Главная страница MolBiol.ru > Методы > Бактерии > Электрокомпетентные клетки Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Электропорация

Электропорация позволяет получить максимально возможную в настоящее время компетентность клеток. Процедура очень быстрая и удобная, но, к сожалению, относительно дорогая. Основное неудобство – требуется очищенный препарат DNA (с неочищенными либо проскакивает искра, либо компетентность становится даже ниже, чем у "обычных" химически компетентных клеток).

    Приготовление электрокомпетентных клеток

  1. снять петлей с чашки с соответствующим селективным антибиотиком несколько (5-20) колоний, поместить в 500ml YENB в 2L колбе;
  2. 200-300rpm, ~8h 37oС, качать до OD600=0.7 (годится диапазон 0.5-1.0);
  3. все дальнейшие манипуляции проводить на холоду (заранее охладить до 0oС H2O mQ и 10% glycerol):

  4. охладить: 0oС, ~5';
  5. ЦФ 7' 4.5krpm, слить жидкость, дополнительно ЦФ 5'' 3krpm;
  6. 2х промыть 100ml H2OmQ (ЦФ 7' 4.5krpm, слить жидкость, дополнительно ЦФ 5'' 3krpm);
  7. промыть 20ml 10% glycerol;
  8. добавить объем 10% glycerol, равный объему клеток (должно получиться ~0.7-2.0ml суспензии), ресуспензировать;
  9. аликвотить (одна aликвота на электропорацию 40µl, поэтому объём аликвоты должен быть кратен 40 µl), заморозить в жидком азоте;
  10. хранить при -70oС.


  11. Обработка лигазной смеси

  12. после завершения лигирования инактивировать T4 лигазу: 70oC, 10';
  13. диализ (~20µl) на 0.025µm мембране (блестящая сторона вверх) против 30-200ml (0.1х ТЕ) 1h, 4oC;
  14. перенести в новую пробирку;
  15. 1µl на электропорацию (в соответствии с инструкцией к прибору);


  16. Электропорация с помощью ячеек Bio-Rad

  17. ячейку заранее остудить во льду (~5-10');
  18. оттаять необходимое количество клеток во льду. Когда оттают - смешать типчиком не пипетируя;
  19. к аликвоте DNA (в охлажденной пробирке) добавить 40µl компетентных клеток;
  20. смешать типчиком (но не пипетировать!);
  21. перенести в ячейку электропоратора;
  22. параметры электропорации: 1.8 kV, 25µF, 200 Ом, зазор ячейки 0.1cm (у нас получалось время импульса 3.9-4.6ms);
  23. после импульса вымыть клетки из ячейки 1ml SOC (потребуется пипетировать 2-3 раза);
  24. перенести в 15ml пластиковую пробирку, качать ~30' 37oC;


  25. Приготовление библиотеки

  26. + 1ml SOC/20% глицерол, смешать;
  27. 20µl высеять на определение титра, все остальное расфасовать по 200µl в подписанные пробирки и быстро заморозить в жидком азоте;
  28. хранить при -70oС.


  29. MolBiol.ru: http://molbiol.ru
    e-mail: redactor@molbiol.ru
    просмотров: 24290

    Растворы

    YENB

    (pH 7.5):

    Конц.Сток0.45 L0.5 L0.9 L1.0 L
    Бакто-дрож. экст.0.75%тв.3.4g3.75g6.75g7.5g
    Nutrient Broth0.8%тв.3.6g4.0g7.2g8.0g
    NaOH 10N~243 µl~270 µl~490 µl~540 µl


    Комментарии

    Общие

  • Мы получали компетентность
  • ~7x108 (BMH71-18mutS),
    ~1.5x109 (XL1-Blue).

  • Если при электропорировании в ячейке проскакивает искра, это не означает наверняка, что лигазная смесь или клетки плохого качества. Мы не можем дать этому вразумительного объяснения, но часто достаточно повторить электропорирование с той же лигазной смесью и тем же лотом клеток, чтобы все было хорошо.
  • Химически компетентные клетки можно трансформировать неочищенной лигазной смесью (и вообще DNA, находящейся в умеренно солевом буфере). В случае электрокомпетентных - DNA должна быть очищена, т.к.:
    1. слишком высокая концентрация соли способна вызвать искровой разряд в ячейке;
    2. при электротрансформации в оболочке E. coli появляются дырки, в них может проникнуть фермент, используемый для лигирования.

