Полная версия страницы  English  

ПДРФ и сиквенс

Allysy, 21.01.2005 10:33
Вопрос следующий:
1.после ПЦР образуется несколько продуктов, мне нужен один из них для рестрикции. если просто элюировать из геля, то окраска бромистым этидием и УФ-воздействие (при просмторе на трансэлюминаторе) не повлияет дурно на ДНК?
2.если будет необходимость просеквнировать этот участок, то опять таки как быть?
Anonymous, 21.01.2005 15:47
на второй вопрос.
1. выделяете Дднк из геля, нужный вам бэнд.
2. используете его как матрицу для повторного синтеза

-пробирку с вырезанным куском геля опускаете в жидкий азот, на ~20``
-центрифугируете при 14 то 6`
-забираете жидкость в новую проб, с азотом можно повторить
- теперь чистка, полвина объема ацетата аммония 7,5М, 2 объема спирта 80%.
- центрифуга 14то 12`
- супернатант удаляем, внизу ДНК, и два раза спиртом 80%.
- спирт испарить, водички добавить, днк растворить
и вот это использовать как матрицу.
Anonymous, 21.01.2005 16:44
1)Бромистый этидий обычно дурно на ДНК не влияет, чего нельзя сказать про УФ. Просмотр на трансиллюминаторе и вырез нужной полосы необходимо делать очень быстро, если передержать, то даже переамплификация с этого фрагмента не идет. Помогает уменьшение интенсивности облучения при помощи обычных прозрачных файлов для бумаг. Т.е под гель кладете 4-6 слоев файлов.
2) После выделения полоски из геля и повторного синтеза не удивляйтесь, что остальные полоски тоже появятся, просто та, что вы вырезали и выделяли будет намного интенсивнее. Это происходит, поскольку полосу на геле вы видите в том месте, где находится пик ее концентрации, однако более низкая концентрация распределена почти по всему гелю, что вы и обнаружите после переамплификации.
3) Для получения хорошего сиквенса в этой ситуации я бы все же порекомендовала заклонировать нужный фрагмент и провести скрининг клонов, дабы найти нужный по длине.
Anton Markov, 22.01.2005 14:43
Полоностью согласен с Ольгой Л. Могу сказать, что УФ сильно на сиквенсе не сказывается, т.к. даже если разрывы возникают, то это практически не вредит реакции. А вообще, когда у вас несколько продуктов, то действительно, перед сиквенсом лучше заклонировать - иначе м.б. не очень чистый сиквенс и ненужные сомнения. НО НИКОГДА не делайте реаамплификацию для сиквенса!!! Только если у вас СУПЕРточная полимераза - мутации накапливаются очень успешно (особенно если пользуетесь Taq) и потом будете уверены, что у вас там мутация, хотя ее в исходном образце и не было.
SergeyR, 24.01.2005 14:43
Если ПЦР продукт окрашен этидием, то УФ ему не страшен, т.к. этидий "перехватывает" УФ излучение и испускает его в красном свете.
Переамплифицированный бэнд смело отдавайте на сиквенс (если нет неспецифики) т. к. ошибки полимеразы видны практически не будут (чтоб 50% букв в одном локусе были ошибочны, надо на ПЦР нанести ОДНУ копию ДНК и чтоб ошибка появилась в ПЕРВОМ цикле - такое событие крайне маловероятно), а вот если вы заклонируете "ошибочную" копию, то ошибка будет в 100%, так что при клонировании лучше сиквенировать несколько клонов (для надежности)
Anonymous, 24.01.2005 16:14
Ну не знаю что там этидий "перехватывает", но у меня после 2-3х минут рассматривания и фотографирования геля на трансиллюминаторе переамплификация с этого куска уже не шла. А секвенировать после клонирования действительно лучше сначала 2 клона, если что-то не совпадает - тогда третий для выяснения истины (и уж, конечно, для амплификации взять полимеразу поточнее).
SergeyR, 24.01.2005 16:37
to Ольга Л.
Вероятно у Вас слишком мощный трансиллюминатор, в любом случае 3 минуты жарить ДНК перед переамплификацией не стоит, достаточно нескольких секунд для того, чтоб ткнуть носиком от пипетки в соответствующий бэнд и прополоскать его (носик) в ПЦР премиксе. После этого переамплификация проходит на ура.
Carbon Copy, 24.01.2005 22:24
Увеличить специфичность ПЦР путем поднятия температуры отжига и не париться. Либо, сменить праймеры. При переамплификации неспецифики закономерным результатом будет та же неспецифика, секвенировать которую невозможно - двойные пики и все прочие удовольствия.
DmitriM, 25.01.2005 04:14
Наносите половину реакционной смеси в одну лунку, половину - другую. С одной из лунок оперируете - смотрите, фотографируете и т. д., а из второй вырезаете Ваш фрагмент. Совместив и вырезав то же место. Потом проверьте, посмотрев гель после вырезания нужной полосы - что ее там нет уже.
А секвенировать ИМХО лучше с заклонированного продукта. Особенно если потом все равно клонировать куда-нибудь.

[Текст переведён с транслита]
gostya, 25.01.2005 05:38
а что такое ПДРФ (в названии темы)?
Allysy, 25.01.2005 07:53
Большое всем спасибо. Только еще вопрос а для рестрикции можно просто выделить из геля и все, без реамплификации?
genseq, 25.01.2005 10:38
Автор - gostya:
а что такое ПДРФ (в названии темы)?
ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов.

Для вырезания из геля должен хорошо подойти Dark Reader
http://www.clarechemical.com/transilluminator.htm
http://www.clarechemical.com/ethidium.htm

Он работает на синем освещении и должен ДНК повреждать намного меньше. Сам давно мечтал сделать такой осветитель. Уже собрал все комплектующие, но руки пока не доходят weep.gif .

За неимением неповреждающего трансиллюминатора делайте по-старинке, как описано выше - разрезаете эл. дорожку пополам и освещаете одну половинку, а ДНК вырезаете из другой.
DmitriM, 26.01.2005 00:11
Аллысы: Если колихества позволяют, то не мона, а нуно.

[Текст переведён с транслита]
Monstera, 31.01.2005 16:06
Я выделяла ПЦР-продукт из геля как раз для секвенирования. Ничего, секвенировалось нормально. Чтобы ДНК сильно не страдала, добавляете поменьше этидия и кладете гель на тонкое стеклышко, чтобы чуть-чуть светилось. Ну и быстро все это делаете. Хотя может быть, это перестраховка.
Den, 31.01.2005 21:01
Ясное дело, перестраховка. Никогда не занимался фигней с совмещением дорожек, подкладыванием пленки и стекол, уменьшением кол-ва этидия и пр. Вырезал одновременно по 10 бендов, и ПЦР и сиквенс шел вполне успешно. Транс, правда, на 310 нм. Да, и эффект накопления мутаций от Taq, скорее миф. По крайней мере, увидеть это явление можно, действительно, только ч/з клонирование.
Anonymous, 01.02.2005 00:24
Ребята, ПДРФ отменяется: вооружайтесь нанотехнологией.
http://www.genoterra.ru/news/view/16/846
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2018 Invision Power Services, Inc.