Главная страница MolBiol.ru > Методы > Бактерии > Химически компетентные клетки Rambler's Top100
СтормовЪ - лаборатория для профессионалов спонсор проекта: компания "СтормовЪ"
ГЛАВНАЯ · БИОХИМИЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · ТУРИЗМ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · ZBIO
Синтол · Millipore · Диаэм · Axygen · ДНК-синтез · БиоЛайн · Beckman Coulter · Хеликон · Химмед · Биосан · Merck KGaA · Waters · Elite-Genetix      

Трансформация бактерий

Приготовление компетентных клеток
Контрольная трансформация
Реальная трансформация
Растворы
TB
SOC, SOB
bMeEtOH
2M Mg-solution
Комментарии
Общие
По пунктам
 Дополнить
Химически компетентные клетки можно трансформировать неочищенной лигазной смесью (и вообще DNA, находящейся в умеренно солевом буфере).

Количество клеток в химически-компетентной фасовке значительно меньше чем в электрокомпетентной, поэтому можно высевать всю фасовку на одну чашку.

    Приготовление компетентных клеток

  1. со стока (-70oС) рассеять бактерии штрихом на чашку с селективной средой;
  2. выращивать 37oС, ON;
  3. несколько колоний (10-12) диаметром ~2-3mm поместить в 40ml SOB в колбе 0.5-1.0L.
  4. интенсивно встряхивать (200-300rpm)

    5. * либо при 37oС - компетентность среднего уровня, но время роста небольшое,
    * либо при 18oС (переставить качалку в холодную комнату) - компетентность выше, но время роста - несколько суток;

  5. растить OD600= 0.6

    6. все дальнейшие манипуляции проводить на холоду.

  6. в 50ml цф-пробирку поместить 30ml культуры;
  7. 0oC, 10-15';
  8. ЦФ 2-3krpm 4oC, 10', слить супернатант;
  9. ЦФ 2-3krpm 4oC, 20'', тщательно удалить остатки жидкости;
  10. суспензировать в 10ml TB;
  11. 0oС, 10-15';
  12. повторить п.7, 8;
  13. ресуспензировать в 2ml TB;
  14. + DMSO до 3.5% (70µl);
  15. 0oС, 10-15';
  16. повторить п.14,15;
  17. разаликвотить по 100µl в охлажденные 2ml пробирки с завинчивающимися крышками;
  18. заморозить в жидком азоте;
  19. хранить в жидком азоте (лучше) или на -70oС.

    20. Контрольная трансформация
  20. приготовить из 100х стока (0.5µg/ml) свежий раствор pDNA 5ng/ml;
  21. оттаять во льду 0.5M bMeEtOH и аликвоту клеток;
  22. к аликвоте компетентных клеток добавить:

    23. 4µl 0.5M bMeEtOH,
    2µl (10pg) pDNA;

  23. 0oC, 20-60';
  24. 42oC, 30'', без встряхивания;
  25. сразу в лед, 2';
  26. + 400µl SOC;
  27. плотно завинтить крышку, встряхивать горизонтально на бактериальном шейкере 37oС, 30';
  28. высеять 50µl на чашку с антибиотиком;
  29. если выросло "N" колоний, то компетентность = Nх106[колоний/µg].

    30. Реальная трансформация

    1. аналогично "контрольной";
    2. на одну аликвоту можно брать pDNA в объёме <10µl;
    3. высев - в зависимости от задачи:

      4. * если требуется получить несколько индивидуальных колоний (например, при создании генно-инженерной конструкции), то высеять 100-200µl (обязательно неравномерно - растереть шпателем по одной половине чашки, и только когда жидкость подсохнет, сделать один (!) мазок по второй половине),
      * если требуется получить как можно больше колоний при разумной плотности (например, при создании библиотеки), то высеять 10-50µl для определения титра (равномерно), оставшиеся клетки хранить ON при 0oС (титр при этом не изменяется). На следующий день рассчитать количество клеток на высев, высеять.



MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 13416

    Растворы

    TB

    (хранить при 4oС)

    Конц.Сток0.5L1L
    PIPES10mM302.37g/M1.51g3.02g
    MnCl2x2H2O55mM161.9 g/M4.45g8.90g
    MnCl2x4H2O 197.91g/M 5.44g 10.89g
    CaCl2x2H2O15mM147.02 g/M1.10g2.21g
    KCl250mM74.55 g/M9.32g18.64g
    H2O mQ   
  • смешать все компоненты, кроме MnCl2, довести KOH pH до 6.7(~650 µl 1N на 0.5L TB). Добавить MnCl2, стерилизовать фильтрацией через 0.45µm фильтр.
  • Если вместо PIPES использовать HEPES,то:
    • HEPES10mM238.3g/M1.19g2.38g

    SOC, SOB

    (хранить при NT).

    Сток200ml400ml
    Bactotryptoneтв.4.0g8.0g
    Bacto Yest extr.тв.1.1g2.2g
    NaCl5M0.4ml0.8ml
    KCl1M2.0ml4ml
    H2OmQ~196ml~391ml
    1. автоклавировать, охладить до <60oС;
    2. добавить:

      3. 0.01V 2M Mg2+{= 1M MgCl2+1M MgSO4}   
      0.01V 2M glucose;   

    3. фильтровать через 0.2µm фильтр;
    4. аликвотить, хранить при -20oC, (-70oC).

    SOB получается, если не добавлять глюкозу.

    ß-меркаптоэтанол

    0.5M (хранить при +4oС).

    Конц.Сток1ml
    ßMeEtOH0.5M14.3M35µl
    H2O mQ965µl

    2M Mg-solution

    (стерилизовать автоклавированием, хранить при NT), p=1.173:

    Конц.Сток100ml
    MgCl2x6H2O1M203.3g/M20.33g
    MgSO4x7H2O1M246.47g/M24.65g
    H2O mQ72.3ml

Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


-- как прислать био-картинку --

    Комментарии

    Общие

  • Источник: H.Inoue, H.Nojima, H.Okayama "High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids", Gene, 96(1990), 23-8.
  • В данной методике доля компетентных клеток ~10%.
  • Частота трансформации постоянна до ~10ng pDNA/100µl клеток, далее весьма быстро падает.
  • Насыщение в районе 100-200ng/100µl клеток.
  • >25ng/100µl клеток - с заметной частотой появляются двойные трансформанты.
  • В случае большого количества простых трансформаций (например, клонирование плазмид) работу можно значительно ускорить, если (i) брать для трансформации маленький объём клеток (~20µl), (ii) высевать штрихом сразу после теплового шока (без "оживления").
  • Мы читали и слышали совершенно разные мнения о требованиях, предъявляемых к качеству DMSO. Поэтому на всякий случай пользуемся "Sigma, #D2650", расфасованным под аргоном (аликвоты в ампулах по 5 или 10ml). Фасуем его один раз и храним фасовки при -70oС.
  • Основные преимущества химически компетентных клеток перед электрокомпетентными:
    1. Химически компетентные клетки можно трансформировать неочищенной лигазной смесью (и вообще DNA, находящейся в умеренно солевом буфере). В случае электрокомпетентных - DNA должна быть очищена, т.к.: (i) слишком высокая концентрация соли способна вызвать искровой разряд в ячейке (ii) при электротрансформации в оболочке E. coli появляются дырки, в них может проникнуть фермент, используемый для лигирования.
    2. Количество клеток в электрокомпетентной фасовке значительно больше, чем в химически-компетентных, поэтому не стоит пытаться высевать на одну чашку слишком большую долю фасовки. Это чревато подростом (появлением сателлитных колоний) и снижением компетентности.

    По пунктам

    п.4, 5.

  • Рост при 37oС приводит к резкой (с острым максимумом) зависимости компетентности от плотности клеток (A600=0.45 для DH10B). При 18oС высокая компетентность достигается в широком интервале A600=0.35-0.70.
  • Связь концентрации клеток с оптической плотностью: OD550=c[cells/ml]*108/k.
    • Штаммkдиапазон OD550
    JM1091.10.36-0.64
    SURE1.60.25-0.44
    XL-1Blue2.00.20-0.35
    XL-1BlueMRF'1.90.21-0.37

    п.10.

  • PIPES в составе TB можно заменить на HEPES или BES. Это приведёт лишь к небольшому уменьшению компетентности. Эффективность трансформации практически постоянна в диапазоне pH 5.6-7.0, однако при pH>7.0 MnCl2выпадает в осадок.

    • п.14.

  • DMSO токсичен для бактерий в высокой концентрации (это позволяет не заботится о его стерильности), поэтому он добавляется к клеткам в два этапа. Причем, лучше добавлять так, чтобы не возникало зон "высокой концентрации" (но погружать конец типчика в суспензию клеток нельзя - DMSO замерзнет и закупорит тип). Либо по каплям при постоянном перемешивании, либо нанести на стенки охлажденной пробирки (где DMSO замерзнет), с которых смыть, помешивая пробирку.

    • п. 17.

  • Непроверенная информация Пробирка должна быть пластиковой, применение стеклянной пробирки может понизить эффективность приблизительно в 10 раз (по видимому, из-за адсорбции DNA на стекло).

    • п. 18.

  • Непроверенная информация Замораживание в жидком азоте (холодовой шок) повышает компетентность в 4-5 раз.
  • Непроверенная информация Влияние размера плазмиды на эффективность трансформации: молярная частота практически постоянна для размеров ~3-7.5kb;

    • для 10kb ~ 50%;
    для 13kb ~ 27%;
    для 17.5kb ~ 15%.

    п.24.

  • Тепловой шок: температура может быть в интервале 40-50oС.
  • Непроверенная информация Есть сообщение, что если тепловой шок заменить "замораживанием в жидком азоте (1'), оттаиванием (до NT)", то компетентность повысится в ~10 раз.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    Krll /17.06.2006 15:30/
    жаргон очень не удобно редактировать, если вставлять методику в заявку на патент или другую научную работу



    Гость /26.08.2008 15:39/
    2M Mg2+{= 1M MgCl2+1M MgSO4}
    Поясните, пожалуйста, что это значит? Как получается 2M Mg2+



    phen /27.08.2008 12:24/
    Здравствуйте, у меня большая проблема с получением компетентных клеток E.coli.

    Для сиквенирования интересующей меня последовательности амплифицировал свой ген и клонировал его в плазмиду pBlunt 1.2 (Fermentas) . Затем трансформировал клетки E.coli DH5a с помощью TransformAid Bacterial transformation kit (Fermentas) и не получил ничего. Контрольная трансформация с продуктом Fermentas тоже ничего не дала. Решили ,что клетки получаются не компетентные и приготовили собственные двумя методами: кальциевым и с помощью TSS буфера по Сhung Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol86, pp 2172-2175, 1989.

    В первом случае результат отрицательный. Во втором получены крупные одиночные колонии,в которых не визуализируется плазмида,но в отдельных редких случаях визуализирутеся вставка моего гена.

    Как это можно объяснить? И как ,по Вашему мнению , получить компетентные клетки с достаточно высокой эффективностью трансформации?

    Буду весьма благодарен Вам за помощь!



    Guest /27.08.2008 15:08/
    (Гость @ 26.08.2008 14:39)
    Ссылка на исходное сообщение  2M Mg2+{= 1M MgCl2+1M MgSO4}
    Поясните, пожалуйста, что это значит? Как получается 2M Mg2+

    1+1=2



    AleksandraL /27.08.2008 16:48/
    (Guest @ 27.08.2008 13:08)
    Ссылка на исходное сообщение  1+1=2


    Не, не получится... 1 М разбавить в два раза (1+1 объем) = 0.5 М



    AleksandraL /27.08.2008 16:50/
    (phen @ 27.08.2008 10:24)
    Ссылка на исходное сообщение  

    В первом случае результат отрицательный. Во втором получены крупные одиночные колонии,в которых не визуализируется плазмида,но в отдельных редких случаях визуализирутеся вставка моего гена.

    Как это можно объяснить? И как ,по Вашему мнению , получить компетентные клетки с достаточно высокой эффективностью трансформации?



    А как Вы в колониях визуализируете плазмиду или вставку?



    nakushok /29.08.2008 15:06/
    На 1 литр 2М Mg-solution надо взять:
    203,3 г MgCl2*6Х20 (1 моль) и 246,47 г MgSO4*7H2О (1 моль)



    юбочка25 /05.09.2008 11:17/
    народ, кто-то может дать ссылку на сайты где можно прочитать про баллистическую трансформацию. не как она используется а что это такое вообще. для чего. какие преимущества и недостатки!



    kapitoshka /01.03.2010 16:19/
    привет! а кто-нибудь может выложить методику действенной трансформации АГРОБАКТЕРИИ?



    Daemonarchestratygos /01.03.2010 21:45/
    (юбочка25 @ 05.09.2008 09:17)
    Ссылка на исходное сообщение  народ, кто-то может дать ссылку на сайты где можно прочитать про баллистическую трансформацию. не как она используется а что это такое вообще. для чего. какие преимущества и недостатки!


    Частицами золота (или другого химически инертного металла), покрытыми ДНКой, пуляют по культуре клеток. Стрельба из gene gun ведётся неприцельно, но в некоторые клетки частицы попадают, пробивая их, и ДНК оказывается внутри, после чего с весьма низкой вероятностью встраивается в геном. Таким образом, происходит чисто механическая доставка генетического материала в клетку. Такой трудоёмкий и дорогостоящий наноартобстрел является фактически универсальным способом трансформации клеток, но обычно используется лишь для очень "трудных" и "упрямых" объектов, которые иным путём трансформировать практически нереально (для некоторых растительных клеток, например). Преимущества и недостатки кратко отражены в предыдущем предложении.

    http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_gun ( http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_gun )



    protein /01.03.2010 22:42/
    ну не такой уж и трудоемкий. вполне себе рутинный. вот только эффективность не очен высокая.



    Odysseus /02.03.2010 12:46/
    привет! а кто-нибудь может выложить методику действенной трансформации АГРОБАКТЕРИИ?


    Three Methods for the Introduction of Foreign DNA
    into Agrobacterium.
    В прикрепленном файле.



    Файл/ы:

    MMB.pdf
    Размер:: 124.91к
    кол-во скачиваний: 16








       
Дата последней модификации: 17/06/06

ГЛАВНАЯ · БИОХИМИЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · ТУРИЗМ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · ZBIO
Синтол · Millipore · Диаэм · Axygen · ДНК-синтез · БиоЛайн · Beckman Coulter · Хеликон · Химмед · Биосан · Merck KGaA · Waters · Elite-Genetix      

Сотовые телефоны и аксессуары к ним на SotMarket.ru · Горобзор Уфы

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler