Главная страница MolBiol.ru > Методы > Бактерии > Химически компетентные клетки Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Быстрое приготовление компетентных клеток

Носков Кирилл

    Приготовление компетентных клеток

  1. со стока (-70oC) рассеять бактерии петлёй на пробирку с LB;
  2. выращивать 37oC, ON, интенсивно встряхивать (200-300rpm);
  3. пересеять ночную культуру 1:100 на жидкую среду LB, содержащую дополнительно 20mM глюкозу и 10mM MgCl2, и растить при 37oC и интенсивном встряхивании (200-300rpm) до OD600= 0.30 ÷ 0.35.

  4. все дальнейшие манипуляции проводить на холоду
  5. поместить в пробирку эппендорф 1ml культуры;
  6. 0oC, 5-10';
  7. ЦФ 3.5÷4.0 kg 4oC, 5', слить супернатант;
  8. ЦФ 3.5÷4.0 kg 4oC, 20'', тщательно удалить остатки жидкости;
  9. ресуспензировать в 12µl LB, содержащего 20mM глюкозу и 10mM MgCl2;
  10. добавить 13µl 2xTSS, несколько раз пипетировать;
  11. заморозить (в сухом льду/этаноле или жидком азоте), хранить в на -70oC;

Контрольная трансформация

  1. оттаять во льду аликвоту компетентных клеток;
  2. добавить ~1µl (10-100ng) pDNA, 2-3 раза аккуратно пипетировать;
  3. 0oC, 10-15';
  4. 42-43oC, 30'', без встряхивания;
  5. сразу в лед, 2';
  6. + 1 ml LB; 37oC, 40-60';
  7. ЦФ 3.5-4.0 kg 4oC, 5', слить супернатант не очень тщательно, ресуспензировать клетки и высеять 1/10 на одну чашку с антибиотиком, 9/10 на другую.

Реальная трансформация

  1. аналогично "контрольной";
  2. на одну аликвоту можно брать pDNA в объёме до 4µl;
  3. высев - в зависимости от задачи;


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 16030

    Растворы

    2xTSS

    (готовить аликвотами по 1-2ml; хранить при -20oС в течении минимум года)


    LB, содержащий 50mM MgCl2 и 20% 3000 PEG (полиэтиленгликоль). Удобно приготовить 2х кратный LB и 40% ПЭГ, и смешать их один к одному. Добавить DMSO до 10%, хорошо перемешать. Простерилизовать фильтрованием через мембрану, размер пор 0.4-0.45nm.



    Комментарии

    Общие

  • Источник: Chung CT, Niemela SL, Miller RH. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc Natl Acad Sci USA. 1989; 86(7):2172-5. Есть на PubMedCentral.
  • Компетентность должна быть не ниже 106 (1/µg).

    Дополнения, комментарии, вопросы





       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler