Полная версия страницы  English  

Определение концентрации белка (Брэдфорд; Лоури)

Pages: 1, 2, 3
Forum robot, 09.11.2005 18:45
Комментарии к постоянной странице сайта: Определение концентрации белка (Брэдфорд; Лоури)

Определение концентрации белка. Методы Брэдфорда и Лоури. Раздел Методы сайта molbiol.ru.
Гость, 09.11.2005 18:45
Некоторые наблюдения за раствором...
Хм, кумасси синеет и при растворении в спирту. Для растворения нужно использовать спирт 95%. Затем добавляем заводскую о-фосфорную кислоту (85%) раствор становится коричневым.
После доведения до объёма бидистил. водой коричневый раствор вновь приобретает синеватый оттенок. По прошествии 5-7 дней раствор снова становиться коричневым.
Есть предположение что у каждого своя Бредфорд:)
0xy, 10.11.2005 12:49
о-фосфорную кислоту (85%) надо добавлять медленно, по каплям (можно делительную воронку приспособить) и тогда раствор становится не коричневым, а каким положено...и цвет не меняет...wink.gif
_vectors_, 11.01.2006 02:55
к методу лоури, реактив В не стоек и медь сыпется, готовить его перед анализом из растворов В1 (медь) и В2 (цитрат)
Гость, 21.03.2006 16:41
а что представляет из себя кумасси? И как его можно получить?
bukach, 21.03.2006 17:48
1. гуугле рулит

2. купить. главное с R не перепутать
melkij becc, 21.03.2006 18:08
(Гость @ 09.11.2005 18:45)
Ссылка на исходное сообщение  Некоторые наблюдения за раствором...
Хм, кумасси синеет и при растворении в спирту. Для растворения нужно использовать спирт 95%. Затем добавляем заводскую о-фосфорную кислоту (85%) раствор становится коричневым.
После доведения до объёма бидистил. водой коричневый раствор вновь приобретает синеватый оттенок. По прошествии 5-7 дней раствор снова становиться коричневым.
Есть предположение что у каждого своя Бредфорд:)

странно себя ведет кумасся. она простояла достаточное время, неоднократно использовалась для анализа. а тут бац, стала синеть. отливаешь ее в стаканчик сколь надо. еще ничего не добавлял. глядь, она уже не совсем коричневая, что-то синее проклевывается. Ну и как с такой работать?
bukach, 21.03.2006 18:23
1. новую сделать (что лучше)

2. кислоты докапать до покричневения (не знаю что получится, но можно попробовать).

3. в след раз делать меньше чтоб долго не хранить
Гость, 26.03.2006 16:22
Это модификация метода Лоури? В стандартной методике указан тартрат натрия или калия, которого у меня нет. Его действительно можно заменить цитратом?
Гость, 26.03.2006 19:45
А вы ничего не пропустили? Концентрация карбоната натрия в реагенте А не должна составлять 20 %, как в оригинальной методике Лоури ? Дайте, пожалуйста, ссылку на какую-нибудь статью с этим методом.
bukach, 27.03.2006 15:29
(Гость @ 26.03.2006 16:22)
Ссылка на исходное сообщение  Это модификация метода Лоури? В стандартной методике указан тартрат натрия или калия, которого у меня нет. Его действительно можно заменить цитратом?

тартрат нужен для того, чтобы медь в щелочной среде в осадок не выпала. думается, что цитратом заменить его можно. например, в биуретовом реактиве - тартрат, а в реактиве Бенедикта (микробиуретовый метод) - цитрат.

(Гость)
Ссылка на исходное сообщение  А вы ничего не пропустили? Концентрация карбоната натрия в реагенте А не должна составлять 20 %, как в оригинальной методике Лоури ? Дайте, пожалуйста, ссылку на какую-нибудь статью с этим методом.


в оригинальной методике Лоури тоже 2%. можете сами убедиться - статья в открытом доступе http://www.jbc.org/cgi/reprint/193/1/265
bukach, 27.03.2006 15:35
странички из Protein Protocols c методом Лоури
(с ссылками и модификациями)


Файл/ы:

Lowry_from_The_Protein_Protocols_Handbook_Second_Edition_.pdf
размер: 20.05
кол-во скачиваний: 19
27.03.2006 — 10.04.2006

Гость, 07.05.2006 18:06
реактив Бредфорд используется сразу после пригоовления или должен стоять какое то время?
bukach, 10.05.2006 14:55
(Гость @ 07.05.2006 19:06)
Ссылка на исходное сообщение  реактив Бредфорд используется сразу после пригоовления или должен стоять какое то время?


