На днях наловчился получать магносорбенты. Пока сделал три варианта:
1. Силикатные.
2. Фосфатные.
3. Цинковые.
С первыми - силикатными - всё более или менее понятно. Нужны для выделения ДНК, и проверка их работоспособности - вопрос времени. А вот зачем могут понадобиться фосфатные? Не исключено, что их можно использовать вместо фосфоцеллюлозы. Да и просто в качестве ионообменника.
Цинковые, похоже, нигде пока не используются, но они должны очень хорошо связывать и ДНК, и РНК, и все прочие низко- и высокомолекулярные фосфат-содержащие соединения. Возможно и гистидин-содержащие.

Буду признателен за любые предложения. Если предложения будут не теоретические, а практические (по их испытаниям), то берусь обеспечить и магносорбентами, и магнитными штативами:
http://molbiol.ru/forums/index.php?act=Att...=post&id=181131

а для пришивания антител никакие из них не подходят? чтобы иммунопреципитацию делать

Хорошая идея! Фосфатные должны неплохо сшиваться с аминными группами карободимидом. Только для активации такой сшивки, в отличие от карбоксильных, используется не гидроксисукцинимид, а какая-то другая фиговинка (забыл название). Связь P-N кислотолабильная, но в обычных условиях вполне стабильная.

в общем, если удастся такое сделать, было бы вполне востребовано.
Ещё вот, вариация на ту же тему - кобальтовые (Co2+ или Ni2+) магнитные бидсы для выделения His-меченых белков, как альтернатива TALON'у - это вот мы бы хоть прямщас купили.

Тоже подумал про кобальтовые и никелевые сорбенты, но не для гистидиновых гибридов, а для выделения некоторых металл-связывающих белков из биожидкостей. Такое было бы интересно потестить. Цинк в этом смысле менее подходящ.

хммм, вот тут не уверен. Всё-таки один факт наличия взаимодействия, показанного в статье, вовсе не означает, что это взаимодействие будет достаточно сильным для выделения белков. Да и неспроста, наверное, все производители делают только кобальтовые либо никелевые сорбенты.

Поэкспериментировать - можно попробовать, месяца через полтора планирую снова вернуться к выделениям His-меченых белков. Да, забыл сказать - у меня протокол выделения в денатурирующих условиях (6M гуанидин-хлорид) - выдержат ваши сорбенты такое?

Уговорили. Сделаю и никелевые.
Сорбенты сферические, но сугубо неорганические. Теоретически гуанидин на них действовать не должен.

Цинк связывает His6 лучше никеля в 20 раз!
http://peds.oxfordjournals.org/content/21/8/529.long

ну, вот в этом обзоре по IMAC пишут, что с цинком тоже вполне себе работало, хотя и немного похуже чем с никелем - см. Fig. 27.9

Если вы собираетесь использовать неорганическую матрицу для сорбции белков, моут быть проблемы, как с неспецифической сорбцией, так и с необратимой сорбцией на матрице.

Судя по всему, Zn связывает His6 не хуже (или лучше) Ni, но последний, в отличии от первого, не реагирует на фосфаты (см. табл. 27.2 этого обзора) и на бета-меркаптоэтанол. А цинк, похоже, вяжется и с сульфгидрильными группами, и с нуклеотидами, и с РНК. Т.е. при недостатке сорбента они могут мешать связыванию His6-рекомбинантов и потребуется предварительная очистка. Хотя в обзоре Zn работал очень неплохо. Правда, они чистили белок, содержащий Zn-finger.

А банальные силикатные на пробу поюзать можно для ДНК? Сейчас как раз играюсь с различными типами частиц.

Можно, но не сегодня. Препарат сможете забрать следующей неделе. Явки и пароли передам по E-mail.

Спасибо!

В процессе игр выяснил, что в отмывочном буфере Силекса явно содержится что-то типа эфира (по запаху) - а для чего?

