этот счет услышать.
Шоны Грюсы из Ганновера

В естественных усл-ях полимераза действительно имеет некоторую расплетающую активность, так как в природе не все нагревается до 95 градусов. В ПЦР такой вариант возможен, но маловероятен из-за слишком сильной "модельности" системы.

Вообще говоря, некоторые полимеразы весьма эффективны в плане strand displacement. Тут это тоже обсуждалось (phi29). Однако, Pfu, Taq и иже с ними в этом отношении достаточно слабы. Однако и ДНК при 72 градусах не так уж и стабильна. Я думаю, что вопрос интересный, но до конца не понятный. Поэтому и не читали нигде. Не написано.

Это ж гипотеза!
Хоть стреляйте, не помню, где читал, в какой-то нашей книжке именно в применении к ПЦР. Речь шла о том, что если при удлинении цепи в стречается налипший праймер в том же направлении происходит именно strand displacement.
Как я понимаю изотермические ПЦР типа rolling circle проходят именно при условии strand displacement, хотя я в этом не специалист.
Да и правильно отметил Veshka, что спираль ДНК при 72 - это не то же, что и при 37 градусах - локальное плавление AT богатых участков.

Ув. коллеги!С Вашего разрешения кое-что напомню.
1.ДНК,взятая из "PCRmix"(на15-45цикле)в конце стадии денатурации
(95гр.) и нанесенная на форез не отличалась(совсем) от ДНК в конце стадии синтеза(72гр.).

2.Та же ДНК прокипяченная(100гр.) 3 минуты давала расплывчатое пятно(а не узкую зону,как в п.1).Т.е. уже на глаз совершенно другую картину(соответствующую "истинной" денатурации - с расхождением нитей)
3.Для объяснения этих данных,я(мы) вынужденны были предположить:
а.За время от взятия аликвоты из "PCRmix" до нанесения на форез
(в ср. 2мин.) происходит ренатурация.Поэтому я и назвал ее "мгно-
венной".А так быстро ренатурация может происходить только,если
денатурация не была полной и срабатывает механизм "молнии ".Кон-
троль в п.2
в.Раз есть ренатурация и перед нами нормальный дуплекс - приходится(!) предположить расплетающую активность.А как иначе?
tamm

Надо попробовать ПЦР с денатурацией не 95 градусов.

Повышать?Во первых, накроется фермент очень скоро.Во-вторых уже
имеющиеся данные это не изменит(т.е. их все равно надо как-то
объяснять).А в третьих - действительно интересно,а пойдет ли
вообще PCR после денатурации с расхождением цепей.Надо подумать как это сделать.Понижать - не вижу смысла.
tamm

Странное дело - писания о нефтяных пленках буквально приковывали к себе внимание...Что-то не то творится в датском королевстве...