вполне можно. перед употреблением отфильтровать его желательно. еще стоит учесть, что со временем калибровка может измениться, посему лучшее её каждый раз повторять.
Гость, 19.07.2006 07:05
Никто не в курсе в чем заключается принцип окрашивания в обоих методах и от чего оно зависит. А то есть белочек у меня который красится по Лоури, а по Брэдфорд не хочет и из-за этого я на форезе его не вижу, хотя на 280нм дает интенсивный пик при гел-фильтрации
stanislaff, 19.07.2006 10:23
Есть еще один нюанс. Брэдфорд очень чувствителен к ацетату и формиату натрия. Я буквально только что делал анализ - по Брэдфорду концентрация протеина аж зашкаливает, а на электрофорезе - полный ноль. Приготовил растворы ацетата и формиата натрия - снова зашкаливает (рН 7-9). Гидроксид и хлорид натрия окрашивания не дают, уксусная кислота - тоже. Грешу на ацетат- и формиат-анионы...
guest: yMHuK, 21.07.2006 18:21
(Гость @ 19.07.2006 07:05)
Ссылка на исходное сообщение  Никто не в курсе в чем заключается принцип окрашивания в обоих методах и от чего оно зависит. А то есть белочек у меня который красится по Лоури, а по Брэдфорд не хочет и из-за этого я на форезе его не вижу, хотя на 280нм дает интенсивный пик при гел-фильтрации

Coomassie (Bradford) красит избранные аминокислоты, потому результат зависит не только от концентрации, но и от аминокислотного состава. Соответственно, для точной концентрации калибровать нужно или по тому же самому белку, или вводить поправку, если она для Вашего белка известна.
У Lowry вариации между белками с разным составом раза в 2.5 меньше.
Выбор между этими двумя обычно определяется совместимостью с детергентами, солями, растворителями, редуцирующими агентами и прочей дрянью в белковом растворе.
guest: ммм, 21.07.2006 18:51
Coomassie (Bradford) красит избранные аминокислоты, потому результат зависит не только от концентрации, но и от аминокислотного состава.

Гы! все еще проще, вообщем кумася красит в основном лизины и аргинины и немного пептидную связь.

А Лоури больше похож на БСА, хотя это у меня только щас мызль такая прорезалась, раньше я все грешил на тирозины, он неравнодушен к тирозину ибо по жизни реагент фолина используется для обнаружения фенолов.
Mac-1, 22.07.2006 08:15
(stanislaff @ 19.07.2006 03:23)
Ссылка на исходное сообщение  Есть еще один нюанс. Брэдфорд очень чувствителен к ацетату и формиату натрия. Я буквально только что делал анализ - по Брэдфорду концентрация протеина аж зашкаливает, а на электрофорезе - полный ноль. Приготовил растворы ацетата и формиата натрия - снова зашкаливает (рН 7-9). Гидроксид и хлорид натрия окрашивания не дают, уксусная кислота - тоже. Грешу на ацетат- и формиат-анионы...


Синяя как раз анионная форма Кумасси. А вы не пробовали добавлять в ваш образец с ацетатом и/или формиатом равный обьем (или больше) 1М NaOH? Посмотрите об этом статью Стошека (Stoscheck) в 182 томе Methods in Enzymology, там где-то в самом начале (нет под рукой сейчас).

(guest: ммм @ 21.07.2006 11:51)
Ссылка на исходное сообщение  Coomassie (Bradford) красит избранные аминокислоты, потому результат зависит не только от концентрации, но и от аминокислотного состава.
Гы! все еще проще, вообщем кумася красит в основном лизины и аргинины и немного пептидную связь.
А Лоури больше похож на БСА, хотя это у меня только щас мызль такая прорезалась, раньше я все грешил на тирозины,  он неравнодушен к тирозину ибо по жизни реагент фолина используется для обнаружения фенолов.