    От соли обычно можно избавиться микродиализом. Самый простой способ избавиться от фермента - нагрев (но в случае топоизомеразы {кит от Invitrogen} он не помогает).

  • Количество клеток в электрокомпетентной фасовке значительно больше, чем в химически-компетентных, поэтому не стоит пытаться высевать на одну чашку слишком большую долю фасовки. Это чревато подростом (появлением сателлитных колоний) и снижением компетентности.


  • По пунктам

    п.1.

  • Число колоний зависит от их размера.
  • Среда YENB - бессолевая. Это упрощает отмывку бактерий при приготовлении электрокомпетентных клеток.
  • п.10.

  • Инактивация лигазу увеличивает эффективность трансформации в ~10 раз, диализ - еще в ~50 раз.
  • Если такой мембраны нет, лигазную смесь можно легко обессолить в лунке, полученной при застывании 1.5% агарозы (в 100mM glucose) в 1.5ml микроцентрифужной пробирке со вставленным в неё желтым типчиком (чтобы образовалась ячейка объёмом 30-100 µl). Обессоливание проходит ~90' на 4oС.
  • п.11.

  • Мембрана: (Millipore MF, VSWP01300). Подчеркнутые цифры обозначают диаметр мембраны в mm. Более крупные мембраны относительно дешевле. Для диализа можно брать не целую мембрану, а разрезать ее на кусочки - лишь бы умещалась капля лигазной смеси.
  • п.22.

  • Мы добавляем глицерин как 20% раствор, т.к.
    1. при этом проще измерять его объем;
    2. нам кажется, что эта процедура мягче (меньше повреждает бактерии), чем добавление 100% глицерина.

    п.23.

  • На пробирках должно быть название библиотеки и дата изготовления. Лучше, если после определения титра Вы не поленитесь прилепить к пробиркам ещё и титр.
  • Замораживание в жидком азоте (вопреки широко распространенному мнению) совершенно не изменяет титр библиотеки (по крайней мере, для штамма DH10B).
  • Для определении компетентности взять 2µl 5ng/ml pDNA, высеять 10µl (+ 40µl SOC, чтобы легче растирать на чашке). Если выросло N колоний => компетентность Nx107(колоний/µg).


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/



    Дополнение от Веремейко Татьяны (veremeiko@ngs.ru)
    ГНЦ ВБ "Вектор", НИИ биоинженерии.

    Клетки можно готовить каждый раз перед употреблением, это бывает удобно, когда используешь метод редко или нет возможности замораживать на -70oС.


  1. вырастить бактериальную культуру на качалке до D600 = 0.5, среда LB;
  2. ЦФ 1-1.5ml культуры, 6 krpm, 2';