Не знаю как у Силекса, но за бугром "отмывочный буфер" - это, как правило, 70% этанол. Вместо этанола можно использовать изопропанол (ИПС), который я покупаю в лакокрасочном отделе хозяйственного магазина и использую вместо этанола на стадии силиконизации магносорбентов. Правда, сейчас ИПС завозить перестали и пришлось перейти на ацетон. Кстати, об ацетоне. Можно попытаться заменить им спирт в отмывочном буфере.

С этанолом никогда нельзя убрать носиком полностью последнюю каплю жидкости со дна пробирки, а с буфером Силекса пробирка остается почти сухой - подозреваю, что эфир там именно для этого, поверхностное натяжение менять.
Но в составе ничего такого нет, обманывают?

Genseq, нас интересуют магносорбенты на пробу, беремся их проверить )))
Как с Вами связаться?

Генсек мне давал на испытание (то бишь сравнить с моими магносорбентом и нат. силикой), а мне все некогда . Приходите, отолью, если, конечно, Генсек не возражает.
Баба с возу - потехе час.

Я бы тоже хотел попробовать.
Ещё есть возможность?

Пузырёк, отправленный обычной посылкой в Новосибирск, застрял в Москве. Наверное, не понравился рентгеновскому аппарату.
А вот отправленные одновременно с ним магнитные штативы на Казанском вокзале отметились 25 сентября и должны быть уже где-то на подходе к Новосибирску.

Появилась идея магносорбенты рассылать в письмах - в пакетиках, содержащих по 1...2 г. сухого порошка, похожего на обычную глину. Интересно, письма рентгеном проверяют?

Первая проверка силикатных сорбентов прошла успешно. Превосходят магносорбенты Промеги и Силекса. Не уступают ИзоГеновским.

ну и сколко ДНКа из 30 миклов кровушки ?

http://www.lifetechnologies.com/us/en/home...-universal.html

Как бы ознакомиться с протоколом испытаний? Ведь магносорбенты из одного кита могут не работать с растворами кита другого производителя. Я такое наблюдал когда сравнивал "все своё" с промеговским магносорбентом.

Потери - не более 20%, многое зависит от состояния "кровушки".
В этой ссылке не совсем аналог, того что делает Генсек.

Вторые испытания с той же партией сорбентов провалились. Похоже, из-за зарастания какой-то микрофлорой. Сорбент норовил закупорить носик пипетки, да ещё и ингибировал ПЦР. Правда, в них участвовала ещё одна партия, приготовленная позднее. С ней всё прошло отлично.

Похоже, зря я в этот раз отмыл сорбенты фосфатным буфером. В сочетании со следами аммония буферный раствор оказался весьма питательным. И похоже, что не зря Силекс консервирует свои сорбенты азидом натрия. Теперь тоже буду всё консервировать.

С протоколами Real-time дела не имел и даже не пытался в них вглядываться. Показалось всё очень запутанным, поэтому целиком доверился выводам испытателя (kblag). Кстати, это он разрешил выложить здесь протокол целиком, за что приношу ему свою искреннюю благодарность.

Сейчас попытался вглядеться. Если ограничиться только рассмотрением результатов с bACT, то даже первая партия (0,8...0,9) выглядит вполне конкурентоспособно. Вторая там обозначена как 1,5...2,0. Кажется, выглядит тоже вполне достойно. Цифры в обозначении указывают на средний размер частиц магносорбента.

Протокол явно "ДСП". Чтобы разбираться, нужно знать "шриф-код" обозначений. Короче, без бутылки не разобраться.

Реал-тайм это, конечно, хорошо, но в лаборатории должны быть еще и классические методы - необходимо смотреть в первую очередь как выглядит ДНК на агарозном форезе. Тем более что сорбенты имеют привычку рвать на кусочки высокомолекулярную ДНК, особенно если размер сорбента существенно меньше микрона.
Сомневаюсь что они успели так быстро зарасти в холодильнике. У тебя же есть Проклин, в нейтральных и кислых средах лучше не придумаешь. NaN₃ тоже не помешает.