Вообще-то, и Бредфорд тоже отчасти неравнодушен к тирозину. smile.gif При Бредфорде Кумасся в связывается в основном с аргинином и в гораздо меньшей степени (примерно в 8 раз меньше) с лизином, а также с ароматическими АК: триптофаном, тирозином, фенилаланином и гистидином (гидрофобные взаимодействия). Так что и здесь триптофан фигурирует. smile.gif

----------------------------------------------
Есть еще такой старинный и забытый сейчас метод: проба с ТХУ. В образец добавляют ТХУ до 10%, вортексируют и меряют мутность раствора, например при 320-340 нм. Калибровочную кривую можно составить по абсолютно любому белку. Метод грубый, не очень точный и не очень чувствительный, но зато он очень прост, нет вариации по белкам, и он совершенно равнодушный к многим добавкам и примесям в буфере и работает там, где и Лоури, и Бредфорд не фурычат. Особо полезен для белковых смесей, на ранних этапах очистки, когда белка много, а калибровки по индивидуальным белкам - ненадежны.
Vladimir70, 22.07.2006 18:37
<Coomassie (Bradford) красит избранные аминокислоты, потому результат зависит не только от концентрации, но и от аминокислотного состава.<



Правда-правда. У меня тут интересный случаи тоже есть, ИЛ15 и ИФН-бета. Если по тагу считать то ИЛ15 в два раза больше, а на геле, кумасси раза в три интенсивнеее Интерферон красит. Пирсовскии BCA кит согласен с тагом. Прикольно.
Вот и верь после этого людям.
guest: yMHuK, 24.07.2006 19:45
(Vladimir70 @ 22.07.2006 18:37)
Ссылка на исходное сообщение  Правда-правда. У меня тут интересный случаи тоже есть, ИЛ15 и ИФН-бета.  Если по тагу считать то ИЛ15 в два раза больше, а на геле,  кумасси раза в три интенсивнеее Интерферон красит. Пирсовскии  BCA кит  согласен с тагом. Прикольно.
Вот и верь после этого людям.

А всё потому, что и BCA, и Lowry основаны на биуретовой реакции - восстановлении меди в щелочной среде. Для этого достаточно пептидных связей, всякую неразбериху вносят некоторые боковые цепи. И коэффициент вариации для разных беллков у BCA и Lowry весьма похож, и, как я уже писал, заметно ниже Брэдфорда.
Гость, 12.09.2006 17:18
А если G заменить R? Пройдёт?
Афанасий, 09.12.2006 19:57
1 g G-250 (Serva)
200 мл фосфорной кислоты
100 мл этанола

Это сток. Последний раз готовил года два назад. Работаает как зайка по сей день и не синеет. Я так понимаю, что это практически вечно.

30 мл стока
80 мл фосфорной кислоты
100 мл этанола
вода до 600 мл (рабочий)

проба:краситель=1:1,5

очень удобно ставить в плашках (100+150 мкл)
guest: ммм , 11.12.2006 16:03
---А если G заменить R? Пройдёт?

Нет!!!!
Гость, 01.03.2007 17:06
Если планируете использовать Брэдфорд в течение длительного времени и возможно использование нескольких независимо приготовленных порций, вот рекомендации по стандартизации (опыт добыт потом и кровью): Готовить и хранить в темной посуде или оборачивать фольгой. Сразу после смешивания не фильтровать. Дать отстояться ночь при комнатной температуре, потом профильтровать. Стабилизировать еще несколько дней (7-8 должно хватить), профильтровать вторично. Снять спектр (это чтобы сравнивать со следующими порциями) пустого красителя и с 2-3 концентрациями стандарта. Показатели сильно зависят от температуры, поэтому работать при отклонении температуры больше чем на 3 градуса не рекомендую. Если холоднее - греть помещение. Если теплее, разбавить краситель соответствующим растворителем (этанол/кислота/вода в нужном соотношении). Естественно, учитывая все это, ни в коем случае не совать в холодильник!
Гость, 01.03.2007 17:23
Извините, уточнение к предыдущему комментарию:
Фильтровать нужно 2 раза по такой схеме (желательно иметь мембранный фильтр больше, чем 0.22, а можно и через фильтровальную бумагу в несколько слоев, в зависимости от объема - 1 слой на 200 мл): 1 раз через 15-18 часов после приготовления, второй раз - через сутки. И после этого уже настаивать 7-10 дней в зависимости от температуры. И контролировать динамику на спектрофотометре.
BDS, 01.03.2007 17:46
Здравствуйте! У нас такая проблема: Определили концентрацию белка по методу Лоури, полученные показания были достаточно равномерны и укладывались в рамки калибр. графика. После этого провели ПААГ электрофорез по Лэмли и обнаружили, что белковые треки совсем не выровненны (часть полос очень темные, часть светлые, часть окрашены неравномерно: сверху светлые, снизу темные), хотя на каждый трек наносилось строго определенное количество белка, рассчитанное по Лоури. Суть проблемы в том, что белок был выделен не нами и по совсем другой методике, тогда как выделенные нами белки всегда прекрасно выравнивались, исходя из Лоури, и с ними никогда не было таких проблем.
Сталкивался ли кто-нибудь с подобным, с чем это может быть связано, и как нам выровнять белок, чтобы полученные после Вестерн Блоттинга результаты были достоверны.
Заранее спасибо.
guest: ммм , 01.03.2007 19:52
Лоури чувствителен к востанавливающим вещества DTT MЭ Тритон фенол.

Но то что описываете вы больше всего похоже на плохую окраску геля кумасси, у вас было плохое пермешивание или плохо гель в ваночке болтался, но я бы аккуратно перекрасил бы гель для начала.

В принципе белок можно выровнять прямо по гелю. Либо на глаз, либо взять скан геля обсчитать его с помощью какой нибудь проги.

Еще мложно опробовать другие методы: BCA и Брэдфорд.

А еще есть чудная хрень: кумася на фильтровашке хороша тем что белок сорбируентся на бумаге а потом отмывется от всех модулирующих примесей.

http://molbiol.ru/protocol/17_05.html
Лидия Боровкова, 02.03.2007 12:14
Вопрос к Афанасию по поводу стока. При приготовлении реактива Бредфорд из вашего стока мы получаем более концентрированный вариант, чем в классической прописи. Это сделано по каким-то особым соображениям?
Гость, 19.03.2007 16:19
Народ, напомните, пожалуйста, относительно чего проводят калибровку: относительно того в чем растворен белок или относительно вода+Кумасси (без белка)?
bukach, 20.03.2007 00:10
(Гость @ 19.03.2007 16:19)
Ссылка на исходное сообщение  Народ, напомните, пожалуйста, относительно чего проводят калибровку: относительно того в чем растворен белок или относительно вода+Кумасси (без белка)?


вы, наверное, имеете ввиду нулевую точку на калибровке?
лучше то, в чём растворён белок.
Афанасий, 26.03.2007 19:13
2 Лидия Боровкина

В целом, чувствительность плавает от соотношения белок/краска.
Больше Кумасси - меньше белка засекает.
Вот и все соображения.
Лидия Боровкова, 27.03.2007 09:44
(Афанасий @ 26.03.2007 19:13)
Ссылка на исходное сообщение  2 Лидия Боровкина

В целом, чувствительность плавает от соотношения белок/краска.
Больше Кумасси - меньше белка засекает.
Вот и все соображения.
Лидия Боровкова, 27.03.2007 09:49
Большое спасибо, Афанасий. Поскольку вы такой продвинутый в этом вопросе посоветуйте стоит ли обращать внимание на температуру в помещении и где можно заказать стандартный белок что-то типа гамма-глобулина по сходной цене?
Гость, 04.05.2007 09:53
Привет кто нибудь может поделиться с методикой выделения белка для последующего анализа методом Бредфорда.
Гость, 25.07.2007 12:24
Привет. Подскажите пожалуйста, приготовил раствор Бредфорда, а он жёлтый. Готовил так: 100мг кумасси G-250 растворил в 50ml спирта и добавил 100ml ортофосфорной кислоты, довёл до 1л водой и профильтровал.
guest: ммм , 25.07.2007 12:59
Чиста, конкретно желтый, например, как желтая акварельная краска или раствор фурацилина или пикриновой кислоты? или не синий?

Если чиста желтый, то либа кумаси был не кумаси, а например БФС.
Либо спирт не спирт
Либо кислота не кислота.
Яра, 20.08.2007 22:35
(Афанасий @ 26.03.2007 20:13)
Ссылка на исходное сообщение  

В целом, чувствительность плавает от соотношения белок/краска.
Больше Кумасси - меньше белка засекает.
Вот и все соображения.

Совсем недавно валидировала методику Бредфод для нашей лабы. Как ни странно - больше кумасси засекает больше белка. В моем случае удвоение концентрации красителя и смена этанола на метанол позволила стабильно определять белок в количестве 1.5 мкг\мл, т.е. чувствительность метода повысилась примерно на порядок.
guest: Olga , 04.09.2007 15:35
Крик о помощи знающим людям!
Для снятия белка с колонки хочу использовать детергент SDS 0,1 - 0,5%. По Бредфорду SDS сам интенсивно окрашивается (р-р Бредфорда готовый покупной), невозможно построить калибровку, что уже говорить о белке. Пыталась сделать калибровку при А280, меньше 30-40 мкг/мл не улавливается, а нужно определять концентрацию от 1 мкг/мл. А еще ерунда получается, когда одно и то же известное количество БСА, растворенное в дистилляте, измеряю при А280 получаю одну концентрацию, а по Бредфорду выходит другая (к исходной концентрации ближе первый метод). Возможно Бредфорд используют для малых концентраций, но хочется ведь проверить, чего я там насчитала. Метод Лоури никогда не пробовала и не знаю как отреагирует SDS.
Заранее, спасибо!
guest: ммм , 05.09.2007 15:40
---Пыталась сделать калибровку при А280, меньше 30-40 мкг/мл не улавливается, а нужно определять концентрацию от 1 мкг/мл.

среднее на круг поглощение белка на 280нм А=1 при 1мг/мл так что ниче удивительного.

--По Бредфорду SDS сам интенсивно окрашивается (р-р Бредфорда готовый покупной), невозможно построить калибровку, что уже говорить о белке.

Известный фахт.

-- А еще ерунда получается, когда одно и то же известное количество БСА, растворенное в дистилляте, измеряю при А280 получаю одну концентрацию, а по Бредфорду выходит другая (к исходной концентрации ближе первый метод).

А совпадение концентраций зависит от того по какому белку вы калибровали Брэдфорд. Если по БСА, то должен совпадать в пределах ашипки.

--Возможно Бредфорд используют для малых концентраций, но хочется ведь проверить, чего я там насчитала.

Кривая брэдфорд обычно теряет линейность в районе 8-15 мкг белка на мл раствора Брэдфорд, при длине оптического пути 1см.

---Метод Лоури никогда не пробовала и не знаю как отреагирует SDS.
Вроде никак.

Есть еще крутой метод BCA(буквы латинские) от Pirce он чувствительнее Лоури и чуть чувствительнее(не намного) Брэдфорд, но нечувствителен к SDS.

Зато Лоури и BCA чувствительны к хелаторам Типа ЭДТА, Цитрат, Роданид(изотиоцианат), И к востановителям типа фенол, ДТТ, бета-МЭ. Лоури еще чувствителен к тритону.
guest: ммм , 05.09.2007 15:44
--но хочется ведь проверить, чего я там насчитала.

А развести стандартный раствор до более низких концентраций, вам вера не позволяет.
Гость, 07.09.2007 09:13
Люди, очень нужен совет.
Хочу посмотреть содержание белка (то бишь и не белок вовсе, как я понимаю, а скорее уже полипептиды и маленькие пептиды) в мясных гидролизатах. Какой метод лучше использовать: Лоури или Брэдфорд или что-то уж совсем другое?
Насколько я знаю, Лоури определяет только пептиды не меньше 3-х аминокислот, а мне бы по максимуму определить...
guest: ммм , 07.09.2007 13:29
--Хочу посмотреть содержание белка (то бишь и не белок вовсе, как я понимаю, а скорее уже полипептиды и маленькие пептиды) в мясных гидролизатах. Какой метод лучше использовать: Лоури или Брэдфорд или что-то уж совсем другое?
Насколько я знаю, Лоури определяет только пептиды не меньше 3-х аминокислот, а мне бы по максимуму определить...

