Полная версия страницы  English  

поставщики реактивов ПЦР

NathalieK, 19.11.2008 13:00
последнее время поставляют некачественную полимеразу - недовольны не только наши сотрудники, но и коллеги из др мест. Где вы покупаете полимеразу, чтобы к ней не было претензий, - хорошую?
особенно если есть такие места в питере..
kb, 20.11.2008 16:11
Силекс, Евроген, Бионем, Изоген... Правда это в Москве
mb vpp2000, 20.11.2008 19:47
Дилат, Москва
Воронин Михаил Васильевич
499 613 2362
genseq, 21.11.2008 14:41
Диалат!

http://www.molbiol.ru/forums/lofiversion/i....php/t7396.html
genseq, 21.11.2008 14:44
Кстати, о полимеразе.

Кто поставляет KlenTaq? Но только не "обрубок" с пониженной термостабильностью, а мутантную форму, которая хорошо держит температуру. И желательно с горячим стартом. А то уже надоело выискивать бесшпилечные зоны при расчёте праймеров.
Ъ, 21.11.2008 15:45
(genseq @ 21.11.2008 13:44)
Ссылка на исходное сообщение  Кстати, о полимеразе.

Кто поставляет KlenTaq? Но только не "обрубок" с пониженной термостабильностью, а мутантную форму, которая хорошо держит температуру. И желательно с горячим стартом. А то уже надоело выискивать бесшпилечные зоны при расчёте праймеров.

А у Матвеича какой (какие) confused.gif frown.gif А в лабе Матвиенко в ПУщине какой? Ты же все знаешь, Генсек! smile.gif
Ъ, 21.11.2008 15:46
(genseq @ 21.11.2008 13:44)
Ссылка на исходное сообщение  Кстати, о полимеразе.

Кто поставляет KlenTaq? Но только не "обрубок" с пониженной термостабильностью, а мутантную форму, которая хорошо держит температуру. И желательно с горячим стартом. А то уже надоело выискивать бесшпилечные зоны при расчёте праймеров.

Плохому танцору ... lol.gif
kb, 21.11.2008 15:55
(genseq @ 21.11.2008 13:44)
Ссылка на исходное сообщение  Кто поставляет KlenTaq? Но только не "обрубок" с пониженной термостабильностью, а мутантную форму, которая хорошо держит температуру. И желательно с горячим стартом. А то уже надоело выискивать бесшпилечные зоны при расчёте праймеров.


Думаю, что в Москве "на заказ" Клентаку могут поставить многие фирмы включая и Диалат, но источник фермента вероятно будет один и тот же
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=M...=/sdarticle.pdf
Ъ, 21.11.2008 16:54
(kb @ 21.11.2008 14:55)
Ссылка на исходное сообщение  Думаю, что в Москве "на заказ" Клентаку могут поставить многие фирмы включая и Диалат, но источник фермента вероятно будет один и тот же
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=M...=/sdarticle.pdf

Вот именно, а Генсек видно только что родился. smile.gif
Guest, 21.11.2008 17:16
(genseq @ 21.11.2008 13:44)
Ссылка на исходное сообщение  Кстати, о полимеразе.

Кто поставляет КленТая? Но только не "обрубок" с пониженной термостабильностью, а мутантную форму, которая хорошо держит температуру. И желательно с горячим стартом. А то уже надоело выискивать бесшпилечные зоны при расчёте праймеров.


а ты посади шпильку прям на праймер smile.gif чтоб клентаку в ступпор вогнать smile.gif
Ъ, 21.11.2008 17:39
(Guest @ 21.11.2008 16:16)
Ссылка на исходное сообщение  а ты посади шпильку прям на праймер  smile.gif чтоб клентаку в ступпор вогнать  smile.gif

Садист. mad.gif
genseq, 21.11.2008 23:31
(Ъ @ 21.11.2008 13:54)
Ссылка на исходное сообщение  Вот именно, а Генсек видно только что родился. smile.gif


У Матвеича KlenTaq брал. Правда, давненько это было. Ещё при социализме frown.gif . Работала очень неплохо. Брал и в других местах, но нарывался на нестабильную weep.gif .

Матвиенко весной похоронили. Очень жаль. Таких людей не много. Надеюсь, что в его лаборатории жизнь ещё теплится, но дойти до соседнего института всё как-то не соберусь.

За наивность вопроса прошу прощения redface.gif . Просто неоднократно убеждался, что на этом форуме чем наивнее вопрос, тем больше можно получить полезной информации wink.gif .

Конечно, и проще, и надёжнее обратиться к Матвеичу. Скорее всего, так и сделаю. Но что мешает забросить удочку и в этой заводи? То, что мне уже стыдно учиться?