В зарастании я и сам сильно сомневаюсь. Скорее всего, мелкие частички после отстаивания хуже суспендируются. На ощупь магносорбенты не отличаются от глины. Если хорошенько не протрясти на вортексе, то могут остаться комочки, забивающие носики. Если причина в этом, то их проверку нельзя считать неудачной. Точнее - их проверка показала, что не следует делать силикатные сорбенты слишком мелкими (< 1 мкм).

Что касается результатов с сорбентами 1,5...2 мкм, то мне они кажутся вполне достойными. Попытался обобщить данные протокола испытаний. Не уверен, что сделал это правильно, но получил такую табличку значений Cq Mean (среднее количество циклов) для своего сорбента (1,5...2) и сорбентов сравнения (126 и 320). Различия незначительны и находятся в пределах статистической достоверности:

Кажется, проясняется механизм связывания ДНК/РНК с силикатами.
Нейтрально заряженные силанольные группы (Si-OH) образуют с отрицательно заряженными фосфатными группами (P-O) в кислой среде диэфирные связи (Si-0-P). Такие связи стабильны в кислой среде, но легко гиролизуются в щелочных условиях.

Интересно, что этот известный в неорганической химии факт почему-то никто не ассоциирует с механизмом сорбции ДНК/РНК силикатами. Или я это просто не нашёл?

На самом деле механизм сорбции другой, где кроме рН среды не менее важную роль играет ионная сила.
А какова роль 5 М хаотропных агентов? Причем не все хаотропы годятся для этого! Ты не нашел, все давно расписано.

Всё давно расписано:
1. Высокая ионная сила нейтрализует отталкивание ДНК/РНК отрицательно заряженной силикатной поверхностью.
2. Хаотропы к сорбции вообще отношения не имеют. Они лизируют вирусы и денатурируют белки, связанные с нуклеиновыми кислотами. Ещё они денатурируют ДНКазы и РНКазы.

Давно описаны методики выделения без хаотропов. Например:

Просто заменили маг. сорбенты из кита Промеги на другие различные. И если со своими "родными" растворами промеговские частицы заметно хуже работали, чем магносорбенты от Генсека и из Изогена - это тоже ведь о чем-то говорит?
Проблема возникает с нормированием по концентрации и размеру частиц разного производства - одни растворы частиц более концентрированные, др. менее, одни частицы крупнее, др. мельче. Пока брали так, чтобы частиц для сорбции было заведомо достаточно.

Спасибо, очень ценная инфа. Я тоже сравнивал в свое время все доступные магносорбенты на своем ките, со своими растворами, доведенными "до ума" на нативной силике. При всем уважении к Промеге, их сорбент рвал ДНК на мелкие куски (ДНК фага Лямбда превращалась в шмерок) и выход был меньше 30%.

Очень мелкий сорбент , меньше микрона, оптимально использовать при выделении ДНК/РНК из плазмы, сыворотки или др., а более крупный, 2-10 мкм, - из образцов с избытком материала (кровь, гомогенаты тканей и т.п.).
Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и варьировать его количество в зависимости от природы иссл. образца (количества ДНК в образце).
Если возникнут вопросы при испытании - обращайтесь, можно в личку.

Генсек, мы с тобой сравниванием "мягкое" с "теплым" - посмотри какой
в статье рН - 4!!!! А я всегда работаю в нейтральной среде. Поэтому можешь дальше теоретизировать, но без меня. - механизмы отличаются как земля и небо.
Кстати, статья так себе хоть и новая. Нет доверия авторам использующим Трис-ацетат буфер с рН = 4. Трис - буферы с рН меньше 7 это не буферы.

Еще добавлю - элюция ДНК с сорбента 10 мин при 80 оС - это "финиш", а использование Протеиназы К в современных китах для автоматизации процесса - тоже шаг не вперед. Так что думай, Чапай...

Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и

ПротеинА/Г магнитные шарики для ИП

можно в такие вляпатся

Мне должно наверное присниться что это такое А/Г и ИП.
Ты же любишь на каждый звук ссылку кидать! Неисправим чел.

это всего лишь Protein A/Protein G - для иммунопреципитации

http://www.lifetechnologies.com/de/de/home...cipitation.html

Пока в этой теме речь не идет о SPRI-магношариках с -СООН группой. Ты вечно витаешь в облаках - мы пока говорим о сорбенте с Si-OH и выделении тотальной ДНК или РНК.
И причем тут это? http://www.lifetechnologies.com/de/de/home...cipitation.html
Мало ли на свете магносорбентов.

сколко можно о стекляшках говорить

Статья старенькая (2005 г.). Огрехов в ней много, но и изюминка имеется. Даже две. Первая - отсутствие хаотропов, причём не случайное, а вполне обоснованное. Вторая - низкий pH (4,0), что обеспечивает ингибирование РНКаз не хуже хаотропов.

Понятно, что Tris нужно заменить ацетатом, а дорогую протеиназу К дешёвыми аптечными таблетками ацидин-пепсина.

В нейтральной среде (pH 7,0) сорбировать можно, но есть риск нарваться на плохое связывание при небольшом защелачивании:

Так что думай, Чапай ...

Ингибировать Нуклеазы, особенно РНК-азы, при рН 4, в присутствии сульфата аммония такой низкой конц.ции еще никому не удавалось. В RNA Later (это подкисленный сульфат аммония с высокой концентрацией, 60-ые годы) РНК-азы действительно инактивируются, но обратимо, т.е не денатурируют. Только Протеназа К или хаотропы.
А использование его, RNA Later, напрямую как связывающую ДНК с силикафильтром среду не увенчалось успехом.
Про аптечные реактивы вообще не серьезно говорить - неуважение к себе, пардон. В свое время, собрав кучу сериновых протеаз, пытался изобразить замену протеиназе К - фиг вам - лучше протеиназы К против нуклеаз нет НИЧЕГО. Но как она будет работать в кислой среде - это еще бАльшой вопрос.
Кстати, у меня кривая получается ровно наоборот.
Я при выделении ДНК полностью избавляюсь от гемоглобина и гепарина. И еще, в том же связывающем растворе очень легко солюбилизируется агароза, свернувшаяся кровь и мягкие ткани. Так что, дерзай, если не хочешь прислушаться к 20-летнему опыту совершенствования одного метода.
Многие беды от избытка знаний.
Я недавно говорил - надо уметь фильтровать инфу из литературы.

Ну займи себя чем-нибудь

магношарики имеют смысл когда робот - у меня генмол в основном простаивает -
пару раз включали

а так - колонки Зимо или Квакаген

http://www.biotechniques.com/multimedia/ar...tion_44229a.pdf

Заметьте, не я это предложил ©. (Покровские Ворота)

http://www.nexttec.biz/

100 рублей на пробу

http://www.biozym.com/desktopmodules/websh...aus%20Bakterien

я уже заказал пробнички этих "чудо-колонок" - посмотрим на цена-качество

Принцип метода тот же - сорбция на силике и последующие отмывки, но с использованием МАНИФОЛДа с вакуумом. Тот же микроколоночный метод с силикафильтрами и ничего нового. Если это не так и сорбент это особенный и родом и ИБХ - дайте ссылку, посмотрим что за новинка. Но я уверен, что это манифолдный вариант в комплекте с многоканальной (8) пипеткой - самый оптимальный для масштабирования пробоподготовки и не нужно покупать роботизированные станции. Дороговизна из-за манифолда с готовым сорбентом. Вот все.
Это мы уже обсуждалы на этом форуме...