Полная версия страницы  English  

Не получается проэкспрессировать белок

ksm, 18.08.2016 16:59
вет!
Уважаемые форумчане, помогите!
Задача: получать экспрессированные в гетерологичной систме белки в нативной форме.
Существует группа белков, относящихся к МАП-кинизам. Часть из них удается получить в чистом виде с помощью аффинной хроматографии. Они активны, хорошо смотрятся в ПААГе, удалось измерить их активность. Но. Есть одна МАП-киназа, которая совершенно отказывается "экспрессироваться"...
Система: Розетта, автоиндуцируемая среда с лактозой и минеральными солями,
вектора: пЕТ32а и пЕТ41. все предыдущие МАПки хорошо получались в пЕТ41. Чаще индукция отлично проходила на пониженной температуре. С белком, про который вопрос - нет полосы вообще никогда. В соучае с упомянутым белком - полный провал.
Esya, 18.08.2016 21:05
а какая там последовательность после atg, первые штук 30...?

полосы нет после попытки очистки или в экстракте?
Guest, 19.08.2016 11:39
размер какой у белка? не 1 МДа, надеюсь?

причины этого известны - либо эта киназа по какой-то причине токсична для бактерии ее экспрессирующей, либо слишком короткая (что врятли), либо слишком длинная, либо ее РНК несет сайт распознавания какой-либо из колийных рестриктаз или систем борьбы с фагами (совсем редко, нобывает и такое).
ksm, 19.08.2016 21:03
Esya, последовательность скину в понедельник, нуклеотиды/аминокислоты?
полосы вообще нет нигде))

размер в районе 50 кДа. насчет токсичности, вроде клетки растут, но явно не очень радостно.
ага! про рестриктазы не подумал, спасибо, проверю!
ship, 24.08.2016 20:56
а антителами не пытались смотреть наличие полосы? к самой киназе или к какому нибудь эпитопу? к 6хhis? ну то есть понятно, что надо чтобы было видно по кумасси, но хотя бы можно убедиться чтоесть какая то индукция и экспрессии. а если и антителами нет, то мало ли, может в плазмиде косяк
ksm, 24.08.2016 21:56
(Esya @ 18.08.2016 22:05)
Ссылка на исходное сообщение  а какая там последовательность после atg, первые штук 30...?

полосы нет после попытки очистки или в экстракте?


сразу как-то в голову не пришло: ведь последовательности плазмид pET41a и pET31a известны. там GST и тиоредоксин сидят (соответственно). поэтому, если вы о N-end rule Варшавского, то тут все должно быть нормально
ksm, 24.08.2016 21:59
(ship @ 24.08.2016 21:56)
Ссылка на исходное сообщение  а антителами не пытались смотреть наличие полосы? к самой киназе или к какому нибудь эпитопу?  к 6хhis?  ну то есть понятно, что надо чтобы было видно по кумасси, но хотя бы можно убедиться чтоесть какая то индукция и экспрессии.  а если и антителами нет, то мало ли, может в плазмиде косяк


конкретно эту не смотрел, т.к. в сходных случаях экспрессия была видна "невооруженным" взглядом в ПААГе и для некоторых подтверждена антителами к GST и His6. Но, видимо, вы правы следует попробовать вестерн...
NMR-guy, 26.08.2016 10:50
Попробуйте примерно за полчаса до индукции (+-15 минут, когда OD600~=0.4) снизить температуру инкубатора до 20С. И через полчаса после снижения температуры индуцировать и ростить далее с точками 6ч после индукции, 12ч, 24ч, 48ч и 72ч. Можете, если терпение есть, с самого начала подращивать культуру при 20С до точки индукции. Это занимает примерно 12 часов, а иногда и больше.

Не удивляйтесь, так порой получается экспрессировать то в трехдневной точке, что не получалось обычным образом.
ksm, 26.08.2016 12:02
Спасибо за совет!
Я при 22-23 в общем и индуцировал родственные киназы, чтобы "выгнать" белок в растворимую фракцию. Да и для всех белков индукция шла и при 37С, но в тельца. В данном случае не выходит ни при каких температурах - ни при 37, ни при 22; ни в растворимой форме, ни в виде телец включения...
NMR-guy, 26.08.2016 13:43
скорее всего рнк этого белка содержит сайт чего-то из системы бактериальной обороны от вирусов.

или эта киназа пытается фосфорилировать что-то внутри колей, что приводит их к гибели без лизиса.
ksm, 27.08.2016 00:53
Спасибо! Поразмыслю над сайтами обороны...
Veshka, 27.08.2016 01:09
Экспрессировал когда-то кучу киназ в колях, никогда никакой токсичности не было. Но всё бывает. Яп ген пересинтезировал на нормальный codon usage и сделал бы с SUMO-His вместо GST. И попробовал бы специфический субстрат кинировать 32-м фосфором. Даже при маленькой активности будет блямба. Лучше способа выяснить, есть там оно или нет - не знаю.
MMM, 27.08.2016 05:23
Даа, только гамма Р32 АТФ в России стала антикварной редкостью.
ksm, 27.08.2016 13:38
(Veshka @ 27.08.2016 02:09)
Ссылка на исходное сообщение  Экспрессировал когда-то кучу киназ в колях, никогда никакой токсичности не было. Но всё бывает. Яп ген пересинтезировал на нормальный codon usage и сделал бы с SUMO-His вместо GST. И попробовал бы специфический субстрат кинировать 32-м фосфором. Даже при маленькой активности будет блямба. Лучше способа выяснить, есть там оно или нет - не знаю.


Так у меня тоже куча киназ идут нормально - без всякой оптимизации, спасибо Розетте.
ИМХО лучше антитела
MMM, 27.08.2016 14:22
Не если у вас есть специфичный субстрат и фосфор, то фосфор конечно круче, антител. Но это если оно есть.
ksm, 27.08.2016 17:06
(MMM @ 27.08.2016 15:22)
Ссылка на исходное сообщение  Не если у вас есть специфичный субстрат и фосфор, то фосфор конечно круче, антител. Но это если оно есть.

ну, киназа как раз не специфичная, поэтому была идея ее выделить в чистом виде
Veshka, 28.08.2016 06:41
А это не существенно для детекции, специфичная киназа или нет. В норме из колей после очистки на хелате никакой эукариотический субстрат кинироваться не должен. А вот антитела во многих случаях распознают не только фосфат. И если с фосфотирозином ещё можно относительно универсально работать с 4G10, то универсальных аналогов для фосфосерина/треонина - нет. Они, как правило, пептидзависимые.

Розетта - отнюдь не панацея. Гадость может происходить и на уровне транскрипции, и вообще фокусы разные бывают - просто чтобы их увидеть, нужно несколько сот белков хотя бы проэкспрессировать. Для очистки совести убейте активный центр в киназке - и сразу половину сомнений отметёте.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2024 Invision Power Services, Inc.