"Антон Палыч Чехов Как-то раз заметил,
Что умный любит учиться, а дурак учить."
.................................................. Б. Окуджава
NathalieK, 24.11.2008 16:55
ну да
e.coli, 27.11.2008 18:46
Два фореза один сделан вчера другой сегодня. Оба - PCR c плазмидной ДНК (4,7 kb + 1 kb insert). Первый - pfx platinum (Invitrogen), второй - taq (Fermentas). Первая, вторая дорожки - праймеры фланкирующие ORF, третья - 217 нуклеотидная последовательность внутри ORF, пятая - vector sequencing primers от поставщиков (фланкируют вставку на расстоянии ~100 bp от 5' и 3' концов соответственно) Что мне понятно - бенд на 3й дорожке, отсутствие продукта на 1, 2 (думаю можно найти объяснения - условия реакции, праймеры...) и 4й дорожках. Что вызывает сомнения, но объяснимо - бенд в ~ 200-300 bp на пятой (видимо часть ДНК - вектор не несущий вставки, но где тогда вставка?). Чего не понимаю - полосы в ~ 8 000, 10 000 и > 10 000 на каждой дорожке (исходная ДНК? чего такая большая?) На втором форезе видны полосы в районе 1000 нуклеотидов - нужный продукт, наряду с этим присутствует неспецифика...причем во всех случаях, включая и заводские праймеры к вектору. Хотелось бы услышать ваше мнение.

P.S.: Не думайте пожалуйста, что я пытаюсь решить свои проблемы за счет других - мне просто действительно интересно что это - некачественная полимераза, кривые руки (это можно не обсуждать, подразумеваю это по умолчанию), плохое знание вопроса (без вопросов))) или еще что-то, о чем я не подумал.
Ъ, 28.11.2008 16:12
(e.coli @ 27.11.2008 17:46)
Ссылка на исходное сообщение  Два фореза один сделан вчера другой сегодня. Оба - PCR c плазмидной ДНК (4,7 kb + 1 kb insert). Первый - pfx platinum (Invitrogen), второй - taq (Fermentas).

Если и Fermentas с хот-стартом, остается грешить на праймеры, особенно на секвенирующие, они точно не для ПЦР (и кто их, таких уродов, выбирал confused.gif всегда поражаюсь).
Плазмиду надо брать очень мало, доли пикограммов.
Ситемы буферные разные и, соответственно, Т отж. разная. У Pfx явно ниже нормы.
Иногда ОДИН праймер в ПЦР дает полосы больше 10 кб ... в чистой воде. umnik.gif
До клонирования праймеры с рамки работали?
Guest, 28.11.2008 17:08
(Ъ @ 28.11.2008 15:12)
Ссылка на исходное сообщение  Если и Fermentas с хот-стартом, остается грешить на праймеры, особенно на секвенирующие, они точно не для ПЦР (и кто их, таких уродов, выбирал confused.gif всегда поражаюсь).
Плазмиду надо брать очень мало, доли пикограммов.
Ситемы буферные разные и, соответственно, Т отж. разная. У Pfx явно ниже нормы.
Иногда ОДИН праймер в ПЦР дает полосы больше 10 кб ... в чистой воде. umnik.gif
До клонирования праймеры с рамки работали?


Спасибо за ответ. Нет, Fermentas без хот-старта. С плазмидой видимо вышел перебор...)) У pfx т. отж. 55 град. Честно говоря, я был очен удивлен тем, что она не работает. Причем не только у меня. Первый "тревожный сигнал" поступил от коллеги - она делала ПЦР с pfx c праймерами которые давали нужный продукт с pfu и taq получила шмер, без каких-либо признаков продукта. С рамки работали только контрольные праймеры, те что на обоих форезах дают полосу в 217 бп. Остальные - нет. Собственно, я грешил на то, что неправильно их подобрал, и они не работают. Однако на втором форезе, насколько могу видеть сработали оба. Меня очень взволновал)) тот факт, что "ОДИН праймер в ПЦР дает полосы большие 10 кб...в чистой воде" Магия? Как это объяснить? Тем более, на всех дорожках полосы идентичные. Хотя их положение на разных форезах - разное. Не понимаю если честно.
kb, 28.11.2008 18:01
(Guest @ 28.11.2008 16:08)
Ссылка на исходное сообщение  У pfx т. отж. 55 град. Честно говоря, я был очен удивлен тем, что она не работает. Причем не только у меня.


Pfx как и любая другая полимераза из археобактерий вещь капризная, и использование этой и подобных полименаз связано с некоторыми тонкостями. Поэтому если нет крайней необходимости - используйте Taq (в Вашем случае нужен еще ХотСтарт и/или бетаин 1,5-2М). Если нужна высокая точность синтеза, то вместо Pfx можно попробовать Phusion (NEB) или Tersus (Evrogen). Tersus кстати делает ХотСтарт да и цена у него дружелюбнее будет.
Ъ, 28.11.2008 18:05
(Guest @ 28.11.2008 16:08)
Ссылка на исходное сообщение   Меня очень взволновал)) тот факт, что "ОДИН праймер в ПЦР дает полосы большие 10 кб...в чистой воде" Магия? Как это объяснить? Тем более, на всех дорожках полосы идентичные. Хотя их положение на разных форезах - разное. Не понимаю если честно.

Никакая не магия, а побочные реакции "неспецифические", которые идут по неведомому механизму, отличному от ПЦР. Кстати, картинки будут другие, если ПЦР поставите на быстрых циклерах.
Рекомендую поставить ПЦР с 1 М бетаином. Возможно при этом придется снизить Т отж., на 2-4 оС
Ъ, 28.11.2008 18:09
Килобаза прав. smile.gif
guest: e.coli , 28.11.2008 18:35
Спасибо огромное за исчерпывающую информацию. О betaine недавно как раз прочел, но еще не использовал. Phusion в лабе есть. Попробую с ним. Да я еще хотел уточнить по поводу вот этой фразы "...особенно на секвенирующие, они точно не для ПЦР (и кто их, таких уродов, выбирал confused.gif всегда поражаюсь)..." Я правильно понимаю - это значит что качество этих праймеров как правило низкое, т.е. в большинстве случаев? Спасибо.
Ъ, 28.11.2008 18:54
(guest: e.coli @ 28.11.2008 17:35)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо огромное за исчерпывающую информацию. О betaine недавно как раз прочел, но еще не использовал. Phusion в лабе есть. Попробую с ним. Да я еще хотел уточнить по поводу вот этой фразы "...особенно на секвенирующие, они точно не для ПЦР (и кто их, таких уродов, выбирал confused.gif всегда поражаюсь)..." Я правильно понимаю - это значит что качество этих праймеров как правило низкое, т.е. в большинстве случаев? Спасибо.

e.coli все-таки ОН. smile.gif
"Качество" - не совсем верное вырвжение. Состав или, как говорят по-модному, дизайн не тот - 3-штрих концы праймеров очень сильно насыщены GC. Даже программа не выбрала бы такие праймеры. smile.gif
e.coli, 28.11.2008 19:32
(Ъ @ 28.11.2008 17:54)
Ссылка на исходное сообщение  e.coli все-таки ОН. smile.gif
"Качество" - не совсем верное вырвжение. Состав или, как говорят по-модному, дизайн не тот - 3-штрих концы праймеров очень сильно насыщены GC. Даже программа не выбрала бы такие праймеры. smile.gif


Ну да, хотелось избежать выражения "дизайн". А в остальном, вы как в секвенатор глядели)))
Ъ, 29.11.2008 14:09
(e.coli @ 28.11.2008 18:32)
Ссылка на исходное сообщение  Ну да, хотелось избежать выражения "дизайн". А в остальном, вы как в секвенатор глядели)))

beer.gif beer.gif
e.coli, Вам готовые ПЦР мастермиксы под Ваши праймеры и матрицу нужны? Если Вы в России, отправлю. Получите через пару дней. confused.gif
e.coli, 01.12.2008 14:48
(Ъ @ 29.11.2008 13:09)
Ссылка на исходное сообщение  beer.gif  beer.gif
e.coli, Вам готовые ПЦР мастермиксы под Ваши праймеры и матрицу нужны? Если Вы в России, отправлю. Получите через пару дней.  confused.gif


Нет, я не в России. Но все -равно спасибо)))
Guest, 02.12.2008 17:17
(guest: e.coli @ 28.11.2008 17:35)
Ссылка на исходное сообщение  О betaine недавно как раз прочел, но еще не использовал. Phusion в лабе есть. Попробую с ним.


И как Phusion? Помог? или один шмер нарисовал?
Guest, 14.01.2009 21:46
Коллеги, где бы найти концентрации реагентов в мастермиксе Roche "Light Cycler Fast Start DNA Master (plus) SYBR Green 1" ?- BSA определить нетрудно, если концентрация фирмой не сообщалась, но сколько там SYBRа, нуклеотидов и единиц фермента? mol.gif
Хочу попробовать смесь без UTP, потому что два из моих MAGE-сиквенсов амплифицируются с UTP куда хуже, чем со "стандартной" смесью - а другие праймеры искать проблематично из-за большой гомологии среди MAGE.
Ъ, 15.01.2009 12:27
(Guest @ 14.01.2009 20:46)
Ссылка на исходное сообщение  Коллеги, где бы найти концентрации реагентов в мастермиксе  Roche "Light Cycler Fast Start DNA Master (plus) SYBR Green 1" ?- BSA определить нетрудно, если концентрация фирмой не сообщалась, но сколько там  SYBRа, нуклеотидов и единиц фермента? mol.gif
Хочу попробовать смесь без UTP, потому что два из моих MAGE-сиквенсов амплифицируются с UTP куда хуже, чем со "стандартной" смесью - а другие праймеры искать проблематично из-за большой гомологии среди MAGE.

Боюсь, что нигде.
Guest, 16.01.2009 01:09
(Ъ @ 15.01.2009 11:27)
Ссылка на исходное сообщение  Боюсь, что нигде.
- weep.gif
А какой-нибудь проверенный мастер микс с SYBR Green 1 есть на примете для Light Cycler 2.0? - чтобы со стандартными нуклеотидами, без УТФ, и желательно c модифицированной hotstart полимеразой, а не заингибированной антителами ( у меня в реакционной смеси ДМСО - у антител, как утверждается в сопроводиловке, это снижает аффинность ).
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2014 Invision Power Services, Inc.