Нингидрин.
guest: SOTO , 02.10.2007 15:11
wall.gif Не могу сделать колибровку по Бредфорд для 2-50мкг/мл белка(BSA). Краситель доисторический - возможно нада перекристализировать или покупать новый... Спектры, как на меня, неудовлетворительные.
Если не в лом то вышлите мне спектр раабочево раствора без белка для сравнения... brykovvasja@gala.net
bukach, 02.10.2007 23:24
(guest: SOTO @ 02.10.2007 16:11)
Ссылка на исходное сообщение  wall.gif Не могу сделать колибровку по Бредфорд для 2-50мкг/мл белка(BSA). Краситель доисторический - возможно нада перекристализировать или покупать новый... Спектры, как на меня, неудовлетворительные.
  Если не в лом то вышлите мне спектр раабочево раствора без белка для сравнения... brykovvasja@gala.net


для микроопределения (100 мкл белка + 1 мл раствора кумасси) чувствительность 1-10 мкг (т.е. 10-100 мкг/мл). это раз. дело может быть не в самом кумасси, а в фосфорной кислоте. это два. если краска синеватая, а не коричневая, то и без спектров понятно, что неправильная. и что значит "не могу сделать"?
да, и БСА для Бредфорд лучше не использовать.
guest: SOTO , 05.10.2007 15:19
"не могу сделать" - оптическая плотность при 50мкг/мл белка в раене 2.0 (0.5 мл раствор белка + 2.5 мл красителя)
guest: ммм , 08.10.2007 13:27
---"не могу сделать" - оптическая плотность при 50мкг/мл белка в раене 2.0 (0.5 мл раствор белка + 2.5 мл красителя)

Либо остановитесь на 35 мкг, либо бухните мл 5-10 фосфорной в ваш Брэдфорд, только потом не жалуйтесь, что у вас чувствительность упала.
guest: Soto , 11.10.2007 19:17
Продолжая свои мучения по Бредфорду возникли некоторые вопросики... Какой вид имеют спектры чистого красителя и комплекса с белком? они имеют форму выраженого пика или всё-же растянутого плато без чётко выраженого плато? Есть подозрение, что краситель не достаточно очищен или просто цже негодный для использования.... И как влияет степень читоты фосфорной кислоты на процес прохождения реакции между красителем и белком?
guest: ммм , 11.10.2007 19:38
--они имеют форму выраженого пика или всё-же растянутого плато без чётко выраженого плато?

я не снимал эти спектры, но по моему мнению они должны иметь форму размытого(возможно сильно) пика, а плато это скорее вопрос к прибору чем к спектру.

--Есть подозрение, что краситель не достаточно очищен или просто цже негодный для использования...

Товарисчь у вас есть градуировачная кривая, да она не идеальна, дело возможно в красителе, но скорее всего нет, ибо если краситель грязный, то у вас скорее всего вообще ничего не получится даже раствор нормальный не приготовите.

-- И как влияет степень читоты фосфорной кислоты на процес прохождения реакции между красителем и белком?

Давайте без обяснений механизмов, а только эмпирику. Кислота способствует образованию коричневой формы красителя, чем ее больше тем тяжелее белку связать краситель в синий цвет. Если кислоты мало то исходный краситель имеет сильную синезеленую опалесценцию. А градуировчная кривая очень крутая с коротким линейным отрезком и быстро выходит на плато. Если кислоты много то раствор сильно коричневый и не имеет осинезеленой опалесценции, а градуировачная кривая пологая и сохраняет линейность до довольно высокой концентрации белка, но зато снижается ее чувствительность вплоть до полного отсутствия.
Известно что фосфорная кислота склонна всасывать в себя воду, кроме того фосфорная кислота может иметь разную концентрацию и в товарном виде, пропись же раствора Брэдфорд написана для 85% кислоты, если в исходном растворе концентрация кислоты отличается от это цифры, возможны траблы.

И еще одно замечание по поводу:

--0.5 мл раствор белка + 2.5 мл красителя

Очень большое разведение исходного раствора Брэдфорд, а следовательно и снижение концентрации кислоты. Обычно вносят 1/20 -1/10 от раствора Брэдфорд.
Гость, 19.10.2007 13:24
Как же всё-таки мерять концентрации спо Брэдфорда?
Считать кол-во аргининов и лизинов в калибровочном белке и опытном? В моём белке например аргининов всего 6. И если считать так, то его концентрация просто офигеть. Судя по форезу, это совсем не так. И кстати, какие именно остатки красит R-250?
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2019 Invision Power Services, Inc.