Полная версия страницы  English  

Загадка ПЦР?

Fox, 10.11.2004 03:23
Коротко вводная: - амплифицируется микросателлитный локус из тотальной ДНК моллюска, т.е. за фланкирующие участки вытаскивается один (у гомо) или два (у гетерозигот) аллеля. Разница в длине между ними 3-15 нуклеотидов. Невелика.
Весь сэмплинг 2003 года работает как часы - все по HWE, интенсивность аллелей в гетерозиготах одинакова. Берем материал 2004 года, приезжаем в Швецию (т.е. меняем все реактивы, включая буфер полимеразы) и получаем.....
- в 40% случаев у гетерозигот одна аллель (ровно короткая или длинная) амплифицируется в несколько(до10) раз хуже другой!!!..... что делаем
1. повторяем - все повторяется у каждого моллюска
2. играем концентрацией ДНК на порядок туда-сюда НОЛЬ реакции
3. да праймеры тоже меняли - безрезультатно
4. уменьшаем температуру отжига и ... опаньки убогие аллели растут как на дрожжах...

опс скажите вы - так ведь они поди неспецифичные! и будете может правы, но я никогда не поверю, что за 1 год во ВСЕЙ популяции (миллионы, а выборки - тысячи) мутировали фланкирующие участки половины аллелей, на этом мои мысли заканчиваются smile.gif я полагаю что что-то в реакции

Ваше мнение?

возможно в субботу "дома" прогонят эти же образцы и что-то станец понятнее...
genseq, 10.11.2004 10:43
Возможное объяснение:
на участках посадки праймеров часто встречаются SNP. При пониженной температуре отжига они себя не проявляют. В буферных смесях, содержащих энхансер, тоже. Проявиться они могли из-за замены буфера или повышения температуры отжига. Более прозаичное объяснение - различия в калибровке температурных режимов термоциклеров.
Kiskin, 10.11.2004 11:11
Скорее SNP в месте посадки праймера. Аналог видели у человека при анализе одного и того же STR в разных популяциях.
Elena Voron, 10.11.2004 11:28
Явно следствие смены условий реакции (буфер, вода амплификатор). И не морочте себе голову всякими мутациями. Подбирайте заново условия и все. Сталкивались с такой проблемой пару раз из-за смены амплификатора и ... рук!
Den, 10.11.2004 14:27
Скорее всего, виноват амплификатор, не всегда реакция отработанная на одном, хорошо идет на другом. Или буфер... Надо подбирать условия реакции заново.
Kiskin, 10.11.2004 14:49
Да нет, бывает и на одном амплификаторе, и на одних реактивах, и в одних руках - но на ДНК из разных этносов.
Fox, 10.11.2004 15:56
1. Руки отменить smile.gif мои не очень поменялись за пару месяцев
2. На амплификатор тоже не хочется валить был ABI 2700 сейчас Eppendorf тоже не старый, не верю в принципиальные отличия между этими машинками
3. Популяция одна и та же! (не разные этносы smile.gif

4. Итак буфер - верю в SNP, тем более что локус заимстован у близкого вида. Сейчас используется Takara полимераза с буфером простым как пробка
10mM Tris-HCl(pH 8.3); 50mM KCl; 1,5mM MgCl2)
Раньше был Сибэнзим c буфером
60 mM Tris-HCl (pH 8.5); 25 mM KCl; 1.5 mM MgCl2;
10 mM 2-меркаптоэтанол; 0.1% Тритон X-100

Мне кажется что и тритон и меркаптоэтанол только стабилизируют фермент? Могут ли они приводить к менее специфичному связыванию с матрицей, т.е. к наблюдаемому ранее эффекту?
le lapin, 10.11.2004 16:21
Автор - Fox:

2. На амплификатор тоже не хочется валить был ABI 2700 сейчас Eppendorf тоже не старый, не верю в принципиальные отличия между этими машинками
 
Зря не веришь, Миша. У них наверняка разный ramping (скорость изменения температуры).
Кстати, если дело именно в этом, попробуй просто увеличить время отжига.
VKV, 10.11.2004 18:52
Полимеразы у вас тоже различаются - это тоже важно. Сибэнзимовская - иногда лучше чем NEB, Promega ...
Anonymous, 10.11.2004 19:41
Что есть лучше?
Они просто разные. Полимеразы, амплификаторы, аллельные варианты... Эффективность синтеза разная... но есче несколько циклов и ... все реакции выйдут на насыщение. Если активности хватит конечно
Fox, 10.11.2004 19:59
так так так не отвлекаемся на полимеразы, я сам в свое время насравнивал разных, есть разные задачи свойства и т.п.

а как насчет Тритона и меркаптоэтанола?
acher, 10.11.2004 20:03
уменьшаем температуру отжига и ... опаньки убогие аллели растут как на дрожжах...
Настораживает...однако. При уменьшении T отжига ... специфичность "обычно" падает... Возможно, в Швейцарии Вы "по-настоящему" амплифицируете, то, на что сделаны праймеры... Дома же -амплифицировали, то, на что вследствие конформации садились праймеры... frown.gif Не знаю, возможно ли пройтись по геному ваших "улиток" заново проверив подбор праймеров... вряд ли... Это худшее что может быть. Надеюсь, что (соглашусь с предыдущими участниками) виноват рэмпинг... Сравните его значение у ваших программ и амплификаторов вообще.
Fedor K., 11.11.2004 02:22
Это только на одном микросателлите так или на нескольких?
AVS, 11.11.2004 03:08
На разных полимеразах может быть всё, что угодно. Да и сиквенсом не мешало бы проверить, алель это вылезла или кака какая ...

Тритон и меркаптоэтанол - для лучшей растворимости. Первый ещё может белковые примеси денатурировать, а второй S-S связи рвёт у цистинов(при условии, что для фермента это не важно).
Fox, 11.11.2004 13:35
это на одном локусе, а вылезают точно аллели и точно сателлита - размер идеально подходит и слипаги (статер) есть. Буду пробовать увеличивать время отжига. Спасибо за советы.
acher, 11.11.2004 13:45
Не совсем в тему, но все же... Так режет слух!
Аллель - он мой! Кофе - он мой! ... Мужики они в русском языке...
Fox, 11.11.2004 21:08
Так вот еще инфо. Похоже дело в рампинге smile.gif

ABI 2700 - 1c/sek
Eppendorf Mastercycler - 3c/sek

вот как - видимо сваливаются они, если так реактивно нагревать. Попробую уменьшить скорость - посмотрим что получится.
Den, 15.11.2004 18:42
acher, чувствуется Питерская школа smile.gif , в Москве аллель - женского рода.
Fox, 15.11.2004 20:30
Не скажите Den, мы вполне питерская школа, тем не менее аллель - она! Слишком уже женское имя - Аллель.

А в Москве - маркЕр!

К сабжу - уменьшение рампинга до 1гр/сек при нагреве после отжига реально помогает! Локус(ы) вообще прикольный - амплифицируется несколько локусов (семейство?) микросателлитов разных размеров. Все вариабельные. Надо заказать праймеры немеченные попробовать секвенировать - интересено smile.gif
le lapin, 16.11.2004 02:18
Денис, ты не прав! Посмотри в учебнике Вечтомова - там аллель женского рода. И школы тут не при чем. Аллель не менее женственна, чем параллель smile.gif
Den, 16.11.2004 12:05
Да, да! Спутал я.... Все наоборот. Аллель - он в Москве, она в Питере. А школы значение имеют, особенно в сфере родов и ударений smile.gif .
Да, относительно маркерОв и чипОв, тоже очень забавно.
Den, 16.11.2004 12:08
Fox, а ты не верил, что дело в амплификаторе smile.gif .
Anonymous, 16.11.2004 20:21
Den нашел брата! Старшего. Этот инструкции читает только если важный експеримент не выходит. И честно опосля докладывает. Чтоб публика более догадками не мучалась. Молодец!
Да... давненько я тут таких ярких молодых дарований не читал. Да в таких количествах!
Что забавно - все из Питера! Заповедник?
Fox, 21.11.2004 17:14
Злобный OFF

Спасибо dear <-гость-> за ценные советы высказанные Вами в ответ на мой, как Вы правильно заметили, элементарный вопрос. Надеюсь и в дальнейшем на Вашу поддержку и сочувствие. Разрешите в силу Вашей анонимности называть Вас Dr. R.Axel, или Dr. L.B.Buck (if you are lady).
Aks, 21.11.2004 18:39
Автор - <опять пришёл>:
Den нашел брата! Старшего. Этот инструкции читает только если важный експеримент не выходит. И честно опосля докладывает. Чтоб публика более догадками не мучалась. Молодец!
Да... давненько я тут таких ярких молодых дарований не читал. Да в таких количествах!
Что забавно - все из Питера! Заповедник?
A vy, talantlyvyi pisatel', otkuda? confused.gif
Saveta, 01.12.2004 14:51
Автор - acher:
Не совсем в тему, но все же... Так режет слух!
Аллель - он мой! Кофе - он мой! ... Мужики они в русском языке...
Аллель, происходит от аллеломорфа, так что все же она, хотя вариант с мужским родом прижился больше.
acher, 02.12.2004 17:10
allele, allelomorph - аллель, аллеломорф. Oдно из возможных структурных состояний гена; А. возникают в результате генных мутаций - потенциальное число А. для каждого гeна практически не ограничено; у диплоидных организмов ген может быть представлен лишь двумя А., локализованными на гомологичных участках гомологичных хромосом; иногда легко мутирующие гены могут быть представлены в популяции значительным числом А. - множественные А. <multiple alleles>; термин "аллеломорфы" предложен У.Бейтсоном и Дж.Сондерсом в 1902 и заменен на более простой термин "А." В.Иогансеном в 1909; следует учесть, что в последние годы слово "А." в русском языке строго мужского рода, хотя раньше его употребляли в женском роде.- аллель гена
- аллель дикого типа
- доминантный аллель
- истинный аллель
- кодирующий аллель
- кодоминантный аллель
- летальный аллель
- ложный аллель
- молчащий аллель
- неактивный аллель
- незаполненный аллель
- немой аллель
- нестабильный аллель
- нормальный аллель
- позиционный аллель
- потенциальный аллель
- пустой аллель
- рецессивный аллель
- сложный аллель
- сублетальный аллель
- функционально активный аллель
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2018 Invision Power Services, Inc.