Вопрос такой кто-нибудь работал с apoptosis detection kit на annexin V от
biovision
Есть проблеми с протоколом, в инструкции сказано просто разведите антитело
в binding buffer и проинкубируйте клетки в течении 5 мин. Посмотрел
в pubmed люди восновном работают с этим китом для FACS анализа,
мне же нужно посмотреть апоптотические клетки на слайде, я заражаю
клетки аденовирусом и смотрю приводит ли активация моего гена к апоптозу.
Вообшем в моих руках апоптотических клеток вообще невижу даже
там где положительний контроль.
Буду очень признателен если у кого-нибудь есть протокол как это делать.
 
| |
[ Вход | Регистрация ]
|
Annexin V apoptosis
nick25, 09.05.2005 23:07
gostya, 09.05.2005 23:10
tam nado mozhet permeabilizatsiyu delat, nu i kletki fiksirovat' i t.d.
nick25, 10.05.2005 01:39
В том то и дело что пермеализация или фиксация она повреждает клеточную
мембрану и тогда поялвяется неспецифика, которая весь сигнал перекроет
мембрану и тогда поялвяется неспецифика, которая весь сигнал перекроет
gostya, 10.05.2005 05:36
http://www.biovisionlabs.com/pdf/1001-1000.pdf
если у вас fitc, то он быстро выгорает
если у вас fitc, то он быстро выгорает
AE, 10.05.2005 11:10
(nick25 @ 09.05.2005 22:07)
Вопрос такой кто-нибудь работал с apoptosis detection kit на annexin V от biovision
Есть проблеми с протоколом, в инструкции сказано просто разведите антитело
в binding buffer и проинкубируйте клетки в течении 5 мин. Посмотрел
в pubmed люди восновном работают с этим китом для FACS анализа,
мне же нужно посмотреть апоптотические клетки на слайде, я заражаю
клетки аденовирусом и смотрю приводит ли активация моего гена к апоптозу.
Вообшем в моих руках апоптотических клеток вообще невижу даже
там где положительний контроль.
Буду очень признателен если у кого-нибудь есть протокол как это делать.
Какие клетки? Что является позитивным контролем?
А вы сразу растите свои клетки на покровном стекле? Вы уверены, что они не открепляются когда уходят в апоптоз? Довольно распространенное явление. Попробуйте собрать все и открепленные и прикрепленные клетки (трипсином или edta) до кучи и просто посмотреть с PI увеличивается ли количество PIpos.
Попробуйте также посмотреть апоптоз по другому, например померяйте каспазы.
Дядя ФАКСер, 10.05.2005 12:41
(nick25 @ 09.05.2005 21:07)
Вопрос такой кто-нибудь работал с apoptosis detection kit на annexin V от biovision
Есть проблеми с протоколом, в инструкции сказано просто разведите антитело
в binding buffer и проинкубируйте клетки в течении 5 мин. Посмотрел
в pubmed люди восновном работают с этим китом для FACS анализа,
мне же нужно посмотреть апоптотические клетки на слайде, я заражаю
клетки аденовирусом и смотрю приводит ли активация моего гена к апоптозу.
Вообшем в моих руках апоптотических клеток вообще невижу даже
там где положительний контроль.
Буду очень признателен если у кого-нибудь есть протокол как это делать.
Та-а-ак.
Ну во- первых - зайдите на такие сайты, как:
http://www.probes.com
http://www.bd.com
http://coulter.com
и им подобные- найдете много интересного.
А во-вторых - ну ведь такой же кондовый метод - как с ним могут проблемы возникнуть?
А в третьих, Аннексин-V - не антитело
Дядя ФАКСер, 10.05.2005 12:42
(gostya @ 09.05.2005 21:10)
tam nado mozhet permeabilizatsiyu delat, nu i kletki fiksirovat' i t.d.Я плакалЪ...
гость: g, 10.05.2005 16:59
nu ne nado permebealization, no eto redko tak byvaet
MHC II, 10.05.2005 19:58
Дядя как всегда опередил....Кстати Аннехин далеко не самыи надежныи маркер апоптоза. Сеича люди смотриат атиквность каспаз, Поисчите в гугле [Oncoimmune Inc], наидете там про дететсию кастасы-3 для клеток на слаиде
MHC II, 10.05.2005 20:00
(гость: g @ 10.05.2005 08:59)
ну не надо пермебеализатион, но это редко так бывает Как раз для детектсии апоптоза чаще всего клетки не фиксируют и пермобилизируют...
Glebber, 10.05.2005 20:13
nick25, 10.05.2005 22:11
Я работаю с HC-11 клетками , да сразу ращу на слайде, по поводу открепления
хорошая идея, но я вижу на слайде много даже мертвих клеток, наверное
попробую посмотреть каспазы, я на самом деле не уверен что мой ген
будет вызивать апаптоз в этои системе, у меня есть другие данные in vivo по поводу
его, полозительнии контроль просто эти же клетки инкубированние в среде без сыворотки, так
по крайней мере вызывают апоптоз другие исследователи, ссылки счас посмотрю
может чего найду. Аннехин я делаю cy-3, это красниq фильтр
хорошая идея, но я вижу на слайде много даже мертвих клеток, наверное
попробую посмотреть каспазы, я на самом деле не уверен что мой ген
будет вызивать апаптоз в этои системе, у меня есть другие данные in vivo по поводу
его, полозительнии контроль просто эти же клетки инкубированние в среде без сыворотки, так
по крайней мере вызывают апоптоз другие исследователи, ссылки счас посмотрю
может чего найду. Аннехин я делаю cy-3, это красниq фильтр
imers, 11.05.2005 01:46
(nick25 @ 10.05.2005 20:11)
полозительнии контроль просто эти же клетки инкубированние в среде без сыворотки, такпо крайней мере вызывают апоптоз другие исследователи
Да, интересно - и долго их без сыворотки нужно для этого держать? А то я на ночь оставляла в бессывороточной - и все с ними ОК было. Правда, клетки другие. Просто для себя узнать интересно!
А чего б апоптоз какой-нить перекисью водорода не вызвать?
gostya, 11.05.2005 02:55
я знаю для p53, чтобы вызвать апоптоз, клетки облучают УФ
AE, 11.05.2005 12:09
полозительнии контроль просто эти же клетки инкубированние в среде без сыворотки,
Беглый просмотр первых десяти ссылок выдаваемых гуглем на hc-11 apoptisis
привел меня к выводу, что нужно скорее убирать инсулин из среды. При этом и ждать нужно довольно долго. Вроде как есть и другие методы вызвать у ваших клеток апоптоз.
Для НepG2 я в свое время использовал добавление дезоксихолата. Не знаю на счет покраски с аннексином, но активация каспаз и Dioc6-low популяция при этом детектируется на раз.
Аннехин я делаю cy-3, это красниq фильтр
При этом вы лишаетесь возможности комбинировать эту окраску с PI.
natusik, 11.05.2005 15:27
с этими клетками не работала, но у HeLa, недифференцированных mouse embryonic cells и у mouse embryonic fibroblats апоптоз вызываем на раз актиномицином Д, стауроспорином, перекисью водорода и УФ. Сама вот этими руками снимала и time-course и dose-dependent.
Клетки легочного эпителия оказались очень даже устойчивыми к этим воздействиям.
Меряю одновременно на флоу экстернализацию PS (на FACScane первый "зеленый" канал, потому как третий "красный" идет на PI) и каспазы отдельным китом и не на флоу (рыдает в три ручья, потому как другим китом на хемилюминометре геморройно и надо на белок нормализовать).
С перекисью водорода надо быть осторожнее, в зависимости от концентрации каспазы ингибируются.
Клетки легочного эпителия оказались очень даже устойчивыми к этим воздействиям.
Меряю одновременно на флоу экстернализацию PS (на FACScane первый "зеленый" канал, потому как третий "красный" идет на PI) и каспазы отдельным китом и не на флоу (рыдает в три ручья, потому как другим китом на хемилюминометре геморройно и надо на белок нормализовать).
С перекисью водорода надо быть осторожнее, в зависимости от концентрации каспазы ингибируются.
natusik, 11.05.2005 15:29
что касается изнаального вопроса, думаю, либо положительный контроль плох (а Вы уверены, что вызвали апоптоз?), либо таки не надо клетки фиксировать, либо FITC выцветает (что менее вероятно)
nick25, 13.05.2005 19:09
Без сыворотки я держу клетки 4 дня чтобы вызвать апоптоз, по краинеи мере
так нашел в статьях, да PI не могу использовать, но вихода другого нет
вирус которым я заражаю несет мои белок как fusion с GFP, перекисью
попробую конечно . Всем большое спасибо за советы
так нашел в статьях, да PI не могу использовать, но вихода другого нет
вирус которым я заражаю несет мои белок как fusion с GFP, перекисью
попробую конечно . Всем большое спасибо за советы
Guest, 17.05.2005 14:47
(nick25 @ 09.05.2005 23:07)
Вопрос такой кто-нибудь работал с apoptosis detection kit на annexin V от biovision
Есть проблеми с протоколом, в инструкции сказано просто разведите антитело
в binding buffer и проинкубируйте клетки в течении 5 мин. Посмотрел
в pubmed люди восновном работают с этим китом для FACS анализа,
мне же нужно посмотреть апоптотические клетки на слайде, я заражаю
клетки аденовирусом и смотрю приводит ли активация моего гена к апоптозу.
Вообшем в моих руках апоптотических клеток вообще невижу даже
там где положительний контроль.
Буду очень признателен если у кого-нибудь есть протокол как это делать.
dlja polojitelnogo kontrolja lutshe UV Chem sivorotka. FITC vimiraet esli ne analizirovat nepremenno ili mojno na -20 derjat max 1 week v mounting medium...
AnNaKa, 10.04.2018 10:53
Здравствуйте!
Прошу помощи по теме. Как влияет на клеточную мембрану трипсинизация? В протоколах анализа апоптоза с помощью аннексина всюду используют суспензионные культуры.. У кого какой опыт анализа монослойных культур?
Спасибо!
Прошу помощи по теме. Как влияет на клеточную мембрану трипсинизация? В протоколах анализа апоптоза с помощью аннексина всюду используют суспензионные культуры.. У кого какой опыт анализа монослойных культур?
Спасибо!
watchesbiz, 20.11.2021 18:04
watchesonline89, 26.12.2022 11:39
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.