Главная страница MolBiol.ru > Методы Rambler's Top100  English version  Deutsche Version  Український варіант
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Методы

"Я знаю, как я умру. Это будет в фотокомнате... от инфаркта..."
Приписывается Е.Тульчинскому.

    В этом разделе представлены молекулярно биологические протоколы/методики в эффективности которых авторы убедились на собственном опыте.

    03. Работа с бактериями

    03_01 Номенклатура генотипа бактерий
    03_02 Бактериальные штаммы для мол. клонирования
    03_03 Хранение бактериальных штаммов
    03_04 Трансформация бактерий
    03_05 Электропорация
    03_06 Бактериальные штаммы для мол. клонирования (сводная таблица) // только в MS Word 2000 (03_06.zip)
    *** Базовые правила работы с бактериями на странице "Стерильная работа"
    03_07 Быстрое приготовление компетентных клеток (с PEG) /Носков Кирилл/


    04. Выделение pDNA

    04_01 Выделение pDNA (минипреп)
    04_02 Выделение pDNA (максипреп)
    04_03 Экспресс метод выделения pDNA
    04_04 Очистка pDNA равновесным центрифугированием в CsCl
    04_05 Амплификация и выделение низкокопийных плазмид /Татьяна Веремейко/
    04_06 Выделение pDNA (максипреп - очистка с PEG) /Анна Малашичева/
    04_07 Выделение плазмидной ДНК на силикагеле /Вячеслав Юрченко, Екатерина Мерзляк/
    04_08 Очистка pDNA на silica spin колонках

    05. Получение одноцепочечной DNA

    05_01 Амплификация и хранение хелперных фагов
    05_02 Выделение одноцепочечной ДНК

    06. Работа с фагом лямбда

    06_01 Выделение ДНК фага лямбда
    06_02 Выделение ДНК фага лямбда для приготовления вектора
    06_03 Выщепление pSK(-) из лямбдаZAP in vivo

    07. Электрофорез

    07_01 Агарозный гель-электрофорез
    07_02 Заливка агарозного геля
    07_03 Щелочной агарозный гель
    07_04 Перенос по Southern (щелочной)
    07_05 Перенос по Southern (в буфере с высокой ионной силой)
    07_06 DNA Маркеры
    07_07 Вертикальная миникамера для электрофореза
    07_08 Камера для горизонтального электрофореза

    08. Выделение ДНК из агарозного геля с помощью...

    08_01 PEG/TAE
    08_02 glass milk
    08_03 LMP-агарозы
    08_04 диализного мешка
    08_05 DEAE - мембраны
    08_06 Центрифугирования
    08_07 silica spin колонок

    09. Клонирование

    09_01 Осаждение DNA (RNA) этанолом
    09_02 Другие методы осаждения DNA(RNA) - PEG, Zn, CTAB
    09_03 Мутагенез с помощью Gene Editor system
    09_06 Лигирование
    09_07 Свойства DNA полимераз
    09_08 'Микро'клонирование ПЦР-продуктов в TOPO-системе
    09_09 Vector NTI Suite /Игорь Хмельков/
    09_10 Visual Cloning 2000 /Игорь Хмельков/

    10. Несистематизированные методики

    10_01 Спектрофотометрическое измерение концентрации DNA(RNA)
    10_02 Реакция Random primer
    10_03 Определение процента включения
    10_04 Изготовление G-50 spin-колонок
    10_05 Разделение смеси одноцепочечной и двухцепочечной DNA на silica spin колонках

    11. Олигонуклеотиды

    11_01 Олигонуклеотиды
    11_02 Отжиг адаптеров
    11_04 Форез олигонуклеотидов
    11_05 Очистка олигонуклеотидов из полиакриламидного геля

    12. PCR

    12_01 Состав PCR реакции
    12_02 Параметры PCR реакции
    12_03 Влияние различных веществ на PCR
    12_04 Борьба с загрязнениями при PCR
    12_05 Приготовление Т вектора
    12_06 Очистка PCR продуктов на silica spin колонках
    12_07 Практическое введение в Real-time PCR /a11/

    13. Cиквенс

    13_01 Cиквенсовая реакция
    13_02 Приготовление сиквенсового геля и форез
    13_03 Методы расшифровки нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК /обзор/ /Артём Будилов/

    14. Выделение DNA из эукариот

    14_01 Выделение геномной ДНК из культуры клеток
    14_02 Выделение ДНК из крови
    14_03 Фенольный метод выделения DNA из мух
    14_04 Выделение DNA из мух c DEPC
    14_05 Выделение геномной ДНК из растений /Георгиева София/
    14_06 Выделение геномной ДНК (Holmes-Bonner) /Степан Белякин/
    14_07 Выделение геномной DNA с Dispase II /Степан Белякин/
    14_08 Сбор полевого материала для ПЦР /Владимир Чистяков/
    14_09 Очистка геномной ДНК из растений на силика-колонке
    14_10 Очистка геномной ДНК из слюны на силика-колонке

    15. Работа с RNA

    15_01 Выделение RNA из культур клеток
    15_02 Препарирование мышки
    15_03 Выделение RNA из тканей мыши
    15_04 Выделение RNA из мух (горячий кислый фенольный метод)
    15_05 Очистка polyA+ RNA
    15_06 Формальдегидный форез RNA - Northern
    15_07 Выделение RNA из мух центрифугированием через CsCl
    15_08 Выделение RNA из мух (с Протеиназой К) /Оксана Кравчук/
    15_09 Синтез RNA in vitro /Владимир Антоненко/

    16. Библиотеки

    16_01 Приготовление геномной библиотеки
    16_02 Скрининг фаговой библиотеки
    16_03 PCR-гибридизация после первичного скрининга

    17. Работа с белками

    17_01 PAAG электрофорез белков
    17_02 Окрашивание белковых гелей Coomassie brilliant blue R-250
    17_03 Окрашивание белковых гелей Zn/имидазолом
    17_04 Окрашивание белковых гелей серебром
    17_05 Определение концентрации белка на 3ММ
    17_06 Высушивание гелей без гель-драера
    17_07 Bicinchoninic acid protein assay kit
    17_08 Western блоттинг /Георгиева София/
    17_09 Dot-blot для определения рабочей концентрации антител /Георгиева София/
    17_10 PAAG электрофорез нативных белков /Алексей Колесниченко/
    17_11 Осаждение белков трихлоруксусной кислотой /Дмитрий Жарков/
    17_12 Высушивание гелей на пяльцах /Андрей Шанько/
    17_13 Высушивание гелей на рамке /Евгений Евдокимов/
    17_14 Окрашивание белковых гелей Coomassie brilliant blue G-250 /Инна Кригер/
    17_15 Осаждение белков сульфатом аммония
    17_16 Окрашивание белковых гелей коллоидным Кумасси G250 /Маша Поседко/
    17_17 Ещё один протокол с Coomassie brilliant blue G-250 /Shurik/
    17_18 Концентрация белка (методы Брэдфорда и Лоури) /Андрей Шанько/
    17_19 Иммунопреципитация хроматина /Саложин Сергей/

    18. Экспрессия белков

    18_01 Определение активности полимеразы
    18_02 Очистка Taq полимеразы (клон pTp4)
    18_02h Приготовление hot-start Taq полимеразы
    18_03 Очистка Pfu полимеразы (клон pETpfu в BL21(DE3)pLysS)
    18_04 Очистка His6-меченного белка на Ni-NTA колонке (e(y)2/mouse)
    18_05 Частота встречаемости кодонов в различных организмах

    19. Работа с культурами эукариотических клеток

    19_01 Базовые методы /Ольга Смирнова/

    20. Иммуногистохимия и in situ гибридизация /Елена Набирочкина/

    20_01 Обработка стекол
    20_02 In situ гибридизация на политенных хромосомах
    20_03 Фиксация и заливка в парафин (дрозофила)
    20_04 Иммуноокрашивание срезов имаго (дрозофила)
    20_05 Иммуноокрашивание политенных хромосом
    20_06 Гибридизация in situ на срезах с mRNA (дрозофила)

    21. Макро-методы

    96plate.xls
    384plate.xls
    21_01 96-луночная плашка
    21_02 384-луночная плашка
    21_03 Выращивание бактерий в 384-луночных плашках
    21_04 PCR на 384-луночных плашках
    21_05 Чистка и подготовка к работе spotting gadget
    21_06 Перенос индивидуальных бактериальных колоний в 384 луночную плашку - picking
    21_07 Перенос PCR продуктов на мембрану - spotting (QBOT)
    21_08 Перенос PCR продуктов на мембрану - spotting (AMAZON)
    21_09 Работа с "IGEL"
    21_10 Работа с "Hydra"

    22. Получение серийных делеций

    22_01 С помощью Exo III/MB nuclease
    22_02 С помощью DNase I
    22_03 Инсерцией гена устойчивости к антибиотику

    23. Complex гибридизация (анализ профилей экспрессии)

    23_01 Random primer на polyA+RNA
    23_02 Мечение total RNA с oligo(dT) праймера
    23_03 Обработка фильтров перед первой гибридизацией

    24. Цианобактерии

    24_01 Выделение геномной ДНК из цианобактерий /Костя Иночкин/

    25. Работа с Drosophila melanogaster /Павел Марданов, Дарья Копытова/

    25_01 Приготовление корма для мух
    25_02 Разведение в больших количествах
    25_03 Сбор эмбрионов D.melanogaster


    MolBiol.ru: http://molbiol.ru
    e-mail: redactor@molbiol.ru
    просмотров: 573207


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/
  • United States Patent and Trademark OfficeUnited States Patent and Trademark Office. Просмотр патентов — один из наиболее надёжных способов поиска информации.
  • Раздел "Current ProtocolsReference works" на сайте Wiley InterScience
    1. все известные мне серии "Current Protocols";
    2. химические и технические энциклопедии;
    3. Scientific and Technical Acronyms, Symbols, and Abbreviations - такой коллекции сокращений я больше нигде не видел /кажется — в свободном доступе/.
    Доступ платный, но не всё так плохо. Во-первых, в Москве по рукам бродит CD с полной коллекцией Current Protocols за позапрошлый год. Во вторых, можно попросить нужные тексты на Full Text.
  • Molecular CloningWeb-версия Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Joseph Sambrook and David W. Russell (Третье издание "Маниатиса", вышедшее в декабре 2001). О доступе было написано в колонке новостей. В онлайн издании — только протоколы, объясняющего текста нет. По рукам бродит копия онлайн сайта и pdf-вариант всей книги. Спрашивайте на форуме.


  • Сайты, которые сами держат коллекции протоколов:
  • Nucleic Acids Research methodsNucleic Acids Research methods — часть журнала, выходящая on-line. Состоит из методических статей. Уровень высокий.

  • Bio.comBio.com — большая коллекция протоколов: bioProtocol. Протоколов действительно очень много. Они разбиты по темам (иногда требуется хорошо подумать, прежде чем, сообразишь, в какой теме искать нужный протокол). Все протоколы прошли стандартную редакторскую обработку.
    /ссылку прислал Юрий Мошкин/

  • Molecular Biology ProtocolsMolecular Biology Protocols. Возможность поиска, форум. Ведёт Mark Strom.

  • iProtocoliProtocol Massachusetts Institute of Technology. Возможность поиска, форум. Поддерживается сотрудниками MIT.



  • Коллекции ссылок на протоколы:
  • Protocol Online-Your Lab's Reference BookProtocol Online-Your Lab's Reference Book. Сайт организован и поддерживается Dr. Long-Cheng Li. Хорошо структурированная коллекция ссылок на протоколы (в основном, различных лабораторий). Тематический форум.
  • ResearchLinkResearchLink — коллекция протоколов. Поддерживается компанией LabVelocity. Требуется регистрация, которая работает бесплатно в течение 30 дней /потом придётся регистрироваться ещё раз с новым адресом/. В основном это ссылки на протоколы мол. биол. компаний.
  • The Internet Directory of Molecular Biology and Biotechnology - коллекция большая, однако структурирована слабо. Имеется форум.


    Дополнения, комментарии, вопросы

    Гость /09.06.2005 12:58/
    Окраска гликопротеинов по Шиффу с помощью алцианового синего.

    Гели фиксируют 30 мин в 12.5%-ной ТХУ, ополаскивают дистиллированной водой и помещают на 50 мин в 1%-ный раствор иодной кислоты (HIO3) в 5%-ной уксусной кислоте. Избыток периодата удаляют, промывая гели несколько раз дистиллированной водой. Затем их погружают на 30 мин в 0,5%-ный раствор метабисульфита натрия, опять промывают дистиллированной водой и помещают в водный раствор, содержащий 0,5% алцианового синего и 3% уксусной кислоты. Через 4 ч фон обесцвечивают 7%-ной уксусной кислотой.



    xsana /23.09.2005 15:10/
    есть вопросик, народ кто имел счастье работать с красителем Хехста (bis-benzimide)? поделитесь опытом, пожалуйста!



    гость: m /24.09.2005 13:22/
    (xsana @ 23.09.2005 15:10)
    Ссылка на исходное сообщение  есть вопросик, народ кто имел счастье работать с красителем Хехста (bis-benzimide)? поделитесь опытом, пожалуйста!


    Мне приходилось работать. А что Вас конкретно интересует?



    abitur /20.11.2005 13:22/
    Кто лигирует по тупым концам? Как влияет ПЭГ?



    Redactor /20.11.2005 14:27/
    (abitur @ 20.11.2005 11:22)
    Ссылка на исходное сообщение  Кто лигирует по тупым концам? Как влияет ПЭГ?

    Если фрагменты - то очень хорошо; а если надо прицепить адапторы, то адапторов как не было -- только что обожглись.



    Гость /22.11.2005 14:24/
    Граждане,
    Кто-нибудь работает с DNA methylation? Есть задача посмотреть метилирование промоторов нескольких генов. Кто-нибудь может помочь советом, а лучше протоколом :)))? Предполагается использовать бисульфидный метод.
    Заранее благодарю за отзывчивость!
    В свою очеледь могу поделиться опытом по методу задержки в геле (ретардация).
    pivelena



    Regina /02.12.2005 16:36/
    Коллеги! поделитесь методикой проверки специфичности фосфотирозиновых антител



    Sergey S /20.12.2005 15:22/
    Уважаемый редактор,
    хотел бы выложить в раздел методику по иммунопреципитации хроматина. Как это можно сделать?
    Спасибо.



    Redactor /20.12.2005 17:49/
    (Sergey S @ 20.12.2005 13:22)
    Ссылка на исходное сообщение  Уважаемый редактор,
    хотел бы выложить в раздел методику по иммунопреципитации хроматина. Как это можно сделать?
    Спасибо.


    Можно прислать методику на redactor@molbiol.ru
    Вам спасибо!



    _Dimych_ /11.01.2006 02:14/
    Французский сайт форезных причиндалов. Содержит этакий учебник по всяким видам форезов (на аглицком), может быть вполне полезен начинающим, а может и не только. К сожалению, весь текст в виде графики выложен. В какой раздел складывать я не знаю.

    http://www.apelex.fr/anglais/applications/cadre.htm ( http://www.apelex.fr/anglais/applications/cadre.htm )



    _Dimych_ /11.01.2006 20:59/
    На этом сайте довольно много полезной индормации по разнообразным коммерческим ферментам, как то мол.веса, коеффициенты екстинции, оптимумы активности, условия определения активности и прочая фигня.

    http://www.worthington-biochem.com/index/manual.html ( http://www.worthington-biochem.com/index/manual.html )



    kozlovaolya /02.02.2006 11:38/
    Уважаемые коллеги!Поделитесь, пожалуйста, методами определения активности фосфолипазы С в нервной ткани. Заранее благодарна Вам.



    comp3v /02.02.2006 13:10/
    (_Dimych_ @ 11.01.2006 00:14)
    Ссылка на исходное сообщение  Французский сайт форезных причиндалов. Содержит этакий учебник по всяким видам форезов (на аглицком), может быть вполне полезен начинающим, а может и не только. К сожалению, весь текст в виде графики выложен. В какой раздел складывать я не знаю.
    http://www.apelex.fr/anglais/applications/cadre.htm ( http://www.apelex.fr/anglais/applications/cadre.htm )


    это есть в нормальном (текстовом) виде на http://nationaldiagnostics.com/articles.php/tPath/1 ( http://nationaldiagnostics.com/articles.php/tPath/1 ).



    Гость /08.02.2006 14:01/
    коллеги!У кого хорошо получаются пероксидазные конъюгаты? Поделетесь опытом



    Гость /12.02.2006 14:35/
    Уважаемые коллеги!
    Посоветуйте, пожалуйста, что делать, если не получается нормальный сиквенс ПЦР-продукта с автоматического сиквенатора? С самим ПЦР-продуктом всё в порядке (контроль чистый, после очистки на колонках Wizard на форезе видна 1 чёткая полоса соответствующей длины, то, что удаётся прочесть(200-300 нт максимум) соответствует предполагаемой последовательности). С праймерами тоже всё должно быть в порядке, т.к. не так давно с них был отсеквенирован другой продукт и всё было в порядке, читалось по 500-700 нт. Я уже переделывала пару раз продукт - но безрезультатно. Единственное, что могу предположить - может быть при очистке не полностью уходит ЭДТА из ТАЕ буфера и полимераза плохо работает. Может ли влиять на сиквенс, скажем, длина продукта? (Почему-то пока я сиквенировала продукты до 1000нт всё было нормально). Если кто-нибудь даст дельный совет, буду очень благодарна!



    анжелла /15.02.2006 10:09/
    подскажите методику определения Тх1 и Тх2 :цонфусед:



    Redactor /15.02.2006 16:04/
    Вообще-то такие вопросы, как выше лучше задавать на форуме в отдельных темах umnik.gif .



    Olena Bilyk /22.02.2006 23:01/
    Могу поделиться опытом по иммуногистохимии. Кто желает пишите
    Лена



    Гость /03.03.2006 21:41/
    Парочка вопросов по белковой химии, имеющих, можно сказать, "жизненно важное" для "дисера" значение:
    Люди! Встречал ли кто-нибудь методику экстракции белков бактериального s-слоя, не разрушающую саму клетку (клеточную стенку, внешнюю мембрану и т.д.)?
    А также методику отделения полисахаридной части гликопротеина от непосредственно белковой?

    Всем, кто поможет - заранее большущее спасибо!



    bagant /04.03.2006 00:03/
    Коллеги, кто нибудь знает методику приготовления из полиакриламида линейного полиакриламда?



    Гость /16.03.2006 17:51/
    Коллеги! У меня есть одни вопрос. Есть ли у кого-нибудь протокол хромотографии на протеин G сефароза? Очень нужно.



    vesanna /22.03.2006 11:13/
    Я больше химик, чем биолог, но так получилось, что работаю теперь с физической биохимией, а методы молекулярной биологии применять нельзя - "чужая" работа и "кормит" других :).
    Тематика:полипептиды, полисахариды, вещества средней молекулярной массы, токсины.Обращайтесь vesanna@rambler.ru.
    Занимаюсь углеродными гемосорбентами, гемосорбцией.
    Если что, буду рада информации по работе с крахмалом, желатином (желатинолем).
    Имею много лит. сводок по тематикам.
    Подскажите какие маркеры с высокой молекулярной массой Вы знаете?



    uzbek /24.03.2006 14:41/
    Коллеги! Занимался ли кто нибудь конъюгацией пероксидазы хрена с моноклональными антителами человека для твердофазного ИФА. Поделитесь опытом!



    Guest /30.03.2006 19:48/
    Скажите пожалуйста, какие скорости при упаковке Bio-Rex 70, нанесении и элюции?



    Гость /07.04.2006 16:28/
    Люди! Кто гонял пааг рнковые гели, подскажите, почему образцы не входят в гель, а остаются полосочкой в самом начале дорожки? гель 5%, время 1-2 часа, образцы-клеточная РНК из E.coli различной концентрации



    Гость /18.04.2006 16:25/
    Коллеги! Кто знает что нибудь о камерах для электрослияния при получении гибридом. С ПЭГом че то не прет. Помогите!



    Гость /09.05.2006 14:42/
    Народ, срочно нужна методический протокол твердофазного иммуноферментного анализа фитогормонов растений.



    A Chemist /09.05.2006 18:32/
    протокол твердофазного иммуноферментного анализа фитогормонов растений

    Не хочу Вас огорчать в День Победы, но, боюсь, тако(й)го нет в природе. weep.gif weep.gif weep.gif
    Твердофазный ИФА, как правило, это высокоспецифичный метод анализа, потому для каждого конкретного вещества (например, фитогормона) придется разрабатывать индивидуальный набор: получать антитела, иммунный (аффинный) сорбент, конъюгат фермента с Аг или Ат, а потом оптимизировать протокол.
    А если купите набор(ы), то протокол приложат бесплатно.

    В общем-то, вопрос Вы задали некорректно. Словосочетание "протокол ИФА" звучит как-то несуразно. Бывает протокол кислотно-основного титрования, определния глюкозы в сыворотке крови, есть даже протокол силанизации стекла, а вот то, что Вы просите... Протокол ИФА - это ведь всегда протокол для конкретного набора реагентов. А в общем виде "где возьмешь?", как говорил сами знаете кто.



    Guest /10.05.2006 12:29/
    Уважаемые коллеги ! Большая просьба к Вам поделится методическими рекомендациями
    по поводу разделения хлорофил-белковых комплексов ФС1 и ФС2 в условиях нативного
    электрофореза.



    Krystofer /16.05.2006 13:28/
    Очень нужна методика по выделению ДНК из фиксированых микропрепаратов



    Manukhov /28.05.2006 18:24/
    Коллеги! Если кто нибудь знает как очистить ДНК спермы лосося в больших колличествах - поделитесь опытом. Заранее благодарен.



    akapi /07.06.2006 17:56/
    уважаемые коллеги. кто-нибудь занимался иммунизацией крыс? конкретно меня интересуют протоколы получения неспецифического воспаления у крыс, например, подкожно вводят спирт или хлороформ...кто-нибудь владеет знаниями, я только по наслышке. спасибо за внимание:)



    Гость /09.06.2006 10:20/
    Для гостя от 9 мая. Мы занимаемся ИФА ИУК ЦК и АБК. Давайте адрес, вышлю протоколы (я так понимаю Вы имели в виду просто последовательность действий). Здесь писать слишком долго.



    Гость /27.06.2006 06:18/
    pojaluista pomogite
    kak ya mogu naiti programmu kolichestvennogo opredeleniya DHA



    borand /04.07.2006 11:20/
    необходима методика перикисного окисления липидов!!!спасибо.



    Гость /05.07.2006 12:23/
    А какая конкретно методика? Их дохрена сейчас. Что определять надо?



    Гость /05.07.2006 12:24/
    Кто-нибудь проводил микродиализ? Очень нужен метод!!!



    Guest /06.07.2006 12:01/
    Про проточную цитометрию: Срочно надо решить какой цитометр лучше FACSCalibur или EPICS XL. Никто из присустувующих не работал на подобном оборудовании. Знающие люди в отпуске. Help me, pls!!!
    Что такое система пробоподготовки и автосемплер?
    Можно ли обойтись без них? Насколько это осложнит работу?



    Дядя ФАКСер /06.07.2006 12:42/
    (Guest @ 06.07.2006 10:01)
    Ссылка на исходное сообщение  Про проточную цитометрию: Срочно надо решить какой цитометр лучше FACSCalibur или EPICS XL. Никто из присустувующих не работал на подобном оборудовании.  Знающие люди в отпуске. Help me, pls!!!
    Что такое система пробоподготовки и автосемплер?
    Можно ли обойтись без них? Насколько это осложнит работу?

    Ребята, я работал и с тем- и с тем.
    Берите Калибур - ибо у него (несмотря на то, что тоже 4 цвета)- не 1 , а 2 лазера - значит можно шире "играться" с комбинациями флуорохромов.
    Сисиема пробоподготовки- то бишь samplre preparation workstation - оддельный дивайс для подготовки семплов. Удобен в клинике при работе со стандартными китами.
    Автосемплер- "каруселька"- автоматический загрузчик пробирок ( в XL-MCL например).

    P.S. Кстати, на Калибуре и сортить можно (есть там такая опция)- но медленно smile.gif

    P.P.S. А для чего вам цитометр нуже? Под какие задачи? Фундаменталка или клиника?



    Guest /07.07.2006 10:00/
    (Дядя ФАКСер @ 06.07.2006 12:42)
    Ссылка на исходное сообщение  Ребята, я работал и с тем- и с тем.
    Берите Калибур - ибо у него (несмотря на то, что тоже 4 цвета)- не 1 , а 2 лазера - значит можно шире "играться" с комбинациями флуорохромов.
    Сисиема пробоподготовки- то бишь samplre preparation workstation - оддельный дивайс для подготовки семплов. Удобен в клинике при работе со стандартными китами.
    Автосемплер- "каруселька"- автоматический загрузчик пробирок ( в XL-MCL например).

    P.S. Кстати, на Калибуре и сортить можно (есть там такая опция)- но медленно smile.gif

    P.P.S. А для чего вам цитометр нуже? Под какие задачи? Фундаменталка или клиника?


    Спасибо огромное!
    Цитометр нужен сейчас для фундаментальных исследований (Клеточный цикл, апоптоз, CD-типирование и др.), в перспективе возможны клинические анализы (только перспектива эта очень далекая... rolleyes.gif )



    Гость /14.07.2006 15:25/
    Уважаемые коллеги! Будем ОЧЕНЬ признательны, если кто-нибудь подскажет нам, в чем растворить валиномицин так, чтобы соответствующий растворитель не повлиял на функциональное состояние митохондрий.
    Заранее благодарим!



    Гость /16.07.2006 16:56/
    Уважаемые коллеги!
    Кто-нибудь определял жизнеспособность микроводорослей методом дифференциального окрашивания? Поделитесь опытом!!!

    С уважение и надеждой,
    Ирина :))



    alex233 /23.07.2006 00:27/
    Насчет микродиализа вопрос хороший .Мы тоже хотим попробовать определять нейротрансмитеры в моозгах. Если кто его делал не мог бы в 2 словах описать методику.Заранее спасибо.



    Apis /28.07.2006 20:33/
    Коллеги, занимался ли кто из вас анализом ДНК пчел или хотя бы любых других видов насекомых, очень нужна информация. Ответьте.

    У нас в институте имеется прибор для тонкокапилярного электрофореза фирмы Агилент технолоджист (Германия). Если у кого есть методики
    для разгона фрагментов ДНК на этом приборе -сообщите пожалуйста.



    Гость /02.08.2006 10:38/
    Добрый день. Подскажите, пожалуйста, кто у нас в стране (какой НИИ) занимается вопросом получения белка (спирта) из нетрадиционного материала (опилки, земля и проч.)

    Спасибо,
    Илья



    Гость /16.08.2006 19:05/
    Добрый вечер.Кто-нибудь знает что-либо о моделировании повреждения ДНК окислителями?ПОМОГИТЕ!



    matveen /31.08.2006 06:40/
    УВАЖАЕМЫЕ КОЛЛЕГИ!помогите пожалуйста, материал о nick-трансляции.Где можно найти? О факторах, которые влияют, возможных ошибках и т.д.Заранее спасибо.



    Гость /04.09.2006 18:26/
    Народ!! помогите советом!!! а может кто и опытом :-)), пожалуйста!!! как можно определить наличие углевода в комплексе белок-углевод (в данном случае - гиалуроновой кислоты), может есть какая-то специфическая реакция, может окраской ПААГ. буду благодарна за любой совет



    lkorochkin /06.09.2006 10:42/
    Народ, у кого есть методика по получению культур клеток Drosophila melanogaster поделитесь!



    Faiz /06.09.2006 15:02/
    Дорогие коллеги! Нужна консультация по наладке метода определения степени метилированности (суммарной) ДНК человека. Заранее благодарен.



    Faiz /06.09.2006 15:04/
    Дорогие коллеги! Нужна консультация по наладке метода определения степени метилированности суммарной ДНК человека. Заранее благодарен. mol.gif



    Olori /07.09.2006 21:25/
    Подскажите, пожалуйста, где посмотреть методику регенерации сефадекса. Заранее спасибо!



    Гость /20.09.2006 12:32/
    Господа, подскажите пожалуйста. В какие условия и как надо поместить мутант белка с 2-мя заменами на Cys, которые торетически находятся на достаточно близком расстоянии для образования S-S связи, что бы они эту самую связь образовали. Было бы супер если у кого-нибудь есть протокол подобных исследований. Заранее благодарен.



    polosatiy /20.09.2006 12:38/
    Господа, подскажите пожалуйста. В какие условия и как надо поместить мутант белка с 2-мя заменами на Cys, которые торетически находятся на достаточно близком расстоянии для образования S-S связи, что бы они эту самую связь образовали. Было бы супер если у кого-нибудь есть протокол подобных исследований. Заранее благодарен.



    Гость /04.10.2006 10:50/
    Что такое "vicroarray analis"



    Гость /04.10.2006 11:09/
    Простите, конечно, должно быть, что такое Microarray analisis?



    Гость /10.10.2006 11:08/
    Где можно найти протоколы по выращиванию макрофагов? Начала работать с линией J 774 A.1. Возможно ли клетки обрабатывать не только трипсином, но и неэнзиматическим раствором для диссоциации клеток?
    Поделитесь, пожалуйста, своим опытом.



    bagant /12.10.2006 12:24/
    Уважаемые коллеги, будьте добры, поделитесь методами лиофильной сушки праймеров.



    maclaud /16.10.2006 13:22/
    коллеги, почему ничего не пишете о IS-PCR. нужны тонкости, помогите пожалуйста!спасибо



    Gleb N /20.10.2006 09:29/
    Уважаемые коллеги!!!!!!!!! Прошу помочь с методикой приготовления препаратов митотических хромосом Drosopila (из нервных ганглиев личинок)!Нигде не могу найти! Спасибо!



    Гость /23.10.2006 21:35/
    Други! Помогите с материалом по пожневной или поукосной гречихе. Спасибо. Фарыч!



    Гость /30.10.2006 11:29/
    Коллеги! Если кто-нибудь из вас делал иммунногистохимическое окрашивание на c-fos, поделитесь, пожалуйста, опытом. В частности, меня интересует, в каких соотношениях смешиваются компоненты из ABC kit. Заранее благодарю.



    chepe /31.10.2006 11:42/
    Подскажите, пож., методику окрашивания сиалил производных для количественного определения их в растворе. Спасибо!!!



    Гость /16.11.2006 12:37/
    HELP!
    Для сиквенса 16s ставила ПЦР с праймерами f27-r1392 и f530-r1525. Получала толстый фрагмент, но под ним шла паразитная полоска с низкой концентрацией в каждом случае. Элюировала толстую полосу из геля и ставила ре-ПЦР с теми же праймерами и еще с внутренними: с матрицы f27-r1392 ставила с праймерами 40-1392, 357-1392, с матрицы f530-r1525 с праймерами 530-1492. Во всех случаях та же самая история - идет дополнительная полоса. Вряд ли это внутреннее праймирование, но я боюсь, что при сиквенсе будет ерунда. Насколько плачевна моя ситуация? Может, я гоню волну?
    Заранее благодарна.



    Гость /17.11.2006 16:45/
    Народ!!!!! Помогите, пожалуйста!!!!!! Кто-нибудь работал с мРНК вирусных белков ВПГ и ЦМВ??? Поскажите, пожалуйста методику определения. И где можно достать необходимые реактивы!!!!!!!



    EfimovRoman /12.12.2006 11:17/
    Уважаемые коллеги!
    Подскажите пожалуйста, где можно обучиться методам аллозимного и микросателлитного анализа. В случае обучения рассматриваются различные варианты сотрудничества или другие варианты.
    Заранее благодарен



    Гость /26.12.2006 15:35/
    Уважаемые коллеги! Помогите, пожалуйста!!! Пытаемся оценить количество лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих Chk2 на проточном цитофлуориметре.Используем первичные антитела к Chk2 и вторичные антитела, меченные FITC (фирмы Becton Dickinson), клетки красим PI. Под микроскопом клетки светятся, киназа тоже. При цитометрии четко заметная популяция FITC-положительных клеток (Chk2)регистрируется только на одной из гистограмм (Count(осьY), FITC (ось Х))- около 17%. Подскажите,пожалуйста, как грамотно составить протоколы измерения и настроить параметры SS, FS,FL1, FL3.



    :) /02.01.2007 17:52/
    (Гость @ 04.10.2006 10:09)
    Ссылка на исходное сообщение  Простите, конечно, должно быть, что такое Мицроарраы аналисис?

    А почему бы не Microarray Analysis ? confused.gif confused.gif confused.gif
    http://www.nslij-genetics.org/microarray/ ( http://www.nslij-genetics.org/microarray/ )



    Гость /17.01.2007 03:37/
    vot site, neplohoy, s raznymi basic methods in various fields of Mol/Cell Biol, i, kazhetsya, nadurnyak:
    http://www.molecularstation.com/protocol-links/ ( http://www.molecularstation.com/protocol-links/ )



    Гость /17.01.2007 04:05/
    i vot yeshe odin classnyi site:
    www.google.com
    chego napishesh, na vse otvet dast....



    Гость /29.01.2007 20:16/
    подскажите пожалуйста нингидриновую методику количественного определения альфа-аминного азота.



    tohir-v /01.02.2007 18:03/
    полдскажите пожалуйста метод выделения микро РНК из растений.



    Гость /06.02.2007 13:36/
    Гость /16.11.2006 11:37/
    HELP!
    Для сиквенса 16s ставила ПЦР с праймерами f27-r1392 и f530-r1525. Получала толстый фрагмент, но под ним шла паразитная полоска с низкой концентрацией в каждом случае. Элюировала толстую полосу из геля и ставила ре-ПЦР с теми же праймерами и еще с внутренними: с матрицы f27-r1392 ставила с праймерами 40-1392, 357-1392, с матрицы f530-r1525 с праймерами 530-1492. Во всех случаях та же самая история - идет дополнительная полоса. Вряд ли это внутреннее праймирование, но я боюсь, что при сиквенсе будет ерунда. Насколько плачевна моя ситуация? Может, я гоню волну?
    Заранее благодарна.
    ___________________________________
    Попробуйте оптимизировать концентрации праймеров в реакционной смеси.



    Гость /06.02.2007 17:26/
    Уважаемые коллеги, помогите советом. При определении ПОЛ в мембранах эритроцитов обязательно проводить гемолиз или можно обойтись без него и работать с изотоническим раствором целых эритроцитов. Дело в том, что в одних методиках требуется брать осадок эритроцитов после гемолиза, в других - гемолизат, а в третьих вообще не надо проводить гемолиз. Заранее благодарны.



    Гость /12.02.2007 17:11/
    Коллеги, нужно подробное описание метода детекции мутаций у дрозофил Мёллер-5 на английском языке. Посодействуйте плиз. Аспирантик у нас из Индии. По русски не сечет, а задача ему, болезному поставлена. Жаль, бедолагу ))



    fresl /19.02.2007 08:54/
    Подскажите пожалуйста каким способом лучше всего хранить человеческую днк?



    PRRSS /19.02.2007 11:06/
    Люди,добрые, поможите.
    При использовании комерческого набора твердофазного ИФА для определения Ат с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком (Е.coli)возможно ли частичное ингибирование реакции при наличии в сыворотке специфических Ат???



    guest: ммм /19.02.2007 12:22/
    ---возможно ли частичное ингибирование реакции при наличии в сыворотке специфических Ат.

    Возможно, только наличие или присутствие антител здесь не так важно, просто когда они присутствуют вы можете это ингибирование заметить, если у вас есть независимый метод определения антител. А причина наличие в сыворотке веществ препятствующих связыванию антител с антигеном.

    --При использовании комерческого набора твердофазного ИФА для определения Ат с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком.

    Кстати ИФА конкурентный прямой(не прямой) или простой на связывание (ессно не прямой)



    Гость /20.02.2007 14:21/
    коллеги, пришлите метод спектрофотометрический определения каталазной активности и условия определения



    Гость /07.03.2007 11:39/
    А что такое NT (применительно к температуре)? Впервые встречаю такое обозначение!



    Гость /16.03.2007 10:38/
    Народ помогите кто может, подскажите как определить белок если pH больше 11, а в среде полиэлектролиты (Полистиролсульфонат и полиаллиламин) ????



    guest: ммм /18.03.2007 12:37/
    ---Народ помогите кто может, подскажите как определить белок если pH больше 11, а в среде полиэлектролиты (Полистиролсульфонат и полиаллиламин) ????

    Как, как? Во первых может помочь Лоури.
    Во вторых избавится надо от этого гафтна, к тому же совершенно непонятно, как это у вас полиамин на полисульфонат не залипает в растворе



    Elena- /18.03.2007 21:06/
    (lkorochkin @ 06.09.2006 01:42)
    Ссылка на исходное сообщение  Народ, у кого есть методика по получению культур клеток Drosophila melanogaster поделитесь!


    У меня есть методика получения культур клеток фибробластов зародыша ципленка. Если попробовать с ее помощю получить культуру клеток из личинок или куколок?



    Гость /19.03.2007 18:37/
    Сорчно! -(заказываем реактивы быстро-быстро!) нужны флюорометрические методикм определения серо тонина, норадреналина и дофамина. Погдскажите хотя бы ссылки литературные или в нете, где посмотреть.



    Cathie22 /20.03.2007 10:02/
    (Гость @ 07.03.2007 11:39)
    Ссылка на исходное сообщение  А что такое NT (применительно к температуре)? Впервые встречаю такое обозначение!

    Вроде это комнатная температура=normal temperature. Хотя скорее должно быть RT=room temperature rolleyes.gif



    Гость /20.03.2007 14:25/
    Большое спасибо, но к сожелению от "гафтна" я избавиться не могуа,а вот полиамин на полисульфонат "залипает" но так и задумано, есть еще метода??? и не страшен ли для Лоури pH 12???



    guest: ммм /20.03.2007 18:12/
    --определить белок если pH больше 11
    ---не страшен ли для Лоури pH 12
    Следующий вопрос будет про рН 13, Да!?
    Вы пропись Лоури читали? Там первый раствор это двухвалентная медь в 0.1М NaOH
    рН подозреваю между 12 и 13.

    ---но к сожелению от "гафтна" я избавиться не могуа,
    Какой-то вы "Брюс не всемогущий".
    --а вот полиамин на полисульфонат "залипает", но так и задумано.

    Дык изче и извращенец, что за ужосные цели у таких экспериментов.

    Это же надо, вы наверное наблюдаете копулятивные процессы между полиэлектролитами. no.gif wink.gif

    А вообще все это мне напоминает добавление коагулянтов к органическим отходам.



    Гость /21.03.2007 11:37/
    Почти, Почти, Почти угадал, мы занимаемся инкапсулированием белков в полиэлектролитные микрокапсулы (метод поочередной адсорбции), но такие недюженные знания в коагуляции органических отходов весьма похвальны!!!! Не менее интересны и предложения о копулятивных процессов между полиэлектролитами!!! А вот Лоури в конечном растворе не дает и pH 11.
    P.S. Спасибо, я так понял (между рассказами о моих извращенчиских наклонностях) pH 12 для Лоури копейки.



    guest: ммм /21.03.2007 14:40/
    -- А вот Лоури в конечном растворе не дает и pH 11.

    Дык! то в конечном. А в начальном сильная щелочь и она там штатно так что ессли в вашем исходном растворе будет рН 12 то это "копейки"

    Вод "гумос" это ваш с Фолиным может осадки нехилые давать так, что рекомендую SDS побольше напихать в пробу, на всякий случай.



    Гость /22.03.2007 00:50/
    15_01 - это протокол уже неделю не открывается, а мне надо РНКу из вируса выделить:( М.б. кто-нить знает как это лучше всего зделать?



    Гость /25.03.2007 15:25/
    Нароод. Подскажите где найти методы по работе со стволовыми клетками. В частности регенерации тканей.



    Гость /26.03.2007 06:33/
    Люди добрые, подскажите, пожалуйста, где найти концентрацию кислорода в нМолях в водных растворах при различных температурах.



    Гость /28.03.2007 18:25/
    Люди добрые, помогите советом:

    пытаюсь получить полную ORF of cDNA (из ЕСТ библиотеки), which is bloody LONG (~5-10 kb)... естесно, есть 3-конец, но 5 не дается: RACE не работает (игрался с температурами ПЦР, нестед праймеры, концентрацией Mg)

    Если знаете, можно ли как-нибудь RACE работать заставить, или гиблое дело? Если так, то чего делать? Я думаю, скрининг ЕСТ библиотеки имеющимся фрагментом, в надежде чего поближе к 5-концу получить. Еще идеи?

    Спасибо заранее,
    Антон



    guest: Anton /28.03.2007 18:29/
    Люди добрые, помогите советом:

    пытаюсь получить полную ORF of cDNA (из ЕСТ библиотеки), which is bloody LONG (~5-10 kb)... естесно, есть 3-конец, но 5 не дается: RACE не работает (игрался с температурами ПЦР, нестед праймеры, концентрацией Mg)

    Если знаете, можно ли как-нибудь RACE работать заставить, или гиблое дело? Если так, то чего делать? Я думаю, скрининг ЕСТ библиотеки имеющимся фрагментом, в надежде чего поближе к 5-концу получить. Еще идеи?

    Спасибо заранее,
    Антон



    dpl /30.03.2007 20:10/
    помогите пожалуйста!!
    Если у кого-то есть методика окрашивания стволовых клеток на щелочную фосфотазу, напишите пожалуйста.



    guest: Гость /12.04.2007 20:32/
    Люди добрые, помогите, пожалуйста:
    кто-нибудь выделял 2-ОГДК в больших количествах? Методику подсказать можете?
    Спасибо заранее,
    Надя



    Гость /12.04.2007 22:52/
    Коллеги! Посоветуйте.... никак не могу выделить ДНК из стрекоз из коллекции засушенных, 100-летней и более двности. увеличивал продолжительность лизиса, ничего не выходит..



    Гость /16.04.2007 00:11/
    Подскажите, пожалуйста, метод ПЦР на колониях дрожжей. Пробовала кипятить в 0,25%SDS+0.05M NaOH и добавлять прямо в смесь ПЦР. Результаты неоднозначные, интенсивность сигнала меняется при повторах. Прямо не знаю, что делать. Спасибо.

    С ув. Елена.



    Jakov /23.04.2007 07:35/
    уважаемые коллеги! подскажите пожалуйста методику обработки РНК ДНКазой!
    пример протокола. спасибо.



    guest: ммм /23.04.2007 12:59/
    -методику обработки РНК ДНКазой!
    пример протокола. спасибо.

    Вы ишдиваетесь?!

    10-20 единиц Кунитца ДНКазы на мг ДНК и Магний 1-2мМ, 2ч на комнате. Все.
    Секрет в том, что ДНКаза долджна быть RNAse free, а такую выпускает только Рош, остальные, по их лицензии.



    Гость /25.04.2007 10:32/
    Глубокоуважаемые коллеги!
    Планируем определять содержание внеклеточной ДНК (в тесте с DAPI) в плазме крови грызунов, испытывающих различные воздействия. Подскажите, пожалуйста, каким флуориметром будет удобнее пользоваться (чтобы было дешево и сердито). Пока у нас нет никакого, но есть возможность приобрести. Или стоит приобрести только лампу и фильтры и при необходимости переставлять их на "соседский" прибор?



    Гость /27.04.2007 14:14/
    уважаемые коллеги и др. кто занимется выделением тотального растительного белка (суммарного,вобщем разных и т.д.)помогите с методикой, последняя надежда на вас люди добрые.....



    Гость /17.05.2007 12:43/
    Подскажите пожалуйста метод выделения Рнк из растений (для ПЦР)



    Гость /21.05.2007 15:40/
    подскажите методику выделения суммарного белка из пшеницы (проростков) заранее спасибо



    Гость /03.06.2007 12:36/
    Народ,не будет ли кто так сказочно любезен подсказать методику выделения мтДНК из дрозофилы.
    Заранее many thanks!



    ада /27.06.2007 03:21/
    привет.
    никто не подсукажет как выделять днк из фитофторы?



    Гость /03.07.2007 12:33/
    Здравствуйте! Не подскажите методы выделения и определения дендритных клеток?



    Vilvarin /04.07.2007 01:17/
    Здравствуйте уважаемые коллеги! Помогите студентке, то есть мне! Занимаюсь ислледованием клеток крови больных СКВ(системной красной волчанкой) и очень нужна методика выделения гранулярных клеток крови, а именно - нейтрофилов и эозинофилов(авторы не помешают)! Буду весьма признательна!



    guest: Гость /11.07.2007 10:53/
    Уважаеммые коллеги! Может ли кто-то подсказать методику исследования апоптоза с использованием бромэтидия. Причём разгонка делается не на агарозе! На чём-то жутко дешёвом ( чего нельзя сказать об агарозе!) Слух принёс человек, который абсолютно не шарит в молекулярке. Я же теряюсь в догадках - сама больше по белкам. Если не жалко, можете писать на мыло fyodorova2000@mail.ru. confused.gif



    Гость /18.07.2007 10:35/
    Уважаемые коллеги!!! Начимающий биолог, провожу работу в области электрофоретических свойств токсинов, белков, на основе капиллярного электрофореза системы Adgilent 3D CE. Пожалуйста поделитесь информацией. Буду очень признателен и благодарен.
    P.S. - Если кто откликнется пожалуйста сообщите адрес куда обратиться. Еще раз спасибо за внимание!



    Гость /27.07.2007 17:33/
    4 M guanidine thiocyanate, 0.2 M sodium acetate pH 5.0, 25 mM EDTA, 2.5% (w/v) PVP-40 1 М potassium acetate помогите приготовить лизирующий буфер при экстракции РНК загвоздка с ацетатом Na



    Гость /12.08.2007 09:01/
    Здравствуйте! Я студентка, занимаюсь иммунитетом растений, а конкретнее действием на него дельтаэндотоксина Bacillus thuringiensis. Нужно провести анализ плодов огурца на наличие нитратов. Помогите, пожалуйста, с методикой.
    e-mail: aleksa-simonova@mail.ru



    Гость /03.09.2007 10:07/
    Подскажите пожалуйста! Мне нужно порезать ДНК, как ее можно озвучить, сколько по времени, при каких условиях?



    Guest /03.09.2007 10:42/
    Если Вам важно "не угробить" белки, то можно озвучить ДНК импульсами по 10-15 сек. на ледяной бане, с перерывами на охлаждение. А какой объем вам нужно "озвучить"? Если это эппендорфф, то суммарное время 60-70 сек. озвучки дадут фрагментацию ДНК около 500-700 пар. Но это очень примерно, т.к. длина фрагментов зависит от конкретных условий (объем раствора, мощность озвучки, концентрация ДНК, форма электрода и даже форма сосуда, в котором "озвучиваете").



    Гость /03.09.2007 16:22/
    Спасибо,мне именно это и нужно!



    Гость /07.09.2007 08:57/
    Здравствуйте уважаемые коллеги! Посоветуйте что делать если линейные мыши не дают толком асцит (1-2 мл от силы), да к тому же энтерит страшный. Может пристан токсичный?



    Ilina Nadezhda /17.09.2007 09:44/
    Уважаемые коллеги! Может у кого-нибудь есть условия проведения FISH в суспензии клеток, чтобы при этом не разрушалась их оболочка.



    guest: ммм /17.09.2007 12:06/
    Это как? Условия денатурации двухцепопочной ДНК не располагают к сохранению клеточной оболочки.



    Ilina Nadezhda /18.09.2007 10:53/
    Есть статьи, где умельцы проводят амплификацию ДНК в клетках, потом проводят гибридизацию in situ. Но протоколов нет! Может быть кто-то делал подобное у нас?



    guest: ммм /18.09.2007 11:58/
    Ну есть, но это не я. В Петергофе у Гагинской почти на поток поставлено. Только оболочки все равно ек.



    LLEC /19.09.2007 13:17/
    Помогите найти протоколы как красить культуру клеток при помощи пероксидазы и фосфотазы?



    SDmitriyV /19.09.2007 16:12/
    Всем доброго время суток!
    Коллеги, поделитесь плиз методикой по выделению цитоплазматической и митохондриальной фракций белковых лизатов из культуры клеток (состав лиз-х буферов и т.д.) для Western Blot анализа.
    Конкретноая задача: Посмотреть в динамике выход цитохрома С из митохондрий в цитоплазму.

    Заранее благодарю!



    Гость /23.09.2007 19:35/
    Люди!!!!!!Спасите!!!!я студентка ММА им Сеченова...нам кое как объяснили титрирование.....в четверг уже контрольный модуль.....у мня есть все эти 13 вариантов....но решается у всей моей группы....тока по 2-3 задания(((((я уже не знаю куда обращаться(((



    LLEC /15.10.2007 13:07/
    кто нибудь что нибудь о миграции клеток,использование 6ти канальных часберов,хемотаксис



    Гость /17.10.2007 00:42/
    Коллеги! Поделитесь,пожалуйста, методами экстракции митохондриальных белков из клеток и тканей для Western Blot анализа. Заранее благодарна. e-mail: alina_1000@mail.ru



    Гость /23.10.2007 13:53/
    Коллеги поделитесь знаниями? или скиньте ссылку!Генотипирование лошадей и КРС???
    zorya_85@mail.ru Заранее спасибо!



    bioandy /02.11.2007 14:18/
    Уважаемые коллеги! Если есть возможность поделитесь пожалуйста методическими публикациями или скиньте ссылку:
    Методы трансформации у растений микробомбардированием частицами золота с иммобилизированой ДНК. achaplya@yahoo.com
    Зарание благодарен!



    Gulmira /15.11.2007 18:56/
    Уважаемые коллеги! Подскажите почему у меня ДНК получается короткой, нужна длинная. Буду благодарна.



    guest: ммм /15.11.2007 20:09/
    -Уважаемые коллеги! Подскажите почему у меня ДНК получается короткой,

    потому что вы ее ломаете.
    -- нужна длинная. Буду благодарна.
    Больше нескольких сотен килобаз получить трудно обычными методами.



    Gulmira /22.11.2007 16:49/
    Уважаемые коллеги! Поделитесь методикой получения длинной геномной ДНК бактерий. Заранее благодарю.



    Гость /22.11.2007 19:06/
    Привет всем! У меня тут по работе задача, посмотреть является ли STAT3 транскрипционным фактором нашего гена. Вопрос, существует ли клонированный STAT3 в активированной форме (как это есть для NFkB)? Заранее спасибо



    guest: ммм /22.11.2007 19:43/
    -- меня тут по работе задача, посмотреть является ли STAT3 транскрипционным фактором нашего гена.

    А промотор то от гена у вас есть, попробуйте сделать гипершифт с антителами на STAT3 на последоватьельности вашего промотора. Только антитела должны быть такими чтоб не мешали ДНК связыванию фактора.



    Гость /23.11.2007 11:22/
    Не, в том то и дело, что промотора мы толком и не знаем. Я посмотрела, вроде как промоторная зона, с которой может связываться STAT3, располагается очень далеко от нашего гена (порядка 40килобаз) и возможно контролирует не только наш ген, но и весь кластер (в нем еще 5 генов). Мне для того-то чистый STAT3 и нужен, чтобы понять, кто от него активируется и где промотор искать



    Act /23.11.2007 13:05/
    ya student 4 kursa i tema diplomki: poluchenie kratkofragmentnix DNK phosphoamidnim sintezom nukleinovix kislot. podskajite kuda bol`she vsego obrachat` vnimanie, tak kak ya zanimayus sintezom tol`ko 3 nedeli i mne bi xotelos` ne teryat` vremya po prostu. kstati ya ximik.



    Гость /23.11.2007 13:40/
    ответ ммм: я еще раз посмотрела литературу и посчитала. Вы привы, гипершифт нам подходит( я правда его никогда не делала). Реально ли сделать гипершифт на 12000бп? Потому как я нашла метод на очень короткие участки (100-500бп). Мой план отписиарить весь большой кусок, затем порезать его (например NOT1)и только потом дать транскр.фактор и антитела.



    guest: ммм /26.11.2007 21:25/
    --Реально ли сделать гипершифт на 12000бп?

    Нет конечно, да и бессмысленно. Это же чуть ли не в 100 раз длиннее чем промоторные области.

    ---Потому как я нашла метод на очень короткие участки (100-500бп). Мой план отписиарить весь большой кусок, затем порезать его (например NOT1)и только потом дать транскр.фактор и антитела.

    А вы будете писить 12kb?

    В вашем случае возможно имеет смысл использовать хроматин имунопреципитацию.
    http://molbiol.ru/protocol/17_19.html ( http://molbiol.ru/protocol/17_19.html )

    Вот только как проанализировать результат. Если у вас есть сиквенс этих 12kb, то можно просто с шагом 1000 или 2000b подобрать праймеры вдоль всего фрагмента и попробовать с каждым из отрезков. А вот если сиквенса нет то придется подбирать какие-то вырожденные праймеры под промоторные области. Ну и возможны контаминации при использовании вырожденных праймеров.



    guest: ммм /26.11.2007 21:29/
    ну и в принципе ChIP ПЦР фрагменте.



    Гость /06.12.2007 07:35/
    протокол ИФА требуется,плз. если есть можете на этот е-mail: dnar@ngs.ru скинуть



    guest: ммм /06.12.2007 10:54/
    -протокол ИФА требуется,плз. если есть можете на этот е-mail: dnar@ngs.ru скинуть
    какого ИФА сколько антигенов стоолько и протоколов не говоря уже о вариациях в разных фирмах производителях. В разних ферментных метках и тд и тп.



    lagumok /09.01.2008 09:38/
    Привет всем! не подскажете особенности приготовления поликриламидного геля. какой буфер использовать. просто всегда работала с агорозным. Заранее спасибо



    guest: ммм /09.01.2008 15:44/
    --Привет всем! не подскажете особенности приготовления поликриламидного геля. какой буфер использовать. просто всегда работала с агорозным. Заранее спасибо.

    Какого геля! Для укладки волос? Для разделения ДНК? Для разделения РНК? Для разделения белков?

    Вы сайт читать умеете?:
    http://molbiol.ru/protocol/11_04.html#s3 ( http://molbiol.ru/protocol/11_04.html#s3 )
    http://molbiol.ru/protocol/13_02.html ( http://molbiol.ru/protocol/13_02.html )
    http://molbiol.ru/protocol/17_01.html ( http://molbiol.ru/protocol/17_01.html )
    http://molbiol.ru/protocol/17_10.html ( http://molbiol.ru/protocol/17_10.html )



    Kryshen Kirill /11.01.2008 13:23/
    Уважаемые коллеги! Кто-нибудь оценивал фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов. Поделитесь опытом пожалуйста.



    Гость /13.02.2008 15:32/
    Дорогие коллеги!
    Регистрирую генноинженерную субстанцию. Требуют в "определении содержания примесей ДНК штамма-продуцента" расписать методику молекулярной гибридизации подробнейшим образом. Подскажите методику получения денатурированной ДНК из спермы лосося и кстати какой она фирмы. Может есть где-то стандартные протоколы?
    Леонова Наталья



    Гость /15.02.2008 11:21/
    Здравствуйте, коллеги!
    Подскажите, пожалуйста, при какой найменьшей концентрации спирта этилового начинается денатурация белка или где эту информацию можно найти. Заранее благодарю



    guest: ммм /15.02.2008 16:57/
    ---Подскажите методику получения денатурированной ДНК из спермы лосося и кстати какой она фирмы. Может есть где-то стандартные протоколы.

    --Подскажите методику получения денатурированной ДНК из спермы лосося

    Водный раствор(или в ТЕ-буфере) ДНК держать на кипящей водяной бане 5-10'.

    --кстати какой она фирмы.

    Любой!

    --Может есть где-то стандартные протоколы.
    В смысле фарм статьи. Тогда ищите в международной фармации.

    Если просто методику, то в Маниатисе

    http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=97211 ( http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=97211 )



    guest: ммм /15.02.2008 17:01/
    --Здравствуйте, коллеги!
    Подскажите, пожалуйста, при какой найменьшей концентрации спирта этилового начинается денатурация белка или где эту информацию можно найти. Заранее благодарю

    Все зависит от того что это за белок один он, или в компании других и от температуры раствора.

    --или где эту информацию можно найти.

    В оригинальных статьях.(База PubMed) По биофизике денатурации или в старых биохимических статьях. По идее с такой информацией должно быть не густо. Но что-то обязательно найдеся.



    Тфтьяна /17.02.2008 18:56/
    Подскажите пожалуйста методику окраски эндокринных клеток по Гримелиусу и Массона-Гамперга



    Гость /19.02.2008 14:27/
    --Здравствуйте, коллеги!
    Подскажите, пожалуйста, при какой найменьшей концентрации спирта этилового начинается денатурация белка или где эту информацию можно найти. Заранее благодарю

    Все зависит от того что это за белок один он, или в компании других и от температуры раствора.

    --или где эту информацию можно найти.

    В оригинальных статьях.(База PubMed) По биофизике денатурации или в старых биохимических статьях. По идее с такой информацией должно быть не густо. Но что-то обязательно найдеся.
    Спасибо, еще раз



    guest: Гость /22.02.2008 19:36/
    ПОМОГИТЕ!!! PLEASEЕЕЕ!!!! Какой комплекс образует додецилсульфат натрия с белком при электрофорезе???



    anna.exe /24.02.2008 04:07/
    Коллеги, занимаюсь культурой эндотелиальных клеток. По каким-то причинам клетки при выделении отказываются сползать на коллаген. Подскажите с чем это может быть связано. confused.gif



    Гость /25.02.2008 13:42/
    всем привет!кто нибудь знает методы Бредфорда,Сушки и ультрафильтрации хромотографии че-то я тут не нашла



    Гость /25.02.2008 19:43/
    Уважаемый гость, который че-то здесь не нашел. Что именно вы хотите узнать? Как высушить и проультрафильтровать хроматографию, что ли? Измерение концентрации белка по Брэдфорду - здесь: http://www.molbiol.ru/protocol/17_18.html ( http://www.molbiol.ru/protocol/17_18.html )

    PS: В правильно сформулированном вопросе - половина ответа.

    PPS: Поиск рулит.



    Ig Lebedev /05.03.2008 11:48/
    Уважаемые коллеги,
    подскажите, пожалуйста, где можно
    купить РНК для проточника
    RNase A
    Type I-AS
    кат номер R 5503

    Спасибо!



    Ербол /27.03.2008 16:49/
    Уважаемые коллеги,
    подскажите, пожалуйста где достать методику определение константу седиментации вируса



    Гость /23.04.2008 22:11/
    Дайте, пожалуйста, информацию о храниении и использовании реактивов для ПЦР: что, как и сколько можно размораживать/замораживать и как долго держать в тепле: полимеразу (знаю, что нельзя доставать из морозильника, но если все же приходтся), dNTP, магний, буфер...
    Спасибо.



    Ъ /24.04.2008 23:05/
    wink.gif
    (Гость @ 23.04.2008 21:11)
    Ссылка на исходное сообщение  Дайте, пожалуйста, информацию о храниении и использовании реактивов для ПЦР: что, как и сколько можно размораживать/замораживать и как долго держать в тепле: полимеразу (знаю, что нельзя доставать из морозильника, но если все же приходтся), dNTP, магний, буфер...
    Спасибо.

    Все зависит от качества исходных компонентов. Чем меньше замор-размор., тем лучше и поэтому нужно максимально АЛИКВОТИРОВАТЬ растворы. А еще лучше вообще не замораживать и держать при 4 град. Я сам обхожусь и без холодильника ... shuffle.gif cool.gif



    Grumeza Radu /02.05.2008 01:37/
    Checking DNA labeling (dot blots), digoxigenin & biotin

    1. Dilute the labeling DNA as follow:
    a. 1µl DNA + 19 µk MQ
    b. 1µl DNA + 9µl MQ
    2. Mark the Hybond N+ membrane with pencil to indicate the position of the DNA probes to be tested. Leave about 1cm between each position. Include a place for 1 X TE as a control
    3. Load 1µl of each DNA probe (and 1X TE control) onto membrane
    4. Leave to dry for 1h at 80C
    5. Place membrane in buffer 1 (0.1 Tris-HCl, 0.15 M NaCl, ph 7.5)
    6. Incubate 30 min in buffer 2 (0.5 % blocking reagent in buffer 1), shake gently
    7. Drain membrane slightly and distribute 5 ml of the anti-DIG – AP, streptavidin-AP solution over the membrane (1:5000 = 150 mU/ml. 1µl in 5 ml buffer 2)
    8. Incubate the membrane at 37C for 30 min
    9. Wash the membrane in buffer 1 for 3x5 min
    10. Transfer membrane to buffer 3 (0.1 M Tris ph 7.5, 0.1 M NaCl, 0.1 M Mg Cl2) for 2 min
    11. Add 22 µl NBT to 5 ml buffer 3 and mix gently
    12. Add 16.5 l BCIP to the NBT solution and mix gently
    13. Add 5 ml NBT/BCIP detection reagents and leave for 5-10 min. in the dark to fully develop the color
    14. Wash the membrane in water and air dry



    Dinok /02.05.2008 18:07/
    как можно самим приготовить формальдегид?



    Крыска /05.05.2008 11:55/
    (Dinok @ 02.05.2008 18:07)
    Ссылка на исходное сообщение  как можно самим приготовить формальдегид?

    Теоретически можно окислить метанол чем-нить типа оксида железа...
    Но не проще ли просто купить



    Гость /12.05.2008 13:33/
    Люди!!!кто-нибудь выделял липопротеины низкой плотности,дайте намек али ссылку на методику!!пжааааалста!



    Гость /12.05.2008 13:44/
    {{Elena_ /18.03.2007 20:06/
    (lkorochkin @ 06.09.2006 01:42)
    У меня есть методика получения культур клеток фибробластов зародыша ципленка.}}}}


    Еlena, ты не могла бы прислать эту методику на мой мэйл, пожалуйста, grif-rent@rambler.ru
    заранее спасибо.



    Гость /03.06.2008 10:10/
    подскажите, пожайлуста,состав буфера для проточной цитометрии растительных тканей



    taniasm /17.06.2008 16:04/
    Скажите, пожалуйста, где достать методику по определению содержания диаминопимелиновой кислоты у актиномицетов. очень надо!



    Гость /18.06.2008 11:25/
    Glupiy vopros - kolonka 10/30 chto znachit? Spasibo.



    Guest /19.06.2008 16:26/
    Подскажите, пожалуйста, как собирать и хранить кровь в полевых условиях (в теч. 1-4 недель, заморозка невозможна), для дальнейшего выделения ДНК. Никак не могу найти конкретных методов!



    Ъ /19.06.2008 17:52/
    (Guest @ 19.06.2008 15:26)
    Ссылка на исходное сообщение  Подскажите, пожалуйста, как собирать и хранить кровь в полевых условиях (в теч. 1-4 недель, заморозка невозможна), для дальнейшего выделения ДНК. Никак не могу найти конкретных методов!

    Выбор способа хранения крови в полевых условиях, как ни странно, зависит от предстоящего метода выделения ДНК да и от решаемых задач... umnik.gif Мне понравилось сушить образцы крови на фильтровальной бумаге (пару часов на воздухе, но не на солцепеке no.gif , и в Зиплок-пакет) и выделять ДНК спокойно в лабе стандартным китом. Бумагу рекомендую предварительно пропитать ЭДТА.



    Annika /25.06.2008 17:54/
    Доброго времени суток!!
    Подскажите, пожалуйста, методу выделения головного нервного ганглия Drosophila melanogaster из куколки (для приготовления препаратов), либо методу приготовления гистологических срезов - если это вообще делают с куколками...
    По-идее, нервная система гистолизу не подвергается...



    kostroma /02.07.2008 14:02/
    Здравствуйте! Подскажите пожалуйста методику приготовления компетентных клеток дрожжей K.lactis для электропорации. Спасибо.



    Alelle /08.07.2008 19:45/
    Коллеги, подскажите, пожалуйста, методику получения экстрактов РАСТЕНИЙ для опреедления содержания нитритов реактивом Грисса (Sigma). Кто знает, ответьте, будте добры, на alelle@online.ua



    Гость /31.07.2008 05:20/
    Кто-нибудь определял резус фактор ПЦР-ом, ДНК из хориона?



    vetdoctor.80 /21.08.2008 14:13/
    Люди помогите с электрофорезо мочи, он у нас не проходит!!!!У нас вет врачей!! Если у кого-нибудь есть данные по этому или книги подскажите где это можно найти!!!! Заренее очень благодарна



    Доктор Хаус /21.08.2008 22:18/
    (vetdoctor.80 @ 21.08.2008 13:13)
    Ссылка на исходное сообщение  Люди помогите с электрофорезо мочи, он у нас не проходит!!!!



    Сробно отрубайте электричество!



    Гость /28.08.2008 12:10/
    подскажите пожалуйста точную методику очистки асцитной жидкости (или сыворотки)с помощью афинной хроматографии. В наличии есть бром-циан сефароза. Буду благодарен!



    guest: ммм /28.08.2008 15:33/
    --подскажите пожалуйста точную методику очистки асцитной жидкости (или сыворотки)с помощью афинной хроматографии. В наличии есть бром-циан сефароза. Буду благодарен!

    Идите на сайт амершам GE. И скачайте мануалсы на бром-циан сефарозу, и на Hi-Trap белок G. Затем купите этот самый белок G, пришейте его на бром-циан сефарозу(согласно протоколу) и далее используйте протокол для Hi-Trap, но не надо продавливать шприцами, а просто сделать бэч или колонку и промывать(прокапывать). Так вы и получите чистые антитела из асцита, если конечно они того типа, что связываются с белком G. Вместо белка G можно использовать антиген, или антитела против выших моноклонов.



    Guest /08.09.2008 09:19/
    (Гость @ 03.03.2006 20:41)
    Ссылка на исходное сообщение  Парочка вопросов по белковой химии, имеющих, можно сказать, "жизненно важное" для "дисера" значение:
    Люди! Встречал ли кто-нибудь методику экстракции белков бактериального s-слоя, не разрушающую саму клетку (клеточную стенку, внешнюю мембрану и т.д.)?
    А также методику отделения полисахаридной части гликопротеина от непосредственно белковой?
     
    Всем, кто поможет - заранее большущее спасибо!


    ГАГ (гликозаминогликаны) снимаются с белка кора в ПГ (протеогликанах) с помощью бор гидрида.
    Если надо могу посмотреть методику.



    Apon /23.09.2008 15:04/
    Большая просьба подсказать метод определения общего метилирования ДНК!!!



    Марина Тихонова /25.09.2008 15:36/
    Здравствуйте! Подскажите, пожалуйста, где в интернете можно найти литературу (книги, статьи на русском или английском) по методам изучения клеток. Интересуют общие описания методов. Спасибо.



    Арва /09.10.2008 11:58/
    здравствуйте! может кто-нибудь поделиться новой методикой определения ингибитора трипсина? Заранее спасибо!



    Kosta /20.11.2008 17:37/
    А есть где тема про трансфекцию? Протоколы с трансфекциями простые и изестны, но есть много мелких нюансов, которые хотелось бы обсудить.



    Yuri K /20.11.2008 19:29/
    (Dinok @ 02.05.2008 17:07)
    Ссылка на исходное сообщение  как можно самим приготовить формальдегид?

    Paraformaldehyde can be depolymerized to formaldehyde gas by dry heating and to formaldehyde solution by water in the presence of alkali or heat. The very pure formaldehyde solutions obtained in this way are used as a fixative for microscopy and histology.

    http://en.wikipedia.org/wiki/Paraformaldehyde ( http://en.wikipedia.org/wiki/Paraformaldehyde )



    Yuri K /20.11.2008 19:30/
    (Крыска @ 05.05.2008 10:55)
    Ссылка на исходное сообщение  Теоретически можно окислить метанол чем-нить типа оксида железа...
    Но не проще ли просто купить

    LOL



    Гость /22.11.2008 14:56/
    Уважаемые коллеги!Может кто-нибудь подскажет,в чем может быть причина того, что при высеве на среду с X-gal и IPTG все штаммы получаются бледно-голубыми и отобрать тот, который может нести вставку практически невозможно. Клонирование проводилось в pUC18.Заранее благодарю!



    Гость /25.11.2008 15:58/
    Здравствуйте!Не подскажет мне кто-нибудь как определяют длительность стадий клеточного цикла?И вообще может ли это время быть абсолютным(не зависеть от параметров эксперимента)?



    Гость /27.11.2008 16:52/
    кто нибудь ставил гибридизацию с теломерной ДНК? раскажите условия (Саузерн)



    guest: ммм /27.11.2008 20:05/
    --кто нибудь ставил гибридизацию с теломерной ДНК? раскажите условия (Саузерн)

    Условия стандартные по Маниатису, ничего специального не надо. Если конечно теломер не очень длинный(тогда пульс форез). Ну TRF надо получить( лучше парочкой мелкощепящиих рестриктаз)



    иван псоф /27.11.2008 20:41/
    Влияет ли конденсат на молярность ?

    И стоит ли его "принудительно" стряхивать...
    Что-то сомнения замучили.. confused.gif smile.gif



    Гость /03.12.2008 22:20/
    у кого-нибудь есть методика полярографии для бактерии?



    guest: гость /04.12.2008 12:38/
    >Влияет ли конденсат на молярность ?

    Однозначно. Если есть конденсат всегда сначала чуток крутануть надо.



    Гость /20.12.2008 19:55/
    Добрый день!

    Прошу подсказать где можно найти информацию о методике получения полностью человеческих моноклональных антител на бактериях/лаб.животных.

    Спасибо!

    Илья
    pirogovkatim@mail.ru



    Гость /23.12.2008 21:30/
    как определить раствор гликопротеина



    Privalov /17.01.2009 17:43/
    Здравствуйте!
    Буду бесконечно рада любой информации, касающейся определения активности NK клеток и определения содержания внутриклеточных цитокинов методом проточной цитофлуорометрии.
    Спасибо!



    Гость /22.01.2009 22:04/
    Здравствуйте.
    Помогите, пожалуйста, найти какую-либо информацию на тему "Выделение генов: синтез комплиментарной ДНК, блот-гибридизация".
    Заранее очень благодарна:))



    Anjuta /04.02.2009 10:45/
    Хотела бы спросить тех кто работал с 3 нитропропионовой кислотой (3NP).
    Мне нужно сделать transtympanic injection во внутрь уха мышам, но я не знаю какую концентрацию нужно исползовать, посколько в больших дозах и концентрации 3NP токсичен?

    Заранее спасибо



    Гость /05.02.2009 20:01/
    прикольно тутаааа)))))))))0



    guest: Маська /05.02.2009 20:04/
    а кто-нибудь знает про вирус герпеса человека 6-го типа?если у кого че завалялось,то ПОЖАЛУЙСТА,пришлите это сюда-korolevka-mur@mail.ru/vyt bynthtcyf?d xfcnyjcnb lbfuyjcnbrf/// rolleyes.gif mol.gif



    konst07 /07.02.2009 04:12/
    этот герпес просто шестерка



    RJ Dio /07.02.2009 22:42/
    (Гость @ 22.11.2008 14:56)
    Ссылка на исходное сообщение  Уважаемые коллеги!Может кто-нибудь подскажет,в чем может быть причина того, что при высеве на среду с X-gal  и IPTG все штаммы получаются бледно-голубыми и отобрать тот, который может нести вставку практически невозможно. Клонирование проводилось в pUC18.Заранее благодарю!

    так не бывает, у Вас что-то с реактивами. Все стандартные штаммы типа XL1, DH5 alpha, HB, Sure, JM и прочее вполне годны для бело-голубой селекции. Надо по очереди сменить все реактивы. А может, вы сильно в горячий агар льете X-gal, он у Вас валится? Или исходно того-с? Смените прежде всего его, родимого



    Ethidium /10.02.2009 14:58/
    Привет всем!
    Огромная просьба: подскажите пожалуйста метод оценки пролиферационной активности пула клеток семенников (для ленейных мышей). Заранее спасибо.



    Гость /11.02.2009 09:01/
    Коллеги здравствуйте! Не подскажете методики синтеза коньюгатов антибиотиков (для иммунизации)



    Гость /27.02.2009 12:33/
    Доброго времени суток! Был бы очень благодарен, если бы кто-нибудь поделился методикой приготовления конъюгатов моноклональных антител с фикоэритрином. Заранее спасибо!



    Гость /27.02.2009 14:03/
    Уважаемые коллеги, помогите определиться по следующим вопросам: задача такая - выделение белка из крови( белок низкомолекулярный с мембраной не связанный, индуцибельный т.е. в клетках его мало - репаративный фермент АГТ) из культуры клеток его мы выделяем и протокол имеется - по отработанной методике для детекции на вестерне клеток для выделения белка нужно не менее 10 млн а можно и больше
    вопросы у маня такие
    - сколько примерно мл крови нужно взять что бы выделить этот белок? достаточно ли 10 мл?
    - гепаринизация крови - подскажите или "ткните носом" в протокол сколько гепарина на мл крови
    - и осаждение феколом - тут вообще у меня опыта нет - сколько фекола, какие условия - если подкините методику или ссылкку на таковую буду крайне признательна
    Заранее спасибо за советы , подсказки и Ваши соображения



    Гость /16.03.2009 08:12/
    Гостю, который спрашивал про гепарин.
    Мы добавляли 40 мкл аптечного на 10 мл крови, а вообще есть вакутайнеры с гепарином - с зеленой крышечкой. Фиколл готовится из двух компонентов - собственно фиколла и урографина или верографина, плотность полученного растворчика д.б.1.077. Наливаете в пробирку фиколл (3 мл), а сверху НАСЛАИВАЕТЕ (чтоб не смешалось) 5-6 мл крови (иногда кровь разводят средой, но по мне так это дело вкуса) и на центрифужку - 1500 оборотов, 20 -30 минут (лучше попробовать сначала меньшее время, чтобы все нужное не попадало). Достаете из центрифуги и видите - над столбиком осевших эритроцитов и гранулоцитов желтоватый слой фиколла, потом белое кольцо клеток и слой плазмы. Осторожно собираете белый слой -это и есть клетки. Отмойте их обязательно не меньше 2 раз, поскольку фиколл токсичен. Удачи!!



    Privalov /22.03.2009 22:53/
    Доброго времени суток! Уважаемые коллеги, помогите, пожалуйста решить следующую задачу - растворить нитросиний тетразолий (методика изучения ферментативной активности гранулоцитов). Растворяю в ПБС, на 1 мг НСТ беру 1 мл ПБС. Растворяется плохо, даже если нагреть раствор до 60-70 градусов (по методике). Что же делать? Может быть, истек срок годности вещества?



    guest: ммм /24.03.2009 19:20/
    --Растворяю в ПБС, на 1 мг НСТ беру 1 мл ПБС. Растворяется плохо, даже если нагреть раствор до 60-70 градусов (по методике). Что же делать? Может быть, истек срок годности вещества?

    Попробуйте сначала растворить соль в 70% ДМФА, а потом уже в ПБС



    Гость /01.04.2009 07:36/
    методы получения моноклональных антитель для животных



    Гость /01.04.2009 07:36/
    методы получения моноклональных антител для животных



    Umo4ka /02.04.2009 10:21/
    Уважаемые коллеги, подскажите,пожалуйста,как оптимально снять с поверхности зубной эмали биопленку,чтобы оценить потом белковый состав. ТО есть сняться должно по возможности все, что "село" во рту, и полученный раствор должен быть пригоден для фореза. Проблема в том, что площадь исследуемой поверхности - мах.1кв.см,да еще и общий белок надо бы знать до фореза.Вот ивыходит - с гулькин чих на все-про все. Как бы изловчиться? Ищем лизоцим, лактоферрин, муцин, амилазу иеще много чего.
    Спасибо!



    guest: ммм /02.04.2009 11:13/
    Эк вас занесло. Для начало определитесь что есть биопленка, где кончается пленка и начинается эмаль. А потом можно поразмышлять. А так дайте больному рат пополоскать рот содой питьевой, да в этом растворе потом щеткой зубной зубы почистить да все сплюнуть и анализируйте до посинения.



    Umo4ka /02.04.2009 12:03/
    Определяюсь. Биопленка-это свободный от бактерий слой из белков, гликопротеинов, углеводов и липидов, формирующийся непосредственно на поверхрности эмали в норме ивыполняющий роль смазки, защиты от эрозии, депо ионов и реминерализации. Сверху биопленки формируется бляшка- ну уже зловредная, с бактериями и пр.Но сейчас меня интересуют первые 3 минуты формирования биопленки, поэтому слой будет базальный. Больных, слав Богу нет, зубычистить некому, а кусочек зуба 5х5х1 мм на соответствующем носителе будет помещен зашеку на 3 мин. Вот с этим кусочком мне потом и играться....
    А механически не хочетсяиз-зипотерь. Ну разве что резиновым шпателем, как при сборе клеток. Так там сначала трипсин... Попробовать и мне трипсином что-ли?
    А если сплюнуть, кстати, то анализировать действительно можнодо посинения. Идеякакраз в том,что в разныхртахразное "садится" на зуб,хотя в слюне всепримерно одинаково. Так что "сплюн" меня как раз не интересует! Вернее интересует, но отдельно от пленки. wink.gif



    guest: ммм /02.04.2009 14:11/
    -это свободный от бактерий слой
    Не выполнимое требование.
    --Больных, слав Богу нет, зубычистить некому, а кусочек зуба 5х5х1 мм на соответствующем носителе будет помещен зашеку на 3 мин. Вот с этим кусочком мне потом и играться....

    Гы-гу га.

    Ну покипятите "Зуб" в 1%SDS может это вам поможет.



    Umo4ka /06.04.2009 16:36/
    Спасибо!



    vvv2509 /26.10.2009 13:40/
    Уважаемые коллеги, подскажите как синтезировать siRNA, может кто-то работал в этом направлении или у кого-то есть протоколы. Буду очень признательна!



    Privalov /20.01.2010 00:45/
    Уважаемые коллеги, буду крайне признателен, если кто-нибудь отзовется!!
    Кто-нибудь работал над определением количества клеток, продуцирующих цитокины с помощью проточно
    Вся загвоздка в брефелдине-моненсине, добавляемого для блокировки транспорта цитокинов через мембрану.
    Вопрос - как разводить вещества (куплены в Сигме, сухие, инструкции НЕ прилагаются)???



    Privalov /20.01.2010 00:49/
    Уважаемые коллеги!
    Буду крайне признателен, если отзоветесь!!!
    Кто-нибудь работал с определением клеток, продуцирующих цитокины на проточном цитометре?
    Вся загвоздка в брефелдине-моненсине, блокирующих транспорт цитокинов через мембрану. Есть сухие, куплены в Сигме, инструкции НЕ прилагаются.
    Вопрос - КАК их разводить??? В чем??? Какие стоковые растворы???
    Поделитесь, пожалуйста, информацией!!!
    wall.gif wall.gif wall.gif wall.gif wall.gif wall.gif wall.gif wall.gif



    Apis /20.01.2010 15:45/
    Здравствуйте.
    Кто-нибудь проводил выделение ДНК из пчел и ее микросателлитный анализ?



    guest: ммм /22.01.2010 16:26/
    -Здравствуйте.
    Кто-нибудь проводил выделение ДНК из пчел и ее микросателлитный анализ?

    Думаю кто-нибудь.... Да.

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?d...$=activity ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed&cmd=DetailsSearch&term=Bee+DNA+microsatellite&log$=activity )

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?d...$=activity ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed&cmd=DetailsSearch&term=Bee+AND+%22microsatellite+DNA%22&log$=activity )



    Надежда-27 /27.02.2010 12:26/
    Доброе время суток!
    Уважаемые коллеги, помогите решить такой вопрос: есть старые препаратыкрови, подготовленные для кариотипирования, препраты содержались при комнатной температуре; нужно сделать FISH, но реакция гибридизации не идет. Что нужно/можно сделать, чтобы исправить ситуацию, чтобы реакция пошла?
    Заранее благодарно!

    (если не туда приткнула вопрос - направьте в нужный раздел, пожалуйста.)



    guest: ммм /27.02.2010 20:05/
    Попротеазте чем нибудь ч ЭДТА конечно и тритоном что ли промойте, а после этого ставте гибридизации. Не факт что поможет, но может быть.



    NBSC /27.02.2010 20:39/
    (Privalov @ 19.01.2010 22:49)
    Ссылка на исходное сообщение  Уважаемые коллеги!
    Буду крайне признателен, если отзоветесь!!!
    Кто-нибудь работал с определением клеток, продуцирующих цитокины на проточном цитометре?
    Вся загвоздка в брефелдине-моненсине, блокирующих транспорт цитокинов через мембрану. Есть сухие, куплены в Сигме, инструкции НЕ прилагаются.
    Вопрос - КАК их разводить??? В чем??? Какие стоковые растворы???
    Поделитесь, пожалуйста, информацией!!!
    wall.gif  wall.gif  wall.gif  wall.gif  wall.gif  wall.gif  wall.gif  wall.gif


    смотри сюда -
    http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Produc...RAND_KEY&F=SPEC ( http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=ru&N4=B6542|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC ) - это брефелдин

    http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Produc...RAND_KEY&F=SPEC ( http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=ru&N4=M5273|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC ) - это моненсин

    в обоих случаях слева есть ссылка на specification sheet. Смотрим туда и видим все, что нужно.
    Еще в чем проблема? Посчитать, сколько и чего разводить, надеюсь, сами сумеете?



    Надежда-27 /28.02.2010 10:51/
    Уважаемый guest: ммм IP-штамп: frCNCa5alkkCM, большое спасибо за Ваш ответ!

    "Попротеазьте чем-нибудь ч ЭДТА конечно и тритоном что ли промойте" -
    Я не биолог, поэтому нечасто приходилось заниматься такими анализами (со старыми препаратами). Если Вас не затруднит, ответьте поподробнее: какой раствор надо использовать и сколько времени надо держать препараты в нем? Можно на мейл pln-33@mail.ru
    Заранее благодарна!



    studenttka /28.02.2010 12:48/
    Здравствуйте всем! Напишите, пожалуйста, кто обсчитывал блоты и форезы (белковые) с целью количественного определения и распределения белка в дорожке и в полосе. Я пытаюсь это сделать с помощью LabImage 1D Kapelan, но в доступной демо версии нельзя (или я не могу?) проанализировать свои гели и блоты, так как их нельзя загрузить...Не знаю, что делать. Помогите, пожалуйста!!!!



    guest: ммм /28.02.2010 14:33/
    -Я не биолог, поэтому нечасто приходилось заниматься такими анализами (со старыми препаратами). Если Вас не затруднит, ответьте поподробнее: какой раствор надо использовать и сколько времени надо держать препараты в нем? Можно на мейл pln-33@mail.ru

    Это бессмыслено. Универсального решения и подхода не существует.

    Могу только перечислить наиболее часто используемые ферменты.
    Трипсин, Протеиназа К, Проназа, Пепсин.

    По поводу оптимальных условий работы ферментов обратитесь к соответствующим справочным данным.

    По поводу времени обработки и концентрации фермента обсуждать это бессмысленно их надо просто подбирать.

    К тому же, как я написал выше, в результате может просто ничего не получиться.



    Liudmila /16.06.2010 00:17/
    как приготовить окрашенный протеиновый маркер?



    Liudmila /16.06.2010 00:19/
    (Liudmila @ 16.06.2010 00:17)
    Ссылка на исходное сообщение  как приготовить окрашенный протеиновый маркер?


    Дорогие коллеги,

    Может ли кто-нибудь подсказать, как приготовить домашний окрашенный заранее протеиновый маркер? лаборатории

    Спасибо!
    Людмила.



    A Chemist /17.06.2010 22:38/
    Может ли кто-нибудь подсказать, как приготовить домашний окрашенный заранее протеиновый маркер? лаборатории

    заранее окрашенный?
    или
    заранее протеиновый?
    у Вас есть протеиновый маркер? смесь белков? и Вы хотите сделать его (ее) окрашенным? сами? какого цвета? купите NHS нужного красителя....
    альтернатива: сделайте соль диазония из аминобензойной кислоты или купите Fast Black...
    и промодифицируйте смесь, предварительно ее подщелочив.
    напоследок обессоливание, т.е., удаление низкомолекулярных в-в



    guest: ммм /18.06.2010 10:03/
    --у Вас есть протеиновый маркер? смесь белков? и Вы хотите сделать его (ее) окрашенным? сами? какого цвета?

    Обычно раньше такие вещи делали порционовыми активными красителями с дихлортриазиновой группой. Только нужно помнить, что при покраске мол вес исходного белка может увеличится на несколько килодальтон в зависимости от мол веса красителя и числа связавшихся молекул красителя с белком.

    --промодифицируйте смесь, предварительно ее подщелочив.
    напоследок обессоливание, т.е., удаление низкомолекулярных в-в

    Угу, протокол примерно такой и есть. Также следует позаботится о том что бы в щелочном буфере для модификации отсутствовали вещества с первичными и вторичными аминогруппами(например трис)



    Liudmila /18.06.2010 21:48/
    Спасибо за ответы! А вы могли бы сказать, как называется этот метод, чтобы было легче найти протокол в интернете?



    guest: ммм /18.06.2010 23:36/
    -- А вы могли бы сказать, как называется этот метод, чтобы было легче найти протокол в интернете?

    Как называется метод меченья антител FITC?

    Как называется метод коньюгации антител с пероксидазой?

    Как называется метод биотинилирования белка?

    Никак не называется ....

    ищете что-то на окраску белков активными красителями(проционами, цибкарбонами)



    АннБелла /30.06.2010 14:24/
    Господа, кто-нибудь имел реально САМ дело со смешанными гелями? Имеются в виду ПААГ-агарозные, где агароза добавляется для придания ПААГ малой процентности мехмнической прочности (по Остерману). Имеется ряд проблем, хотелось бы послушать соратноиков shuffle.gif shuffle.gif



    guest: ммм /30.06.2010 16:23/
    Могу дать адрес вконтакте человека, котрый в юности этим баловался.

    Помню, что, стекла(блок) пред заливкой предварительно грели в термостате. ПСА и ТЕМЕД вроде клали во много раз меньше.

    Но я вам рекомендую воспользоваться волшебным полисахаридом, который есть у genseq'a. Его можно добавить в агарозный гель и у него удивительным образом повышается разрешение особенно для малых фрагментов.



    АннБелла /01.07.2010 14:22/
    Я из тех "могикан", которые НЕ в контакте. Если можно, какие-то иные контакты человека, игравшего в игрушки в детстве?... smile.gif
    В принципе, фрагменты не такие малые, чтобы их не видеть. Видится всё, что надо. И делится хорошо. Проблемы иного плана, чисто "механические". Ну, и немного, наверное, по режиму самого фореза.



    RJ Dio /02.07.2010 14:08/
    (guest: ммм @ 30.06.2010 17:23)
    Ссылка на исходное сообщение  Могу дать адрес вконтакте человека, котрый в юности этим баловался.

    Помню, что, стекла(блок) пред заливкой предварительно грели в термостате. ПСА и ТЕМЕД вроде клали во много раз меньше.

    Но я вам рекомендую воспользоваться волшебным полисахаридом, который есть у genseq'a. Его можно добавить в агарозный гель и у него удивительным образом повышается разрешение особенно для малых фрагментов.

    волшебный полисахарид имеется не только у генсека, но и в свободной продаже за бугром, 100 гринов за 100 г



    genseq /04.07.2010 13:32/
    (RJ Dio @ 02.07.2010 12:08)
    Ссылка на исходное сообщение  волшебный полисахарид имеется не только у генсека, но и в свободной продаже за бугром, 100 гринов за 100 г


    Называется это чудо "SYNERGEL". Способ получения запатентован 20 лет назад. Сейчас продаётся и перепродаётся многими фирмами. Сначала хотел сделать аналог, но просто копировать стало скучно. В результате на сегодняшний день имеется 3 сорта ПГМ, из которых можно получать гели самого различного разрешения. ПААГ отдыхает!



    Файл/ы:

    Скачать файл Synergel_20Flyer.pdf
    Размер:: 386.07к
    кол-во скачиваний: 2926



    Скачать файл ГОТОВЫЕ_ГЕЛИ_05.pdf
    Размер:: 19.19к
    кол-во скачиваний: 1199




    АннБелла /05.07.2010 11:12/
    И я одинаково чётко буду видеть полосы от 2280 до 863? И 2 280 хорошо разойдётся с 2 274 при этом? И как соотносить его процентность с процентностью ПААГ? Или всё по вложенной инструкции к нему? smile.gif В 2.6 % ПААГ я всё очень чётко и хорошо вижу smile.gif Но гель 20*20 и толщина 0,75 - краситься очень весело.



    АннБелла /05.07.2010 11:25/
    И как эта чудо добавка ведёт себя в геле в присутствии мочевины, интересненько....



    genseq /05.07.2010 12:42/
    (АннБелла @ 05.07.2010 09:12)
    Ссылка на исходное сообщение  И я одинаково чётко буду видеть полосы от 2280 до 863?  И 2 280 хорошо разойдётся с 2 274 при этом? И как соотносить его процентность с процентностью ПААГ? Или всё по вложенной инструкции к нему? smile.gif В 2.6 % ПААГ я всё очень чётко и хорошо вижу smile.gif Но гель 20*20 и толщина 0,75 - краситься очень весело.


    Чёткость нормальная, но насчёт разделения 2280 и 2274 не уверен. Нужно пробовать с большим пробегом, а мы гоняем исключительно на коротких дистанциях, в толстых гелях (4мм) и в горизонтальных камерах. На вертикальных тонких гелях картинки должны получаться чётче.

    Что касается разрешения, то для Ваших целей может подойти ПА-2 (0,8% агарозы + 0,6% ПГМ-1). На картинке показан форез маркёров М50, М100 и М200 на геле ПА-4 (ПА-2 + 1% ПГМ-2) , имеющем не самое высокое разрешение. Левая дорожка - лямбда (рестрикты HindIII). Для сравнения рядом разделение тех же рестриктов на 0,7% агарозе (видна парочка 2027 с 2322 и 564, а все крупные фрагменты на малом пробеге не делятся).

    Мочевину не пробовали, но на агарозных гелях с мочевиной люди работают, а на полигалактоманнан она влиять не должна.