  3. --- все манипуляции проводить во льду! ---
  4. супернатант слить, добавить 800µl деионизованной H2O, осторожно ресуспендировать осадок;
  5. ЦФ 6krpm, 1-2';
  6. повторить промывку еще 5 раз;
  7. осадок клеток после последней промывки ресуспендировать в 200µl 10% глицерина (раствор глицерина на деионизованной H2O);
  8. ЦФ 6 krpm, 1';
  9. осадок ресуспендировать в 40µl 10% глицерина;
  10. клетки готовы к трансформации: раствор ДНК вносят в обьеме <1µl, дальше по инструкции к электропоратору.
    Примечания:
  • Метод электропорации дает эффективность трансформации 108-1010 µg-1, однако это как хорошо, так и плохо. Велика вероятность заноса посторонней плазмиды. Поэтому для работы необходимо использовать только новый пластик (к сожалению, многие наши лаборатории вынуждены использовать пластик многократно, но на эту методику жалеть новый пластик нельзя), желательны чистые пипетки, которые не используются для других работ, а если такой возможности нет, необходима тщательная очистка пипеток перед работой. Но, несмотря на все предосторожности, занос других плазмид все равно бывает, поэтому полученные клоны необходимо проверять.
  • Метод электропорации удобен, когда плазмидной ДНК для трансформации очень мало или эффективность трансформации ожидается очень низкой. Например, если система рестрикции-модификации различна у штамма - донора (штамм, в котором нарабатывалась ДНК) и штамма - реципиента, то эффективность трансформации понижается в тысячу и более раз.
  • Главное в методике - безусловная чистота воды и глицерина. H2O - деионизованная, глицерин высокого качества (например, ICN). Раствор ДНК тоже не должен содержать много солей, если не уверены, лучше переосадить этанолом, промыть 70% этанолом и растворить в деионизованной H2O. Вспышка при прохождении заряда и время прохождения импульса ниже 3.9ms (E.coli) говорят о наличии большого количества солей в растворах, или лизисе клеток, если они перегреты.
  • Кюветы для электропорации можно использовать несколько раз. Очистка: после работы многократно промыть дистилярованной водой, один раз хромпиком, затем снова многократно дистилярованной водой и 3-4 раза деионизованной. Высушить под ультрафиолетовой лампой.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    _DmitriM_ /11.01.2006 20:06/
    Я получал клетки вплоть до 10^11. Методика такая же, как описано, но клетки растил до OD600 = 0.4 - 0.5, и на 500 мл культуры делал промывку охлажденной до 4 С MilliQ 3 раза по 500 мл. Потом 3 раза по 150 мл 10% глицерола. Промывка действительно играет большую роль.
    Чтобы уменьшить вероятность проскока при электропорации, ДНК должна быть очень чистой, но кроме того, клетки и ДНК надо несколько раз аккуратно перемешать пипетманом.



    _Фома_ /11.01.2006 21:08/
    Искра "без причин", т.е. при нормальных клетках и чистой ДНК, проскакивает обычно в старых кюветах и, как правило, в одних и тех же. Если в кювете случился пробой, её лучше выкинуть.



    Гость /29.11.2006 15:07/
    А вот у меня конкретный вопрос, люди, если делали, пделитесь опытом, в работе с культурами с плохопроницаемой клеточной стенкой (микобактерии, родококки est.), каких параметров выращивания клеток следует придерживаться, чтобы получить максимально компетентные клетки???



    Andrey N /02.12.2006 17:23/
    Что касается Rhodococcus --- очень важный вопрос: был ли вообще хоть какойт-то результат от порации при соблюдении всех ньюансов и правил; уверены ли Вы, что эта плазмида точно поддерживается в данном штамме?
    Если ответ - однозначно нет, то оставте попытки,- переносите коньюгацией!



    Phila /05.12.2006 21:37/
    Сколько ни пыталась делать электропорацию - клетки потом ведут себя неадекватно или вовсе дохнут



    guest: Andrey N /06.12.2006 17:43/
    ---- Сколько ни пыталась делать электропорацию - клетки потом ведут себя неадекватно ----

    А как это?? smile.gif



    Гость /11.12.2007 02:02/
    Я приготовлял электрокомпетентные клетки из DB3.1 штамма, устойчивому к токсичным эффектам ccdB гена (Invitrogen).
    В результате после трансформации на семи высеянных чашках выросла только одна колония.
    Скажите, возможно ли что данный штамм вовсе не пригоден для приготовления электрокомпетентных клеток?



    studstud /17.09.2008 15:28/
    Трансформирую 2 мкл (ок. 300 нг) E.coli DH5-alpha плазмидой (fusion pBBR and pME), время импульса ок. 4,4 - 4,5 мс в 0,1 см кювете и либо вообше нет трансформантов, либо всего ок. 200. Одно "но" - глицерол беру 85% аптечный и разбавляю деионизатом. В чем причина??? Еще вопрос - можно ресуспендироват комп. клетки при приготовлении пипетированием?



    Гость /09.12.2008 03:24/
    Я ресуспендировал сначала синим типом, а потом аликвотил желтым. Не рекумендуется пипетировать клетки излишне только в процессе самой электропрорации, так как это может увеличить вероятность проскока искры в кювете.



    guest: Гость /09.12.2008 13:40/
    Рекомендую купить новые кюветы. Алмабион пока держит старую цену, но обещает поднять с нового года: http://www.almabion.ru/kuveti.htm ( http://www.almabion.ru/kuveti.htm )



    guest: Гость /11.06.2009 14:44/
    Кто-нибудь использует прямоугольные импульсы для порации E.coli?








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler