Главная страница MolBiol.ru > Методы > Бактерии > Хранение бактериальных штаммов Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Хранение бактериальных штаммов

Долговременное хранение оправдано для (i) коллекционных культур и для (ii) штаммов-продуцентов. Для последних, кроме коллекционных пробирок имеет смысл готовить серьёзные аликвоты для выращивания (часто эти штаммы нестабильны и приготовить сток аликвот значительно проще, чем каждый раз контролировать эффективность экспрессии).

    На -70oС (неограниченное время)

    Приготовление стока

  1. вырастить ночную культуру (можно с антибиотиком);
  2. 5-15% глицерин:
  3. перенести 850µl культуры в пробирку с 75-150µl глицерина;

    7% DMSO:

    перенести 930µl культуры в пробирку с 70µl DMSO;

  4. смешать, заморозить в жидком азоте;
  5. хранить на -70oС неограниченное время.
  6. Высев клеток штрихом

    Высев клеток из -70oС стока

    NB!!!Во время высева пробирка с клетками должна постоянно находиться в жидком азоте.

  7. раскалить петлю на пламени горелки;
  8. воткнуть в культуру, дать ей вмёрзнуть;
  9. выдернуть петлю из пробирки вместе с несколькими микролитрами намёрзшей культуры;
  10. перенести на чашку, размазать в небольшое пятнышко;
  11. простерилизовать петлю, сделать серию параллельных штрихов;
  12. сделать ещё несколько серий параллельных штрихов (см. Рис.), стерилизуя петлю между сериями.
  13. В анаэробных условиях в столбиках (до года)

    Приготовление стока

  14. разлить по ~1.2ml агара (без антибиотиков) в 2ml пробирки с завинчивающимися крышками;
  15. снять петлёй бактериальную колонию (или обмакнуть петлю в ночную культуру);
  16. 2-3 раза воткнуть петлю в столбик;
  17. плотно завинтить крышку, хранить в темноте при NT.
  18. Высев клеток из столбика

  19. воткнуть стерильную петлю непосредственно в культуру столбика;
  20. перенести на чашку, размазать в небольшое пятнышко;
  21. простерилизовать петлю, сделать серию параллельных штрихов;
  22. сделать ещё несколько серий параллельных штрихов (см. Рис.), стерилизуя петлю между сериями.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 21386

    Комментарии

    Общие

  • Новый "фирменный" штамм используется (без размораживания) только для создания -70oС стока: высеять штрихом, поставить 5 ночных культур (3 - из различных индивидуальных колоний, 2 - из массы колоний), далее начиная с "п.2.".
  • Хранение в столбиках имеет смысл использовать только для транспортировки клеток при комнатной температуре.
  • Весьма распространенно беспокойство по поводу качества DMSO, длительное время хранившегося при NT. Мы убеждены, что, если речь идет о хранении замороженных бактериальных клеток, то беспокоится не о чем.


  • По пунктам

    п. 2.

  • Глицерин и DMSO предотвращают образование больших кристаллов воды, которые разрушают бактериальные клетки.
  • Нам больше нравится метод, использующий DMSO, т.к.
  • (i) его (DMSO) нет нужды стерилизовать,
    (ii) глицерин вязкий, фасовать приходится на весах.

  • Очень хорошая альтернатива в случае большого количества пробирок - добавлять к 500µl культуры 500µl среды с 30% глицерином.
  • Можно разаликвотить глицерин (или DMSO) заранее и хранить при NT (+4oС), соответственно.
  • п. 5.

  • Нам больше нравится, когда петля платиновая.
  • Мы стерилизуем петлю следующим образом:
    1. стерилизация:

    2. раскалить петлю до красна на пламени горелки;
    3. охлаждение:

    4. погрузить проволочку (но не её держатель) в спирт;
    5. быстро провести над горелкой (что бы спирт загорелся);
    6. охладить на воздухе ~2'. Если охлаждалось меньшее время, можно перед тем, как забрать колонию прижать петлю на 3-5'' к свободному от бактерий участку агара на чашке (смысл процедуры в том, что на воздухе раскаленная до красна петля остывает довольно долго. В спирте - быстрее. Конечно, при сгорании спирта она нагревается вновь, но уже не так сильно).

    пп. 9, 10

  • Удобнее стерилизовать две петли, и работать одной, пока вторая остывает после стерилизации.
  • Штриховка - чтобы разбавить плотную смесь до отдельных клеток.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    AnKri /11.11.2005 13:11/
    Как правильно заморозить на -80С споры бактерий и грибов, если до этого они находились в физрастворе в обычной морозилке?



    Lil /27.06.2006 20:02/
    Простите за дурацкий вопрос: как глицерин стерилизуют?



    Viktoria1510 /27.06.2006 20:16/
    50-80% глицирин стерилизуют автоклавированием



    Гость /06.07.2006 21:12/
    Может кто-нибуть просветит, что происходит с клетками при -196 и как их потом лудше вывести из такого состояния? Или поделится инф о какой-нибуть новой хорошей литературкой по этой теме...



    Atropos /04.03.2007 19:24/
    Вопрос про замораживание штаммов с плазмидами:

    (Novagen's pET manual)
    Note that high glycerol concentrations (> 10%) may lead to plasmid instability.

    А почему так происходит? confused.gif
    У нас в лаборатории их вообще при 20% до сих пор хранили...



    Guest /05.03.2007 12:28/
    А в какой это инструкции? Что-то раньше вроде не замечал этого пункта.



    Atropos /05.03.2007 13:12/
    (Guest @ 05.03.2007 12:28)
    Ссылка на исходное сообщение  А в какой это инструкции? Что-то раньше вроде не замечал этого пункта.


    C. Storage of Strains
    Permanent stocks of hosts and pET recombinants are best kept as glycerol stocks. Note that
    high glycerol concentrations (> 10%) may lead to plasmid instability.




    Гость /09.01.2008 13:23/
    Дорогие коллеги.
    Можно ли высевать клетки из музея (с - 70)сразу на ночную культуру, минуя стадию рассева на чашку? Чем это хуже? Клетки - E. coli, несут плазмиду с аб-устойчивостью. Спасибочки.



    Гость /11.02.2009 02:32/
    Какая-то туфта. Столбики какие-то. Нестабильность. А если азота нет, повеситься, что ли? Вы что там, тысячелетиями собираетесь свои клоны хранить, для благодарных потомков? Какой-то вчерашний андеград чето-то там напортачил в Новамеде, а тут уши развешивать. Глицерин просто разведите до 50% сразу, тогда легко его раскапывать. Храните замороженым. Ваще у всех свои методы, я, например, ресуспендирую в свежой среде с глицерином 20% и замораживаю на -70. Если нет -70 то и -20 сойдет на несколько лет точно. Да, можно без всякой чашки, сразу в бульон высевать.








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler