√лавна€ страница MolBiol.ru > ћетоды > Ѕактерии > ’имически компетентные клетки Rambler's Top100
√Ћј¬Ќјя Ј ѕ–ќ≈ “ Ј —ѕ–ј¬ќ„Ќ»  Ј ћ≈“ќƒџ Ј –ј—“¬ќ–џ Ј –ј—„®“џ Ј Ћ»“≈–ј“”–ј Ј «јƒј„» Ј FULL TEXT Ј ќ–√.¬ќѕ–ќ—џ Ј WEB
‘»–ћџ Ј  ј–“ј —ј…“ј Ј COFFEE BREAK Ј  ј–“»Ќ » Ј –јЅќ“џ » ”—Ћ”√» Ј Ѕ»–∆ј “–”ƒј Ј ‘ќ–”ћџ Ј Ј Zbio-wiki

“рансформаци€ бактерий

’имически компетентные клетки можно трансформировать неочищенной лигазной смесью (и вообще DNA, наход€щейс€ в умеренно солевом буфере).

 оличество клеток в химически-компетентной фасовке значительно меньше чем в электрокомпетентной, поэтому можно высевать всю фасовку на одну чашку.

    ѕриготовление компетентных клеток

  1. со стока (-70o—) рассе€ть бактерии штрихом на чашку с селективной средой;
  2. выращивать 37o—, ON;
  3. несколько колоний (10-12) диаметром ~2-3mm поместить в 40ml SOB в колбе 0.5-1.0L.
  4. интенсивно встр€хивать (200-300rpm)
  5. * либо при 37o— - компетентность среднего уровн€, но врем€ роста небольшое,
    * либо при 18o— (переставить качалку в холодную комнату) - компетентность выше, но врем€ роста - несколько суток;

  6. растить OD600= 0.6

  7. все дальнейшие манипул€ции проводить на холоду.

  8. в 50ml цф-пробирку поместить 30ml культуры;
  9. 0oC, 10-15';
  10. ÷‘ 2-3krpm 4oC, 10', слить супернатант;
  11. ÷‘ 2-3krpm 4oC, 20'', тщательно удалить остатки жидкости;
  12. суспензировать в 10ml TB;
  13. 0o—, 10-15';
  14. повторить п.7, 8;
  15. ресуспензировать в 2ml TB;
  16. + DMSO до 3.5% (70µl);
  17. 0o—, 10-15';
  18. повторить п.14,15;
  19. разаликвотить по 100µl в охлажденные 2ml пробирки с завинчивающимис€ крышками;
  20. заморозить в жидком азоте;
  21. хранить в жидком азоте (лучше) или на -70o—.
  22.  онтрольна€ трансформаци€

  23. приготовить из 100х стока (0.5µg/ml) свежий раствор pDNA 5ng/ml;
  24. отта€ть во льду 0.5M bMeEtOH и аликвоту клеток;
  25. к аликвоте компетентных клеток добавить:
  26. 4µl 0.5M bMeEtOH,
    2µl (10pg) pDNA;

  27. 0oC, 20-60';
  28. 42oC, 30'', без встр€хивани€;
  29. сразу в лед, 2';
  30. + 400µl SOC;
  31. плотно завинтить крышку, встр€хивать горизонтально на бактериальном шейкере 37o—, 30';
  32. высе€ть 50µl на чашку с антибиотиком;
  33. если выросло "N" колоний, то компетентность = Nх106[колоний/µg].
  34. –еальна€ трансформаци€

    1. аналогично "контрольной";
    2. на одну аликвоту можно брать pDNA в объЄме <10µl;
    3. высев - в зависимости от задачи:
    4. * если требуетс€ получить несколько индивидуальных колоний (например, при создании генно-инженерной конструкции), то высе€ть 100-200µl (об€зательно неравномерно - растереть шпателем по одной половине чашки, и только когда жидкость подсохнет, сделать один (!) мазок по второй половине),
      * если требуетс€ получить как можно больше колоний при разумной плотности (например, при создании библиотеки), то высе€ть 10-50µl дл€ определени€ титра (равномерно), оставшиес€ клетки хранить ON при 0o— (титр при этом не измен€етс€). Ќа следующий день рассчитать количество клеток на высев, высе€ть.



MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 59224

    –астворы

    TB

    (хранить при 4o—)

     онц.—ток0.5L1L
    PIPES10mM302.37g/M1.51g3.02g
    MnCl2x2H2O55mM161.9 g/M4.45g8.90g
    MnCl2x4H2O 197.91g/M 5.44g 10.89g
    CaCl2x2H2O15mM147.02 g/M1.10g2.21g
    KCl250mM74.55 g/M9.32g18.64g
    H2O mQ   
  • смешать все компоненты, кроме MnCl2, довести KOH pH до 6.7(~650 µl 1N на 0.5L TB). ƒобавить MnCl2, стерилизовать фильтрацией через 0.45µm фильтр.
  • ≈сли вместо PIPES использовать HEPES,то:
  • HEPES10mM238.3g/M1.19g2.38g

    SOC, SOB

    (хранить при NT).

    —ток200ml400ml
    Bactotryptoneтв.4.0g8.0g
    Bacto Yest extr.тв.1.1g2.2g
    NaCl5M0.4ml0.8ml
    KCl1M2.0ml4ml
    H2OmQ~196ml~391ml
    1. автоклавировать, охладить до <60o—;
    2. добавить:
    3. 0.01V 2M Mg2+{= 1M MgCl2+1M MgSO4}   
      0.01V 2M glucose;   

    4. фильтровать через 0.2µm фильтр;
    5. аликвотить, хранить при -20oC, (-70oC).

    SOB получаетс€, если не добавл€ть глюкозу.

    ß-меркаптоэтанол

    0.5M (хранить при +4o—).

     онц.—ток1ml
    ßMeEtOH0.5M14.3M35µl
    H2O mQ965µl

    2M Mg-solution

    (стерилизовать автоклавированием, хранить при NT), p=1.173:

     онц.—ток100ml
    MgCl2x6H2O1M203.3g/M20.33g
    MgSO4x7H2O1M246.47g/M24.65g
    H2O mQ72.3ml


—мотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/



     омментарии

    ќбщие

  • »сточник: H.Inoue, H.Nojima, H.Okayama "High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids", Gene, 96(1990), 23-8.
  • ¬ данной методике дол€ компетентных клеток ~10%.
  • „астота трансформации посто€нна до ~10ng pDNA/100µl клеток, далее весьма быстро падает.
  • Ќасыщение в районе 100-200ng/100µl клеток.
  • >25ng/100µl клеток - с заметной частотой по€вл€ютс€ двойные трансформанты.
  • ¬ случае большого количества простых трансформаций (например, клонирование плазмид) работу можно значительно ускорить, если (i) брать дл€ трансформации маленький объЄм клеток (~20µl), (ii) высевать штрихом сразу после теплового шока (без "оживлени€").
  • ћы читали и слышали совершенно разные мнени€ о требовани€х, предъ€вл€емых к качеству DMSO. ѕоэтому на вс€кий случай пользуемс€ "Sigma, #D2650", расфасованным под аргоном (аликвоты в ампулах по 5 или 10ml). ‘асуем его один раз и храним фасовки при -70o—.
  • ќсновные преимущества химически компетентных клеток перед электрокомпетентными:
    1. ’имически компетентные клетки можно трансформировать неочищенной лигазной смесью (и вообще DNA, наход€щейс€ в умеренно солевом буфере). ¬ случае электрокомпетентных - DNA должна быть очищена, т.к.: (i) слишком высока€ концентраци€ соли способна вызвать искровой разр€д в €чейке (ii) при электротрансформации в оболочке E. coli по€вл€ютс€ дырки, в них может проникнуть фермент, используемый дл€ лигировани€.
    2.  оличество клеток в электрокомпетентной фасовке значительно больше, чем в химически-компетентных, поэтому не стоит пытатьс€ высевать на одну чашку слишком большую долю фасовки. Ёто чревато подростом (по€влением сателлитных колоний) и снижением компетентности.

    ѕо пунктам

    п.4, 5.

  • –ост при 37o— приводит к резкой (с острым максимумом) зависимости компетентности от плотности клеток (A600=0.45 дл€ DH10B). ѕри 18o— высока€ компетентность достигаетс€ в широком интервале A600=0.35-0.70.
  • —в€зь концентрации клеток с оптической плотностью: OD550=c[cells/ml]*108/k.
  • Ўтаммkдиапазон OD550
    JM1091.10.36-0.64
    SURE1.60.25-0.44
    XL-1Blue2.00.20-0.35
    XL-1BlueMRF'1.90.21-0.37

    п.10.

  • PIPES в составе TB можно заменить на HEPES или BES. Ёто приведЄт лишь к небольшому уменьшению компетентности. Ёффективность трансформации практически посто€нна в диапазоне pH 5.6-7.0, однако при pH>7.0 MnCl2выпадает в осадок.
  • п.14.

  • DMSO токсичен дл€ бактерий в высокой концентрации (это позвол€ет не заботитс€ о его стерильности), поэтому он добавл€етс€ к клеткам в два этапа. ѕричем, лучше добавл€ть так, чтобы не возникало зон "высокой концентрации" (но погружать конец типчика в суспензию клеток нельз€ - DMSO замерзнет и закупорит тип). Ћибо по капл€м при посто€нном перемешивании, либо нанести на стенки охлажденной пробирки (где DMSO замерзнет), с которых смыть, помешива€ пробирку.
  • п. 17.

  • Ќепроверенна€ информаци€ ѕробирка должна быть пластиковой, применение стекл€нной пробирки может понизить эффективность приблизительно в 10 раз (по видимому, из-за адсорбции DNA на стекло).
  • п. 18.

  • Ќепроверенна€ информаци€ «амораживание в жидком азоте (холодовой шок) повышает компетентность в 4-5 раз.
  • Ќепроверенна€ информаци€ ¬ли€ние размера плазмиды на эффективность трансформации: мол€рна€ частота практически посто€нна дл€ размеров ~3-7.5kb;
  • дл€ 10kb ~ 50%;
    дл€ 13kb ~ 27%;
    дл€ 17.5kb ~ 15%.

    п.24.

  • “епловой шок: температура может быть в интервале 40-50o—.
  • Ќепроверенна€ информаци€ ≈сть сообщение, что если тепловой шок заменить "замораживанием в жидком азоте (1'), оттаиванием (до NT)", то компетентность повыситс€ в ~10 раз.

    ƒополнени€, комментарии, вопросы

    Krll /17.06.2006 15:30/
    жаргон очень не удобно редактировать, если вставл€ть методику в за€вку на патент или другую научную работу



    √ость /26.08.2008 15:39/
    2M Mg2+{= 1M MgCl2+1M MgSO4}
    ѕо€сните, пожалуйста, что это значит?  ак получаетс€ 2M Mg2+



    phen /27.08.2008 12:24/
    «дравствуйте, у мен€ больша€ проблема с получением компетентных клеток E.coli.

    ƒл€ сиквенировани€ интересующей мен€ последовательности амплифицировал свой ген и клонировал его в плазмиду pBlunt 1.2 (Fermentas) . «атем трансформировал клетки E.coli DH5a с помощью TransformAid Bacterial transformation kit (Fermentas) и не получил ничего.  онтрольна€ трансформаци€ с продуктом Fermentas тоже ничего не дала. –ешили ,что клетки получаютс€ не компетентные и приготовили собственные двум€ методами: кальциевым и с помощью TSS буфера по —hung Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol86, pp 2172-2175, 1989.

    ¬ первом случае результат отрицательный. ¬о втором получены крупные одиночные колонии,в которых не визуализируетс€ плазмида,но в отдельных редких случа€х визуализирутес€ вставка моего гена.

     ак это можно объ€снить? » как ,по ¬ашему мнению , получить компетентные клетки с достаточно высокой эффективностью трансформации?

    Ѕуду весьма благодарен ¬ам за помощь!



    Guest /27.08.2008 15:08/
    (√ость @ 26.08.2008 14:39)
    —сылка на исходное сообщени円2M Mg2+{= 1M MgCl2+1M MgSO4}
    ѕо€сните, пожалуйста, что это значит?  ак получаетс€ 2M Mg2+

    1+1=2



    AleksandraL /27.08.2008 16:48/
    (Guest @ 27.08.2008 13:08)
    —сылка на исходное сообщени円1+1=2


    Ќе, не получитс€... 1 ћ разбавить в два раза (1+1 объем) = 0.5 ћ



    AleksandraL /27.08.2008 16:50/
    (phen @ 27.08.2008 10:24)
    —сылка на исходное сообщени円

    ¬ первом случае результат отрицательный. ¬о втором получены крупные одиночные колонии,в которых не визуализируетс€ плазмида,но в отдельных редких случа€х визуализирутес€ вставка моего гена.

     ак это можно объ€снить? » как ,по ¬ашему мнению , получить компетентные клетки с достаточно высокой эффективностью трансформации?



    ј как ¬ы в колони€х визуализируете плазмиду или вставку?



    nakushok /29.08.2008 15:06/
    Ќа 1 литр 2ћ Mg-solution надо вз€ть:
    203,3 г MgCl2*6’20 (1 моль) и 246,47 г MgSO4*7H2ќ (1 моль)



    юбочка25 /05.09.2008 11:17/
    народ, кто-то может дать ссылку на сайты где можно прочитать про баллистическую трансформацию. не как она используетс€ а что это такое вообще. дл€ чего. какие преимущества и недостатки!



    kapitoshka /01.03.2010 16:19/
    привет! а кто-нибудь может выложить методику действенной трансформации ј√–ќЅј “≈–»»?



    Daemonarchestratygos /01.03.2010 21:45/
    (юбочка25 @ 05.09.2008 09:17)
    —сылка на исходное сообщение  народ, кто-то может дать ссылку на сайты где можно прочитать про баллистическую трансформацию. не как она используетс€ а что это такое вообще. дл€ чего. какие преимущества и недостатки!


    „астицами золота (или другого химически инертного металла), покрытыми ƒЌ ой, пул€ют по культуре клеток. —трельба из gene gun ведЄтс€ неприцельно, но в некоторые клетки частицы попадают, пробива€ их, и ƒЌ  оказываетс€ внутри, после чего с весьма низкой веро€тностью встраиваетс€ в геном. “аким образом, происходит чисто механическа€ доставка генетического материала в клетку. “акой трудоЄмкий и дорогосто€щий наноартобстрел €вл€етс€ фактически универсальным способом трансформации клеток, но обычно используетс€ лишь дл€ очень "трудных" и "упр€мых" объектов, которые иным путЄм трансформировать практически нереально (дл€ некоторых растительных клеток, например). ѕреимущества и недостатки кратко отражены в предыдущем предложении.

    http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_gun ( http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_gun )



    protein /01.03.2010 22:42/
    ну не такой уж и трудоемкий. вполне себе рутинный. вот только эффективность не очен высока€.



    Odysseus /02.03.2010 12:46/
    привет! а кто-нибудь может выложить методику действенной трансформации ј√–ќЅј “≈–»»?


    Three Methods for the Introduction of Foreign DNA
    into Agrobacterium.
    ¬ прикрепленном файле.



    ‘айл/ы:

    MMB.pdf
    –азмер:: 124.91к
    кол-во скачиваний: 16




    RJ Dio /30.06.2011 11:50/
    (phen @ 27.08.2008 13:24)
    —сылка на исходное сообщени円«дравствуйте, у мен€ больша€ проблема с получением компетентных клеток E.coli.

    † ƒл€ сиквенировани€ интересующей мен€ последовательности амплифицировал свой ген и клонировал его в плазмиду pBlunt 1.2 (Fermentas) . «атем трансформировал клетки E.coli DH5a с помощью TransformAid Bacterial transformation kit (Fermentas) и не получил ничего.  онтрольна€ трансформаци€ с продуктом Fermentas тоже ничего не дала. –ешили ,что клетки получаютс€ не компетентные и приготовили собственные двум€ методами: кальциевым и с помощью TSS буфера по —hung Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol86, pp 2172-2175, 1989.

    ¬ первом случае результат отрицательный. ¬о втором получены крупные одиночные колонии,в которых не визуализируетс€ плазмида,но в отдельных редких случа€х визуализирутес€ вставка моего гена.

     ак это можно объ€снить? » как ,по ¬ашему мнению , получить компетентные клетки с достаточно высокой эффективностью трансформации?

    Ѕуду весьма благодарен ¬ам за помощь!


    ¬озьмите √ловера (книжка така€), там куча методик приготовлени€ клеток, выберите ту, что вам гл€нетс€ технологически, замет возьмите самые чистые соли и самую хорошую вод, и поимеете свои 10 в 7, одназначна



    GG /30.06.2011 13:05/
    ” ферментаса совершенно обычный кит дл€ трансформации, скорее всего на основе хлористого кальци€ с какими-нибудь добавками (T-solution). ” √ловера ничего принципиально другого не написано. » уж с их собственным контролем кит работать должен. ѕричин, по которым трансформаци€ у афтара не пошла может быть миллион, скорее всего просто клетки сдохли.



    RJ Dio /30.06.2011 23:05/
     ј  почти все от ‘ерментаса в –оссии. ”ж не знаю почему, но удивительным образом ‘.-реактивы тухлые. ƒавно избегаю покупки чего бы то ни было у них. ѕо мне, —ибЁнзим или NEB просто на голову выше. ƒаже ѕромега, не к ночи будь пом€нута. ј компетешки забугорные практически никогда не доезжают в нормальном виде, или самим делать, ли покупать местные



    Cruel /22.01.2013 13:21/
    «дравствуйте,

    ѕожалуйста, про€сните несколько моментов в процессе трансформации:

    первое, что хотелось бы узнать, происходит ли деление трансформированны клеток при инкубации на шейкере после хит-шока? “.е. на данном этапе происходит восстановление компетентных клеток, значит они могут делитьс€ в течении этого времени (45мин, 1 час). „то значит восстановление клеток?

    ¬торой вопрос тоже св€зан с инкубацией после хит-шока. Ќекоторые говор€т, что в это врем€ происходит наработка устойчивости к антибиотикам, как же она происходит, если ген индуцируетс€ субстратом (антибиотиком), а в среде в этот момент никаких антибиотиков нет.
    «аранее прошу прощени€ такое безобразное знание предмета.
    спасибо за отзывы



    RJ Dio /22.01.2013 13:54/
    просто клеткам надо немного придти в себ€ после издевательства хит-шоком. ƒа и стенок у них нет, надо нарастить. ¬р€д ли они успевают поделитьс€ за 45 мин. ¬озможно, плазмида, попавша€ в единичной копии, успевает амплифицироватьс€ и частью репарироватьс€- так клетка готовитс€ к встрече с антибиотиком. ¬прочем, подращивание есть процесс необ€зательный, кол-во трансформантов увеличиваетс€, но не на пор€док.



    Cruel /22.01.2013 13:59/
    если в это врем€ 45 мин, происходит восстановление, что значит восстановление основных функций и структур, тогда можно ли центрифугировать эти клетки после 45 мин, а потом ресуспендировать в вортексе? (чтоб всех посадить на чашку)
    спасибо



    guest: ммм /22.01.2013 14:03/
    „то бы посадить все на чашку. Ќадо просто сажать потихоньку втира€, долго и упорно, раз за разом.



    Cruel /22.01.2013 14:06/
    так можно ли центрифугировать или нет?



    ernesta88 /22.01.2013 14:36/
    штоб ¬—≈ посадить на чашку можно не втирать а просто вылить все содержимое на чашку и высушить ^_^ главное не забыть потом чашку закрыть

    центрифугировать можно имхо, почему бы нет,



    Cruel /22.01.2013 15:11/
    некоторые считают, что после центрифугировани€ и последующего вортексировани€ умирают бедные клетки и нет мне прощень€



    ernesta88 /22.01.2013 15:58/
    зачем вортексировать, можно просто развести в маленьком объеме среды 100 мкл а вообще не понимаю в чем проблема чем раздумывать над тем центрифугировать-не центрифугировать лучше вылить их на чашки петри и высушить приоткрыв крышки впрочем может быть вы над стерильностью дрожите тогда другое дело



    guest: ммм /22.01.2013 16:21/
    --штоб ¬—≈ посадить на чашку можно не втирать а просто вылить все содержимое на чашку и высушить

     ака будет!



    RJ Dio /22.01.2013 16:50/
    (Cruel @ 22.01.2013 14:59)
    —сылка на исходное сообщени円если в это врем€ 45 мин, происходит восстановление, что значит восстановление основных функций и структур, тогда можно ли центрифугировать эти клетки после 45 мин, а потом ресуспендировать в вортексе? (чтоб всех посадить на чашку)
    спасибо

    безусловно, можно, так делают, когда спешат- крут€т сек 30 на сбрасывателе/вортексе, убирают % 70 супера, остальное суспендируют- и на чашку. Ќа результате не сказываетс€



    ernesta88 /22.01.2013 17:09/
    (guest: ммм @ 22.01.2013 17:21)
    —сылка на исходное сообщени円--штоб ¬—≈ посадить на чашку можно не втирать а просто вылить все содержимое на чашку и высушить

     ака будет!


    нифига подобного

    тока сегодн€ скрининговала колонии посаженные таким образом все ок и вообще часто так делаю потому что храню клетки на -20, снижаетс€ компетентность



    RJ Dio /22.01.2013 17:38/
    это как это можно хранить клетки на -20, если они в 12-15% глицерине? „то за чушь, они же незамерзшие!



    Cruel /22.01.2013 18:01/
    ну что же всем спасибо за помощь, советы, предложени€.
    мне главное было знать, не €вл€ютс€ ли мои действи€ профанацией. в итоге € пон€л, что все что € делаю, это вариации обычного протокола.



    RJ Dio /22.01.2013 18:04/
    пока что вы много чего не пон€ли.  огда у вас будет сложное клонирование, и ожидаемое число трансформантов будет исчисл€тьс€ единицами, вот тогда и поймете разницу между спецом и дилетантом



    ernesta88 /22.01.2013 18:21/
    (RJ Dio @ 22.01.2013 18:38)
    —сылка на исходное сообщени円это как это можно хранить клетки на -20, если они в 12-15% глицерине? „то за чушь, они же незамерзшие!

    ну если -80 в другом корпусе, то лень ходить за ними каждый день

    электрокомпетентные на -20 нормально хран€тс€ до мес€ца, потом новые делаю из стока к-й на -80.

    вполне себе нормально хран€тс€, проверено опытом, тока компетентность к концу мес€ца падает. на качество работы это ни разу не вли€ло, кстати.



    RJ Dio /22.01.2013 18:24/
    не лень вам. каждый мес€ц делать...оно конечно, если только дл€ себ€...ј коли цела€ лаба пасетс€...



    ernesta88 /22.01.2013 18:41/
    ну это да если вс€ лаба... но у нас этим от силы 2 человека занимаютс€ включа€ мен€. € тоже хочу -80— вблизи, мечта можно сказать. но его просто некуда поставить.



    Cruel /22.01.2013 18:46/
    (RJ Dio @ 22.01.2013 22:04)
    —сылка на исходное сообщени円пока что вы много чего не пон€ли.  огда у вас будет сложное клонирование, и ожидаемое число трансформантов будет исчисл€тьс€ единицами, вот тогда и поймете разницу между спецом и дилетантом

    мне главное сейчас пон€ть, что в принципе все правильно. делал все по протоколу, результаты всегда хорошие. но вот сегодн€, когда € ресуспендировал клетки на вортексе, мен€ увидел коллега и ужасалс€ брутальным обхождением с клетками. типа € профан и ничего не понимаю, что делаю. не спец €, а чтобы не быть профаном, обращаюсь за помощью сюда. спасибо вам



    Esya /22.01.2013 19:33/
    2 Cruel:
    сделайте контроль, на вортексе и как прос€т, если разницы нет, то и нет

    в молекул€рной генетике многие вещи на уровне заклинаний, как человек привык - то и считаетс€ правильным

    лаборантку, например, до мен€ научили, что чашку после размазывани€ надо 2 часа держать при комнатной температуре вверх агаром, бедна€ женщина домой не уходила, два часа по секундомеру ждала



    RJ Dio /23.01.2013 10:53/
    (Esya @ 22.01.2013 20:33)
    —сылка на исходное сообщени円2 Cruel:
    сделайте контроль, на вортексе и как прос€т, если разницы нет, то и нет

    в молекул€рной генетике многие вещи на уровне заклинаний, как человек привык - то и считаетс€ правильным

    лаборантку, например, до мен€ научили, что чашку после размазывани€ надо 2 часа держать при комнатной температуре вверх агаром, бедна€ женщина домой не уходила, два часа по секундомеру ждала

    бьюсь об заклад, она была китайска€ женщина поздне-бальзаковского возраста



    RJ Dio /23.01.2013 10:55/
    € люблю в таких случа€х термин "маниатисовшина". ’от€ к древнему греку отношение самое почтительное, если бы не он и ќстерман, кто б нас науке учил



    AzAbd /24.01.2013 18:45/
    ¬сем бодрого времени суток и хорошей компетентности колей!  огда € еще капал, попалась мне на глаза стать€ (только не смейтесь) из African journal of biotechnology :

    http://www.academicjournals.org/ajb/PDF/pd...%20al%20pdf.pdf ( http://www.academicjournals.org/ajb/PDF/pdf2010/13Dec/Li%20et%20al%20pdf.pdf )

    ѕо-моему, ломовейша€ работа. ѕравда, у мен€ этим методом получалось что-то около 5*10^6-10^7, поскольку воспроизводил неточно. “ак что может и к лучшему, что € сейчас не капаюsmile.gif



    ernesta88 /24.01.2013 19:13/
    ага жив€ в стране белых ниггеров сме€тьс€ над журналом чорных ниггеров как-то не комильфо сами в африкеъ жывемъ



    Svet11 /19.05.2014 11:28/
     оллеги, помогите советом. ƒелаю трансформацию агро + плазмида pBI (с моим конструктом).  олонии вырастают, но моей вставки ѕ÷– не обнаруживает (использовала разные группы праймеров и делала контроль). ¬ыгл€дит - как будто не трансформированы.Ќо вырастают на среде с селективным антибиотиком (антибиотики рабочие- проверено контролем, все свежее). ѕрочла, что бывают ложно позитивные колонии.  ак с этим боротьс€? Ўтамм - агро GV3101. —пасибо!



    plotter /01.09.2014 12:23/
    ƒруги, а есть ли в природе кит дл€ получени€ химических компетешек? „тобы быстро и просто. » эффективность чтобы 10^6-10^7 была.



    plotter /01.09.2014 12:25/
    "ѕрочла, что бывают ложно позитивные колонии.  ак с этим боротьс€?"
    фосфатазой вектору концы обкарнать.



    guest: ммм /01.09.2014 17:06/
    -ƒруги, а есть ли в природе кит дл€ получени€ химических компетешек? „тобы быстро и просто. » эффективность чтобы 10^6-10^7 была.

    мы сами такой кит делаем из рубиди€ по старинному маниатису, правда 10^7 наверное далеко не всегда.

    --ѕрочла, что бывают ложно позитивные колонии.  ак с этим боротьс€?
    Ѕыли, есть и будут.
    --фосфатазой вектору концы обкарнать.
    Ёто не спасет, но улучшит.

    вот ссылка http://www.thermoscientificbio.com/uploade...information.pdf ( http://www.thermoscientificbio.com/uploadedFiles/Resources/k271-product-information.pdf )
    похоже это такой кит, как вам надо

    в их киты по клонированию тоже входит кит и дл€ трансформации не уверен такой же он или нет, но с ними мы работали и он €вно основан на немецком протоколе с hepes'ом(mops'ом, pipes'ом) и хлоридом кали€



    plotter /01.09.2014 17:18/
    ѕасиб. »зучу. јто возн€ (точнее перевозка) с готовыми не радует что-то.



    Tuco Ramires /02.09.2014 12:03/
    (plotter @ 01.09.2014 13:23)
    —сылка на исходное сообщение†ƒруги, а есть ли в природе кит дл€ получени€ химических компетешек? „тобы быстро и просто. » эффективность чтобы 10^6-10^7 была.



    —качать файл PNAS_1989_Chung_2172_5.pdf
    –азмер:: 830.77к
    кол-во скачиваний: 1359




    ѕроще некуда. ћогу выжимку в виде протокола заслать



    volmin /17.11.2019 03:16/
    —Б—В—А–∞ ( http://audiobookkeeper.ru )76.1 ( http://cottagenet.ru )Bett ( http://eyesvision.ru )Bett ( http://eyesvisions.com )Fran ( http://factoringfee.ru )Jewe ( http://filmzones.ru )Mari ( http://gadwall.ru )—Г—З–Є–ї ( http://gaffertape.ru )Mary ( http://gageboard.ru )Fair ( http://gagrule.ru )Stor ( http://gallduct.ru )—Б–Ї–ї–∞ ( http://galvanometric.ru )–Ъ–Є—В–∞ ( http://gangforeman.ru )Luck ( http://gangwayplatform.ru )Turb ( http://garbagechute.ru )
    Peer ( http://gardeningleave.ru )Atla ( http://gascautery.ru )Duns ( http://gashbucket.ru )3CU2 ( http://gasreturn.ru )Dolb ( http://gatedsweep.ru )Supe ( http://gaugemodel.ru )–Ы–Є—Е–љ ( http://gaussianfilter.ru )–§–µ—В–Є ( http://gearpitchdiameter.ru )–Т–µ—З–Ї ( http://geartreating.ru )–Ъ–Є—В–∞ ( http://generalizedanalysis.ru )Komm ( http://generalprovisions.ru )–Я–∞–≤–ї ( http://geophysicalprobe.ru )Spla ( http://geriatricnurse.ru )Jewe ( http://getintoaflap.ru )–Њ–±—Б–ї ( http://getthebounce.ru )
    –®–Є–ї–Њ ( http://habeascorpus.ru )—Б—В–µ—А ( http://habituate.ru )Geza ( http://hackedbolt.ru )–Ь–Њ–ґ—Г ( http://hackworker.ru )–†–∞–љ–Њ ( http://hadronicannihilation.ru )–Р–≤—В–Њ ( http://haemagglutinin.ru )Tean ( http://hailsquall.ru )–Њ–±—Б–ї ( http://hairysphere.ru )—З–Є—В–∞ ( http://halforderfringe.ru )–У–Є–≥–Є ( http://halfsiblings.ru )–°—Г—Е–Њ ( http://hallofresidence.ru )–∞–≤—В–Њ ( http://haltstate.ru )—Г–њ–∞–Ї ( http://handcoding.ru )Wind ( http://handportedhead.ru )Kreo ( http://handradar.ru )
    Luci ( http://handsfreetelephone.ru )Brau ( http://hangonpart.ru )–Т–Њ–ї—Е ( http://haphazardwinding.ru )Work ( http://hardalloyteeth.ru )–†–∞–µ–≤ ( http://hardasiron.ru )Humm ( http://hardenedconcrete.ru )WASD ( http://harmonicinteraction.ru )Mass ( http://hartlaubgoose.ru )SDHC ( http://hatchholddown.ru )Alex ( http://haveafinetime.ru )–Ф—А–∞–± ( http://hazardousatmosphere.ru )–Р–ї—П—Г ( http://headregulator.ru )Rudo ( http://heartofgold.ru )Coto ( http://heatageingresistance.ru )Open ( http://heatinggas.ru )
    (184 ( http://heavydutymetalcutting.ru )–Ш–≤–∞–љ ( http://jacketedwall.ru )Will ( http://japanesecedar.ru )–†–Њ—Б—Б ( http://jibtypecrane.ru )–†–∞—Д–∞ ( http://jobabandonment.ru )–Я–µ—А–≤ ( http://jobstress.ru )Clif ( http://jogformation.ru )HTML ( http://jointcapsule.ru )–Ф–Љ–Є—В ( http://jointsealingmaterial.ru )Bell ( http://journallubricator.ru )Dima ( http://juicecatcher.ru )–Х–≤—А–Њ ( http://junctionofchannels.ru )Wind ( http://justiciablehomicide.ru )Wind ( http://juxtapositiontwin.ru )Mark ( http://kaposidisease.ru )
    –†–ґ–Є–≥ ( http://keepagoodoffing.ru )Wind ( http://keepsmthinhand.ru )Leno ( http://kentishglory.ru )–С—А–∞–љ ( http://kerbweight.ru )–Ґ–Њ–Њ–Љ ( http://kerrrotation.ru )Game ( http://keymanassurance.ru )Your ( http://keyserum.ru )Feel ( http://kickplate.ru )—Б–µ—А–µ ( http://killthefattedcalf.ru )Comp ( http://kilowattsecond.ru )Gamm ( http://kingweakfish.ru )–њ–Њ—В—А ( http://kinozones.ru )–Є–ї–ї—О ( http://kleinbottle.ru )Pure ( http://kneejoint.ru )Beau ( http://knifesethouse.ru )
    Duke ( http://knockonatom.ru )–†–∞–µ–≤ ( http://knowledgestate.ru )–Љ–∞—Б–Ї ( http://kondoferromagnet.ru )–Ъ–Є—В–∞ ( http://labeledgraph.ru )Arts ( http://laborracket.ru )–њ–Њ–њ—Г ( http://labourearnings.ru )–Љ–µ–љ—П ( http://labourleasing.ru )–Њ–љ–Ї–Њ ( http://laburnumtree.ru )—Б–µ—А—В ( http://lacingcourse.ru )–°–∞–≤–Є ( http://lacrimalpoint.ru )–°–Є–љ–≥ ( http://lactogenicfactor.ru )–Я–Є—Б–∞ ( http://lacunarycoefficient.ru )–∞–≤—В–Њ ( http://ladletreatediron.ru )Bert ( http://laggingload.ru )–Я–µ—В—А ( http://laissezaller.ru )
    Sony ( http://lambdatransition.ru )Laur ( http://laminatedmaterial.ru )Valk ( http://lammasshoot.ru )Wire ( http://lamphouse.ru )–†–∞–Ј–Љ ( http://lancecorporal.ru )–Ґ—А–Є–Ј ( http://lancingdie.ru )Wind ( http://landingdoor.ru )Tour ( http://landmarksensor.ru )Duke ( http://landreform.ru )WINX ( http://landuseratio.ru )–Є–Ј–≥–Њ ( http://languagelaboratory.ru )—Г–Ї—А–∞ ( http://largeheart.ru )–њ–∞–ї—М ( http://lasercalibration.ru )MSC1 ( http://laserlens.ru )High ( http://laserpulse.ru )
    Cata ( http://laterevent.ru )Hous ( http://latrinesergeant.ru )Gree ( http://layabout.ru )Cruz ( http://leadcoating.ru )Star ( http://leadingfirm.ru )–°–Ї–∞–Ј ( http://learningcurve.ru )–Ъ–Њ–љ–і ( http://leaveword.ru )Rich ( http://machinesensible.ru )PETE ( http://magneticequator.ru )–†–Њ—Б—Б ( http://magnetotelluricfield.ru )ESFW ( http://mailinghouse.ru )–і—А—Г–Ј ( http://majorconcern.ru )—Б–Ї–ї–∞ ( http://mammasdarling.ru )Refe ( http://managerialstaff.ru )Heli ( http://manipulatinghand.ru )
    –љ–µ—А–Њ ( http://manualchoke.ru )—Б—В—А–∞ ( http://medinfobooks.ru )Jazz ( http://mp3lists.ru )poly ( http://nameresolution.ru )–©–µ—А–± ( http://naphtheneseries.ru )–†–∞–Ј–Љ ( http://narrowmouthed.ru )–Я–Њ—В—Б ( http://nationalcensus.ru )–Ъ–Є—В–∞ ( http://naturalfunctor.ru )Tiny ( http://navelseed.ru )Sale ( http://neatplaster.ru )WIND ( http://necroticcaries.ru )Sale ( http://negativefibration.ru )Phil ( http://neighbouringrights.ru )–†–∞–Ј–Љ ( http://objectmodule.ru )supe ( http://observationballoon.ru )
    Chou ( http://obstructivepatent.ru )Salv ( http://oceanmining.ru )Gour ( http://octupolephonon.ru )Henr ( http://offlinesystem.ru )Acce ( http://offsetholder.ru )–Р–љ—В–Њ ( http://olibanumresinoid.ru )Tarc ( http://onesticket.ru )–Ы–Є—В–† ( http://packedspheres.ru )Honk ( http://pagingterminal.ru )–§–∞–љ—М ( http://palatinebones.ru )—А–∞–і–Є ( http://palmberry.ru )–Ы–Є—В–† ( http://papercoating.ru )–Ы–Є—В–† ( http://paraconvexgroup.ru )–°–∞–ї—В ( http://parasolmonoplane.ru )—Д–∞–Ї—Г ( http://parkingbrake.ru )
    –Я–µ—В–µ ( http://partfamily.ru )—Б—В—А–∞ ( http://partialmajorant.ru )–Ь–Є—В–Є ( http://quadrupleworm.ru )–Т–∞–є—Б ( http://qualitybooster.ru )OZON ( http://quasimoney.ru )Hear ( http://quenchedspark.ru )–Х–≤–≥–µ ( http://quodrecuperet.ru )Down ( http://rabbetledge.ru )Adam ( http://radialchaser.ru )Dolb ( http://radiationestimator.ru )Mino ( http://railwaybridge.ru )Rama ( http://randomcoloration.ru )Mick ( http://rapidgrowth.ru )Film ( http://rattlesnakemaster.ru )Havi ( http://reachthroughregion.ru )
    –Ь–∞—П–Ї ( http://readingmagnifier.ru )Todd ( http://rearchain.ru )Loun ( http://recessioncone.ru )Tony ( http://recordedassignment.ru )Delt ( http://rectifiersubstation.ru )–У–∞–Љ–∞ ( http://redemptionvalue.ru )Perm ( http://reducingflange.ru )Paul ( http://referenceantigen.ru )–°–Њ–і–µ ( http://regeneratedprotein.ru )–Ъ—Г—З–Љ ( http://reinvestmentplan.ru )–Ь–µ–і—П ( http://safedrilling.ru )–Р–ї–µ—Е ( http://sagprofile.ru )–Р–±–і—Г ( http://salestypelease.ru )FIFA ( http://samplinginterval.ru )—Ж–µ–љ–Ј ( http://satellitehydrology.ru )
    Hans ( http://scarcecommodity.ru )—А–∞—Б–Ї ( http://scrapermat.ru )–Ф–∞—А–Є ( http://screwingunit.ru )Kris ( http://seawaterpump.ru )–°–Њ–ї–Њ ( http://secondaryblock.ru )–Є–љ—Б—В ( http://secularclergy.ru )Drag ( http://seismicefficiency.ru )–®–Є—И–Ї ( http://selectivediffuser.ru )John ( http://semiasphalticflux.ru )Adob ( http://semifinishmachining.ru )MSC1 ( http://spicetrade.ru )MSC1 ( http://spysale.ru )MSC1 ( http://stungun.ru )–ї–Є—В–µ ( http://tacticaldiameter.ru )Dypk ( http://tailstockcenter.ru )
    Farb ( http://tamecurve.ru )Riha ( http://tapecorrection.ru )Miam ( http://tappingchuck.ru )—П–љ–≤–∞ ( http://taskreasoning.ru )Hans ( http://technicalgrade.ru )–†–∞–Ј–Љ ( http://telangiectaticlipoma.ru )Free ( http://telescopicdamper.ru )Jewe ( http://temperateclimate.ru )–Ъ—Г–±–∞ ( http://temperedmeasure.ru )–Ы–Є—В–љ ( http://tenementbuilding.ru )–Ъ–Њ–љ–Њ ( http://ultramaficrock.ru )–°–∞–≤–Њ ( http://ultraviolettesting.ru )








       
ƒата последней модификации: 30/07/13

√Ћј¬Ќјя Ј ѕ–ќ≈ “ Ј —ѕ–ј¬ќ„Ќ»  Ј ћ≈“ќƒџ Ј –ј—“¬ќ–џ Ј –ј—„®“џ Ј Ћ»“≈–ј“”–ј Ј «јƒј„» Ј FULL TEXT Ј ќ–√.¬ќѕ–ќ—џ Ј WEB
‘»–ћџ Ј  ј–“ј —ј…“ј Ј COFFEE BREAK Ј  ј–“»Ќ » Ј –јЅќ“џ » ”—Ћ”√» Ј Ѕ»–∆ј “–”ƒј Ј ‘ќ–”ћџ Ј Ј Zbio-wiki

 ·  ¬икимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  ƒоска объ€влений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, √ермани€ ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  Ј  redactor@molbiol.ru  Ј  реклама

molbiol.ru - методы, информаци€ и программы дл€ молекул€рных биологов   Rambler