Полная версия страницы  English  

PAAG электрофорез белков

Pages: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9
Forum robot, 12.12.2005 13:24
Комментарии к постоянной странице сайта: PAAG электрофорез белков

Приготовление полиакриламидного геля и электрофорез белков. Выбор % разрешающего геля. Подготовка форезного аппарата. Форез. Хранение гелей.
Fibrinolysis, 12.12.2005 13:24
Хотелось бы уточнить для тех кто делает в первый раз, что pH пятикратного TGB доводить до 8.3 не нужно!
Fibrinolysis, 12.12.2005 15:10
В классической работе Лэмли (Laemli,U.K., Nature,227, 680 (1970))
1x TGB = 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS pH=8,3
0xy, 12.12.2005 15:22
Laemmli, U.K.
atv, 13.12.2005 03:26
А вот вразумите всё-таки, можно ли сделать готовый раствор для геля (т.е. всё кроме APS+TEMED) и его хранить (в холодильнике, например)? И как долго?
Batareykin, 13.12.2005 08:23
(atv @ 13.12.2005 00:26)
Ссылка на исходное сообщение  А вот вразумите всё-таки, можно ли сделать готовый раствор для геля (т.е. всё кроме APS+TEMED) и его хранить (в холодильнике, например)? И как долго?


конечно, можно.
Я для своих целей и 15 % разделяющего, и концентрирующий так держу в холодильнике.

только долго хранить его не стоит (более 1 года smile.gif ) - протухаеть...
Batareykin, 13.12.2005 08:24
(Forum_robot @ 12.12.2005 10:24)
Ссылка на исходное сообщение  <strong><font color='#800000'>Комментарии к постоянной странице сайта</font>: PAAG электрофорез белков</strong>

Приготовление полиакриламидного геля и электрофорез белков. Выбор % разрешающего геля. Подготовка форезного аппарата. Форез. Хранение гелей.


бедный робот...
_a_jadan_, 11.01.2006 20:00
к п 5,8 дегазировать можно как вакуумом, так и продувкой азотом, или инертными газами (гелий), главное избавиться от кислорода, причем продувка быстрее и эффективнее, пузырек с раствором закрывается резиновой пробкой с двумя иголками, конец одной на дно, другой под крышкой, к длинной игле камеру (от мяча, шарик) с азотом (или балон, через редуктор) поток - чтоб еле булькало. (несколько минут и готово) не нужен ни насос, ни мешалка.
_Pedro77_, 11.01.2006 21:10
Чтоб избежать размывки трэков при внесении проб с высоким содержанием соли либо с ПАВ, полезно с двух боков в лунки нанести чистый буфер для образцов (который добавляли в пробы перед кипячением). Часто это помогает получить более-менее не размытую картинку.
_Dascha_, 11.01.2006 21:37
Собственно, готовые SDS-гели можно хранить и при комнатной температуре, предварительно поместив во что-то влажное, например, фильтровальную бумагу, и не давать им высыхать. ДТТ мы храним на -20 сколько угодно, и он не портится.
Например в Германии 10% персульфат аммония принято в виде раствора хранить в морозильнике, хотя принято делать его всегда свежим. Но, видимо, немецкая практика оправдана, потому что гели получаются, сама их заливала.
Гость, 11.01.2006 21:47
Уважаемые есть еще такой момент что уж еще раз вспоминая Остермана хочу отметить что ПСА лучше добавлять в растворгеля в последнюю очередь.А с рибофлавином такая штука , он конечно хорош, но летом в холодной лаборатории без света полимеризация занимает гораздо большее время с ним чем с ПСА. И еще просьба вы пишете про выбор концентрации гелей относительно массы белка. Будет лучше если вы еще напишете список этих самых белков с их массами. начинающим будет удобней.
comp3v, 15.01.2006 03:01
хм... а мы вот 10% APS и вовсе на +4 храним, и довольно долго - работает без проблем.
Николай Полянский, 20.02.2006 14:49
Коллеги, хотелось бы знать, м.б. кто-нибудь имел дело с разделением водонерастворимых белков. Проблема такая - образец белков, растворенных в мочевине и тиомочевине и после соответственно кипячения в синем буфере и разделения дает очень расплывчатую картину. Много хуже картины водорастворимых белков. В сам буфер мочевину не добавляю.
ммм, 20.02.2006 15:15
2 Николай Полянский.

Общая рекомендация такая. Мочевину и ее тио подругу из раствора удалить начисто(например диализом), белки конечно в осадок выпадут, но это не должно вас пугать. Сей осадок надо собрать и как следует покипятить в "синем буфере", белки конечно полностью не растворятся, но львиная их доля растворится, пробу надо отцентрифуговать и отобрать супер его и использовать как пробу.

PS мочевина мешает связыванию SDS с белком, и когда белки выходят из мочевины в SDS то часть из них выпадает в осадок(особенно, если белки сильно нерастворимые и в высокой концентрации) и получаются хвосты.
Garry, 20.02.2006 16:16
Полянскому Н. > Мы занимаемся анализом гибридности семян (кукурузы, подсолнечника, ячменя ....). Короче почти все объекты - проламины, за исключением гелиантина подсолнечника. Так вот, если SDS электрофорез не является для Вас критичным, то мы проводим электрофорез в среде таких детергентов как мочевина. Она входит и в состав буфера для растворения и в состав геля. Результаты получаются очень неплохие. Если нужно подробнее, то пишите мне на мейл.
Гость, 22.02.2006 11:02
Спасибо. Очевидно, попробую оба варианта.
Guest, 22.02.2006 12:33
To: Garry
Мочевина - НЕ ДЕТЕРГЕНТ (т.е. не является "омыляющим" веществом, способным образовывать мицеллы в растворе), а ХАОТРОПНЫЙ АГЕНТ.
Гость, 01.06.2006 12:49
Уважаемые коллеги! Поделитесь опытом извлечения белка из ПААГ блока или его фрагментов так, чтобы можно было посчитать С14-радиоактивность в полосках белков (разумеется, они будут вырезаны)

Заранее благодарим.
С наилучшими пожеланиями,
snz@post.nsu.ru
comp3v, 03.06.2006 18:03
а вот такой вопрос возник. У меня есть лизаты в гуанидиновом буфере (6M GuaCl, для последующей очистки на Ni-резине), и в идеале хотелось бы аликвоту оттуда брать на вестерн. Брать "прямо так" - однозначно не получается (при миграции получается жуть, тем более что наносить приходится довольно много, поскольку белок сильно разбавлен). Но я вот тут почитал, что некоторые мочевину добавляют прямо при приготовлении геля, и подумал - а нельзя ли такое же и с гуанидином сделать? то бишь, добавить его в сам гель... или это совсем дурная идея?
Tom1, 04.06.2006 02:57
проще взять аликвоту и высадить тху.....
bukach, 05.06.2006 18:40
(comp3v @ 03.06.2006 19:03)
Ссылка на исходное сообщение  а вот такой вопрос возник. У меня есть лизаты в гуанидиновом буфере (6M GuaCl, для последующей очистки на Ni-резине), и в идеале хотелось бы аликвоту оттуда брать на вестерн. Брать "прямо так" - однозначно не получается (при миграции получается жуть, тем более что наносить приходится довольно много, поскольку белок сильно разбавлен). Но я вот тут почитал, что некоторые мочевину добавляют прямо при приготовлении геля, и подумал - а нельзя ли такое же и с гуанидином сделать? то бишь, добавить его в сам гель... или это совсем дурная идея?


yes.gif совсем. гуанидин, в отличие от мочевины, заряжен.
comp3v, 05.06.2006 18:50
ну да, я просто как-то раз наткнулся на протокол, где его добавляли - в небольших количествах, но гнать потом приходилось на очень маленьком токе.

А вот тогда скажите лучше - что именно выпадает в осадок при добавлении Laemmli к пробе, содержащей GuaCl? Я так понял, что SDS, но в комплексе с чем? если с гуанидин-анионом, то нельзя ли таким макаром высадить весь гуанидин из пробы, или наш белок при этом тоже весь в осадок уйдёт? (но если брать избыток SDS, то может, и прокатит?...)
comp3v, 05.06.2006 18:55
да, и ещё, вдогонку - а когда в гель добавляют мочевину - нельзя ли таким образом "компенсировать" гуанидин в пробе (чтобы миграция шла нормально)?
ммм, 06.06.2006 15:45
---Я так понял, что SDS, но в комплексе с чем? если с гуанидин-анионом, то нельзя ли таким макаром высадить весь гуанидин из пробы, или наш белок при этом тоже весь в осадок уйдёт?

Если это так то можно, но тогда существует опасность, что и часть белка попадетв этот осадок.

---да, и ещё, вдогонку - а когда в гель добавляют мочевину - нельзя ли таким образом "компенсировать" гуанидин в пробе (чтобы миграция шла нормально)?

Подумайте хорошенько и поймет, что нельзя.
atv, 16.07.2006 13:45
расскажите, пожалуйста, для чего при форезе часто берут вместо второго стекла белую пластину (как она, кстати, правильно называется? алюминий-оксидная?) чем это лучше?
и можно ли этот материал где-нибудь самому достать или купить подешевле? а то покупать фармациевский комплект очень уж долго и дорого...
Utcn, 17.07.2006 12:14
Это керамика с высокой теплопроводностью - для лучшего охлаждения геля. ИМХО, на фиг не нужна...
Alder, 18.07.2006 20:03
"а вот такой вопрос возник. У меня есть лизаты в гуанидиновом буфере (6M GuaCl, для последующей очистки на Ni-резине), и в идеале хотелось бы аликвоту оттуда брать на вестерн. Брать "прямо так" - однозначно не получается (при миграции получается жуть, тем более что наносить приходится довольно много, поскольку белок сильно разбавлен). Но я вот тут почитал, что некоторые мочевину добавляют прямо при приготовлении геля, и подумал - а нельзя ли такое же и с гуанидином сделать? то бишь, добавить его в сам гель... или это совсем дурная идея?"

если концентрации белка позволяют, то развести образец раз в 10 и можно гнать форез, полосы чуть-чуть будут размыты.
Иначе - метанол-хлороформом высадить, минут 5-20 дополнительных в зависимости от кол-ва проб
Tom1, 18.07.2006 22:03
Алдер имхо тупо и храбро тху - все.....
Гость, 16.08.2006 08:22
Такой вопрос: При кипячении образца в синем буфере образуется углеводная пробка. Как от нее избавится? Говорят, что надо добавить А-амилазу, тогда в какой концентрации, и можно ли ее чем либо заменить?
Гость, 26.09.2006 17:45
Ребята, помогите плиз
столкнулась с проблемой: покупаю бисакриламид, мне предлагают диакриламид. есть ли качественная разница (в количестве сшивок и т.д.) между бисакриламидом и диакриламидом?
guest: ммм, 27.09.2006 19:05
диакриламид очень сомнительное название. Возможно это димер акриламида, так этот супчик вообще сшивок давать не будет. А то что бисакриламидный аналог без метиленового мостика по идее должен содержать в своем названии слово гидразид и по большому счету довольно экзотичное соединение по сравнению с бисом.
Гость, 17.10.2006 14:05
Уважаемые коллеги, нет ли у кого-нибудь опыта "негативного окрашивания" геля с помощью ацетата цинка. Попробовал по описанной методике (Matsui et al.), но применbл не деионизованную воду, а обычный дистиллят. Успеха не имел. Если есть некоторые "хитрости", плз, поподробнее.
Николай Полянский
Гость, 14.12.2006 13:07
необходимо выделить белок из мышечной ткани рыбы, подвергшейся тепловой обработке, для дальнейшего проведения электрофореза на автоматической системе FastSistem, какой экстрагирующий раствор лучше применить
Гость, 14.12.2006 13:07
необходимо выделить белок из мышечной ткани рыбы, подвергшейся тепловой обработке, для дальнейшего проведения электрофореза на автоматической системе FastSistem, какой экстрагирующий раствор лучше применить
Pavel2, 14.12.2006 18:43
(Fibrinolysis @ 12.12.2005 12:10)
Ссылка на исходное сообщение  В классической работе Лэмли (Laemli,U.K., Nature,227, 680 (1970))
1x TGB = 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS pH=8,3

Помогите разобраться. Мне нужно приготовить 1 л TGB готового к применению (я так понимаю 1xTGB). Для этого я беру Tris-base 15.1g + Glycine 94g + 50 ml SDS (http://molbiol.ru/protocol/17_01.html#s1)
А как приготовить 50 ml SDS он в сухом виде. В стоке (кстати что это такое?) SDS 10%, значит нужно на 1 литр взять 100 г SDS?
Объясните пожалуйста поподробней, скажу сразу я не биохимик. confused.gif
Tom1, 14.12.2006 18:50
СДС сухой сыпать в буфер себя не любить....
Делаите 10% сток т.е. на 100мл воды 10г СДС
Соответственно сначала растворяите трис и глицин примерно в 900мл воды потом добалвяите 10% сдс и доводите до литра водой....
guest: ммм , 14.12.2006 18:59
---СДС сухой сыпать в буфер себя не любить....

Хе-Хе в электродный я так не делаю не сыплю, а вот во второй раствор для плазмид частенько сыплю сухого. Бо его там в 10 раз больше надо.

--делаите 10% сток т.е. на 100мл воды 10г СДС

Истино так. И кстати я его из пипетки прямо в минусовую камеру, для экономии. В два раза меньше расход. smile.gif
Pavel2, 15.12.2006 00:54
Спасибо за Ваши ответы.
Хотел еще узнать, я использую midi-камеру для электрофореза, мне 500 ml TGB хватит в качестве рабочего объема? И еще, я все правильно делаю для приготовления 1L TGB?
Tris-base 15.1g + Glycine 94g растворяю в 900 ml Н2О, добавляю 50 ml SDS (5g SDS+50ml Н2О) и довожу до 1L Н2О
Глицина не слишком много, половина упаковки приходится высыпать?
Guest, 15.12.2006 10:48
я делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды. а потом уже разводится до 1х.
Pavel2, 15.12.2006 11:22
(Guest @ 15.12.2006 07:48)
Ссылка на исходное сообщение  я делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды. а потом уже разводится до 1х.

До 1х это допустим 100 мл 10хSDS+1000 мл воды?
guest: ммм , 15.12.2006 14:35
И еще, я все правильно делаю для приготовления 1L TGB?
Tris-base 15.1g + Glycine 94g растворяю в 900 ml Н2О!

НЕТ НЕ ПРАВИЛЬНО!!!! триса - 3г, глицина-14.4, SDS-1г или 10мл 10% на 1Л готового раствора.

---делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды.
А вот это правильно!!!
guest: ммм , 15.12.2006 14:43
---До 1х это допустим 100 мл 10хSDS+1000 мл воды?

Что есть 10х SDS в этой фразе? Если вот это: "10% сток т.е. на 100мл воды 10г СДС", то "НЕ ДОПУСТИМ".
Masha11, 16.12.2006 14:11
что-то я не пойму цели? вам что нужно сдс получить чтоль однократный или все- таки тяжелый буфер??? если однократный тяжелый буфер, то наливаете 100 мл 10х и доводите до 1 литра водой. усё)
Pavel2, 19.12.2006 15:33
Я здесь ошибся "До 1х это допустим 100 мл 10хSDS+1000 мл воды?". Имел в виду 10хTGB.

Я вот еще что не понимаю.
В методике PAAG электрофорез белков дана таблица для приготовления TGB - Tris-base 15.1g, Glycine 94g SDS 50 мл (сток 10%) на 1L. Я так понимаю это 5xTGB?
А вот это тоже правильно?
---делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды.
Получается расхождения по глицину, это не принципиально?
guest: ммм , 19.12.2006 16:00
-- трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды.

Это правильно. Это исходная система так сказать из первоисточника.

---15.1g, Glycine 94g SDS 50 мл (сток 10%) на 1L. Я так понимаю это 5xTGB?

Это какая-то модификация с перегрузом по глицину 94 вместо 72.

Вообще говоря, количество глицина весьма принципиально. Но все очень критично, если глицина недоложить и менее критично, если переложить. Небольшой перегруз по глицину позволяет использовать один электродный буфер для нескольких форезов. В процессе фореза из катодного буфера уходит часть глицина и приходит трис, соответственно отношение трис/глицин увеличивается, что есть плёхо, как я уже писал выше, некий запас глицина в исходном буфере позволяет использовать его повторно.

Короче, модификация для бедных и ленивых.
Гость, 21.12.2006 12:10
Люди добрые, отзовитесь у кого есть в лаборатории PhastSistema, для быстого электрофореза, бьюсь одна, не биохимик, освоила изоэлектрофокусирование, на очереди SDS-электрофорез и 2D-электрофорез, методик нет. Помогите
Гость, 27.12.2006 18:40
В раствор для нанесения белка (gel loading buffer
) зачем добавляют Dithiothreitol, он также как меркаптоэтанол востанавливает дисульфидные связи?
Pavel2, 27.12.2006 19:01
->В процессе фореза из катодного буфера уходит часть глицина и приходит трис, соответственно отношение трис/глицин увеличивается, что есть плёхо, как я уже писал выше, некий запас глицина в исходном буфере позволяет использовать его повторно.
<-
А если слить весь буфер после фореза и перемешать отношение трис/глицин не выровняется заново?
Pavel2, 27.12.2006 19:06
Еще такой вопрос, буфер с белками перед нанесением на гель нужно кипятить чтобы белки денатурировались?
Tom1, 27.12.2006 19:16
1. В принципе да если не боитесь что белки "убежавшие" в нижний буфер Вам помешают поетому обычно фитровал после смешивания....
2. А это зависит от задачи.......
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2023 Invision Power Services, Inc.