    Если нужна инструкция по добавлению ПГМ, то напишу, но мне проще сварить гель самому. Можем поставлять гели не в готовом к употребления виде (с лунками), а в полипропиленовых стаканах. Остаётся разогреть в микроволновке и залить прибор.



    Картинки:
    Прикреплённое изображение

    АннБелла /05.07.2010 13:49/
    Ну вот картинка в обычной 2% агарозе без ничего.
    user posted image ( http://www.radikal.ru )
    Хорошо видны нижние фрагменты 982 и 863. Неплохо в серединке разделились 1410, 1497 и 1701. А вот 2280, 2274 и 2151 идут, естественно в таком проценте одной полосой. В просто АА (процент от 2,6 до 3,0) разгоняется великолепно и чётко абсолютно всё. Но красить эти гели.......
    На вашей картинке я вижу, что фрагменты меньше 2000 я буду видеть очень плохо, или же придётся перегружать лунки, тогда большие фрагменты будут сливаться. И разница у близкоидущих полос слишком велика, 2280 и 2 274 не разделяться точно...
    В 0,7-0,8% агарозе тоже делали, мелкие не видны вовсе.
    Про длину пробега тоже мысль была. Одна из первых smile.gif Гоняли в большой горизонтальной камере - ничего подобного! Не разбегаются, так и идут табуном по всей длине.



    genseq /05.07.2010 14:12/
    Нечёткость верхних полос у М100 и М200 проявляется из-за того, что гели сфотографированы с близкого расстояния и краевые полоски смотрятся под углом. У тонких гелей это не проявляется. Что касается разрешения гелей, то оно подбирается на любой вкус. Для каждого диапазона длин фрагментов оптимум свой.

    По поводу Вашего геля. Это очень плохо сфотографировано, или мочевина с агарозой дают такую мазню?



    АннБелла /05.07.2010 14:22/
    Ни то и ни другое. Это зверский УФ, который сжирает картинку в считаные минуты.



    АннБелла /05.07.2010 14:26/
    Ну вот что бы вы посоветовали для чёткого разделения следующих фрагментов: 2280, 2274, 2151, 1701, 1497, 1410, 982 и 863. При том условии, что само по себе чёткое разделение этих фрагментов не самоценно, а необходимо выявлять разницу между аналогичными полосами в разных пробах. Разница будет минимальной - от 1пары оснований. Да, забыла сказать, речь идёт об РНК smile.gif



    genseq /05.07.2010 18:38/
    Советовать нужно исходя из собственного опыта, а я с РНК не работал. Если исходить из теоретических предпосылок, то разницу в 1 нуклеотид на пробеге в 20 см Вы на этом спектре фрагментов не увидите. Отличие в 6N (2280-2274) увидеть вполне реально, но придётся экспериментировать с несколькими вариантами гелей. Не уверен, что сочетание агарозы с ПГМ и мочевиной нормально перенесёт окрашивание. Если есть желание поэкспериментировать, то ПГМ обеспечу. Но в Вашем случае, наверное, лучше не экспериментировать, а тупо следовать протоколу с гелем агароза-ПААГ. Опыт приготовления таких гелей имеется, но для наших горизонтальных гелей использовать ПГМ намного проще.

    Прежде всего, Вы должны иметь термостат на 40...45 градусов, поскольку все растворы должны быть тёпленькими. В расплав 1% агарозного геля вливаете требуемый объём концентрата акриламид/метиленбисакриламид (29:1). Персульфат и ТЕМЕД можно добавить перед самым смешиванием в агарозу, а ещё лучше персульфат в агарозу, а ТЕМЕД в акриламид (или наоборот). Добавлять их нужно в 4...5 раз меньше нормы. Главное - очень быстро и очень тщательно перемешать и тут же залить в прибор, который перед заливкой также лучше держать в термостате. Если заполимеризуется слишком быстро, то возьмите ещё меньше персульфата и ТЕМЕДа.

    Главное в этом деле - навык, а для его приобретения несколько гелей придётся испортить.



    АннБелла /06.07.2010 13:01/
    Да гель приготовить - нет проблем. И термостат, и смешивание в тёплом виде, и диаэрация, и концентрация ТЭМЕД и ПСА, и граница застывания видна очень наглядно - всё это известно, всё делается. И сам гель замечательный получается, очень удобный в работе. И вариантов и сочетаний перепробовано тысяча и одна smile.gif
    В просто ПААГ, без агарозы отличие в 6N видно великолепно. Можно увидеть и меньше, исходя из того расстояния, которое видимо между фрагментами, отличающимися в эти 6N. А вот в смешанном геле полосы размываются, видны не очень чётко. Работаю по Остерману, а у него методика дана довольно размыто. Например, он рекомендует после застывания основного геля и срезания границы заливать сверху агарозу 0.3%, в которой формируются карманы. Ну не липнет она к основному гелю! С гребёнкой кусками выходит. Делала и 0.5% (как в основном геле) и 0,4% - вроде всё нормально, формируются карманы, пробы вносятся хорошо. Но после прокрашивания становится очевидно, что при прохождении границы гелей размывается оно на все ближайшие лунки. Делала верхний гель из ПААГ - та же история. Делала гели без мочевины - полосы очень нечёткие, хотя РНК растворена в формамиде и в геле присутствует ещё и SDS. Варьировала вольтаж и температуру - никакого эффекта. Обычно камера с гонющимся форезом у меня живёт в холодильнике. Пробовала без охлаждения - ещё больше размывает.
    В принципе, можно работать на ПААГ без агарозы - там нет вопросов, всё очень хорошо и замечательно. Кроме момента прокрашивания. Надо быть просто хирургом высшей квалификации, чтобы красить в серебре гель 20*20, 0.75мм и 2,6% ПААГ frown.gif((



    guest: ммм /06.07.2010 13:31/
    --он рекомендует после застывания основного геля и срезания границы заливать сверху агарозу 0.3%, в которой формируются карманы. Ну не липнет она к основному гелю! С гребёнкой кусками выходит. Делала и 0.5% (как в основном геле) и 0,4% - вроде всё нормально, формируются карманы, пробы вносятся хорошо.

    Почему вы не заливаете гель и сразу гребенку в него,зачем такие сложности.

    --В принципе, можно работать на ПААГ без агарозы - там нет вопросов, всё очень хорошо и замечательно. Кроме момента прокрашивания. Надо быть просто хирургом высшей квалификации, чтобы красить в серебре гель 20*20, 0.75мм и 2,6% ПААГ ((

    Могу лишь посоветовать сделать много-много биса. Например 2% АА и 1% Биса



    genseq /06.07.2010 13:43/
    Тогда всё проще. Нужно работать на чистом ПААГ, но как-то решить проблему его окрашивания. Это не так уж и сложно. На стекло наносите винилтриэтоксисилан. Можно раствор в ацетоне, а можно и без растворителя. Достаточно смочить сторону, прилегающую к гелю. Он пришивается к стеклу и активирует поверхность винильными группами. Промываете водой, сушите и всё. К этой поверхности тонкий гель в процессе полимеризации пришивается, причём ковалентно. Держится намертво. Гель будете красить прямо на стекле. Потом немного помучаетесь, сдирая гель со стекла, но это можно и стерпеть.

    Если винилтриэтоксисилан отсутствует, подойдёт и более распространённый АПТЭС (аминопропилтриэтоксисилан), но его нужно будет обработать ещё глицидилметакрилатом. Остаётся только добыть требуемые реактивы. Если Вы за бугром, то ничем не могу помочь. Если в Москве, то могу подсказать, где их можно купить. Если в Пущино, то заходите. Налью beer.gif .

    Успехов!



    guest: ммм /06.07.2010 14:07/
    -Потом немного помучаетесь, сдирая гель со стекла, но это можно и стерпеть.

    Стекол не напасешси.

    Уж лучше модифицировать ПЭТ пленку, или подложку из полистирола.

    Тогда проблема отдирания отпадет сама собой.



    АннБелла /07.07.2010 16:02/
    Почему вы не заливаете гель и сразу гребенку в него,зачем такие сложности.

    А вы попробуйте хоть раз! smile.gif))))
    Поскольку агарозе в смешанном геле положено застывать раньше, чем ПААГ (отсюда и хитрости с подбором концентрации ТЭМЕД и ПСА), то и правильность приготовления такого геля подтверждается образованием характерной границы при застывании. Она напоминает шхеры и фьорды на карте Норвегии smile.gif И если опустить гребёнку сразу (что, кстати, и делалось ради прикола), то весь этот сюр образуется вокруг зубцов. Старик Остерман про это предупреждает. До того, чтобы посмотреть, какие при этом будут полосы, мои приколы не не дошли smile.gif
    Гели на стекле я красила. Это первое, что приходит в голову. Честно говоря, не очень понравилась степень прокрашивания. Но попробовать один раз "пришить его
    ковалентно" и возможно, подувеличить насыщенность растворов серебра и проявителя попробовать можно. И хочется посмотреть, потеряю я стекло после этого, или нет. Есть у меня парочка покоцаных, могу пожертвовать ради науки smile.gif


    Если в Москве, то могу подсказать, где их можно купить. Если в Пущино, то заходите. Налью .
    Я в Питере smile.gif
    В Пущино бывать доводилось, месяцок там жила smile.gif


    В любом случае, спасибо всем за живейшее участие!



    Liudmila /05.08.2010 18:05/
    Дорогие коллеги,
    Кто-нибудь определял уровень фосфорилирования белков вестерн-блоттингом? У меня методика упорно не работает: уровень фосфорилирования оказывается многократно ниже, чем должно быть. Обращаюсь с белками как для обычного вестерн-блота. Куда могут деться фосфатные группы?
    Спасибо за любые предположения!



    Tom1 /05.08.2010 18:28/
    (Liudmila @ 05.08.2010 08:05)
    Ссылка на исходное сообщение  Дорогие коллеги,
    Кто-нибудь определял уровень фосфорилирования белков вестерн-блоттингом? У меня методика упорно не работает: уровень фосфорилирования оказывается многократно ниже, чем должно быть. Обращаюсь с белками как для обычного вестерн-блота. Куда могут деться фосфатные группы?
    Спасибо за любые предположения!

    1. Что вы имеите ввиду говоря об уровне фосфорелирования???? Типа количественный анализ с помощью щестерна??????
    2. Чем красите??? просто антителами на белок????? или специфическими к фосфопептидам или же на фосфо-аминокилоты??????
    3. В когда получаите образцы ( до варки) в буфере присуствуют ингибиторы фосфотаз и какие???????



    Liudmila /05.08.2010 19:16/
    Tom1, спасибо за внимание!
    1.Оцениваю увеличение фосфорилирования качественно, на глазок.
    2.Использую антитела к фосфопептидам.
    3. Да, присутствуют: использую апротинин, леупептин, ортованадат и PMSF. Несколько лет назад эта методика работала в этой же научной группе, а теперь в моих руках - не получается.
    Обнаружила в интернете, что в случае антител против фосфопептидов надо использовать БСА вместо молока на всех этапах обработки блота, а я использовала молоко в случае вторичного антитела. Неужели это имеет значение?!



    guest: ммм /05.08.2010 19:47/
    --Да, присутствуют: использую апротинин, леупептин, ортованадат и PMSF. Несколько лет назад эта методика работала в этой же научной группе, а теперь в моих руках - не получается

    Гуга! Здесь ингибитор фосфатаз ванадат, разве что.

    Мой вам совет добавить в форез и во все буфера: сэмпл, для переноса, инкубации и тд. ЭДТА до 1мМ. Очень помогает от фосфатаз дешево и сердито.

    -а я использовала молоко в случае вторичного антитела. Неужели это имеет значение?!

    А вы сами то подумайте основной белок молока это что? - КАЗЕИН. А казеин один из самых фосфорилированных белков. Желатин еще можно вместо BSA.



    Tom1 /05.08.2010 19:48/
    (Liudmila @ 05.08.2010 09:16)
    Ссылка на исходное сообщение  Том1, спасибо за внимание!
    1.Оцениваю увеличение фосфорилирования качественно, на глазок.
    2.Использую антитела к фосфопептидам.
    3. Да, присутствуют: использую апротинин, леупептин, ортованадат и ПМСФ. Несколько лет назад эта методика работала в этой же научной группе, а теперь в моих руках - не получается.
    Обнаружила в интернете, что в случае антител против фосфопептидов надо использовать БСА вместо молока на всех этапах обработки блота, а я использовала молоко в случае вторичного антитела. Неужели это имеет значение?!

    1. я бы насыпал кроме вандата исчо и флорит натрия и ортофосфат натрия.
    2. НИКАКОГО МОЛОКА!!!!!! ТОЛьКО БСА!!!!! в молоке полным полно фосфобелков и большауя веротность что ваши антела туда и уходят.
    3. что бы я обязательно сдлел бы поставил контроль на фосфорелирование ваших белков схема такая : ИП ваших белков делите на три части и одну не обрабатываите фосфотазой, вторая треть + фосфотаза и третья +фосфотаза+ ингибиторы и смотрите все вестерном.....



    Liudmila /05.08.2010 20:26/
    Спасибо, ммм, спасибо, Tom1!
    Учту ваши советы!








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler