Главная страница MolBiol.ru > Методы > Плазмиды > Минипреп - лизис щелочью Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Выделение pDNA (минипреп - лизис щелочью)

Лучший метод для получения pDNA высокого качества (годится даже для трансфекции). Его преимущества:
- очень низкая цена,
- высокая скорость (сравнима только с Qiaprep spin).
  1. растить ночную культуру 16-24 часа в богатой среде: 37oС, 200-300rpm;
  2. 1.5ml ночной культуры поместить в 1.7ml пробирку, ЦФ 30'', удалить супер;
  3. п.2. - ещё 2 раза;
  4. ЦФ 10'' дополнительно, отсосать остатки среды;
  5. ресуспензировать осадок в 200µl раствора "I", вортекс 5'';
  6. NT, 5';
  7. + 400µl раствора "II", резко вылить, сразу же резко встряхнуть, перевернуть ~5 раз;
  8. 0oС , 5' (не больше!!!);
  9. + 200µl холодного 10М AcONH4, ~5 раз перевернуть;
  10. 0oС, 5';
  11. ЦФ NT, 5';
  12. супер перенести в пробирку с 500µl изопропанола, смешать;
  13. NT, 10';
  14. ЦФ NT, 10', сбросить супер;
  15. ЦФ NT, 0.5-1', сбросить остатки изопропанола (не подсушивать);
  16. + 100µl 2М AcONH4, вортекс 20'';
  17. NT, 5';
  18. ЦФ NT, 5', перенести супер в пробирку со 100µl изопропанола;
  19. NT, 10';
  20. ЦФ NT, 10';
  21. сполоснуть осадок 70% EtOH (~200µl), подсушить.
  22. не обязательно:

    21a. + 75µl "ТЕ + RNaseA";
    21b. 37oC, 15';
    21c. + 25µl 10М AcONH4, + 100µl изопропанола;
    21d. NT, 10';
    21e. ЦФ NT, 10';

  23. растворить в 25µl (H20 или TE).


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 34581

    Растворы

    I плазмидный раствор

    для N пробирок V=0.2хN [ml] (хранить при +4oС)

    Конц.Сток50ml100ml150ml200ml
    Глюкоза50mM2M 1.25ml
    1.41g
    2.5ml
    2.825g
    3.75ml
    4.24g
    5.0ml
    5.65g

    Tris Cl, pH 8.025mM1.0 M1.25ml2.5ml3.75ml5.0ml
    EDTA10mM0.5 M1.0ml2.0ml3.0ml4.0ml
    H2O mQ46.5ml93ml139.5ml186ml

    optional: перед использованием добавить лизоцим до 5 mg/ml
    для N пробирок m(лизоцима)=N[mg]

    II плазмидный раствор

    (готовить перед использованием или хранить при NT в плотно закрытой пластиковой посуде)

    Конц.Сток0.5ml1ml2.5ml5.0ml6.5ml8.5ml11ml
    NaOH0.2N1N0.1ml0.2ml0.5ml1.0ml1.3ml1.7ml2.2ml
    SDS1%10%0.05ml0.1ml0.25ml0.5ml0.65ml0.85ml1.1ml
    H2O mQ0.350ml0.7ml1.75ml3.5ml4.55ml5. 95ml7.7ml
    Число пробирок:12612162026

    для N пробирок V=0.4хN [ml]

    TE+RNaseA

    TE + RNase A 50µg/ml (стоковый раствор 10µg/µl: 5µl на 1ml TE)



    Комментарии

    Общие

  • Источник: Lee SY, Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA. Biotechniques. 1990 Dec; 9(6):676-9.
  • в случае большого количества плазмид работу можно значительно ускорить, подготовив заранее 3 набора подписанных пробирок:
  • 1.7-2.0ml пустые (для п. 2),
    1.7ml с 0.5ml изопропанола (для п. 12),
    0.5ml с 0.1ml изопропанола (для п.18).

  • Ограничение: метод "не любит" плазмиды со строгим контролем (низкокопийные). Сильно снижается выход и качество. В этом случае начиная с п.11 лучше пользоваться фенольной очисткой. Низкокопийные плазмиды в настоящее время чаще всего встречаются в двух "экологических нишах": старые генно-инженерные конструкции в векторе pBR322 и вектора (конструкции) для экспрессии белков.
  • "II плазмидный раствор" Во многих протоколах подчеркивается, что этот реактив должен быть свежеприготовленным. Это не обязательно. Важно только, что бы в процессе хранения CO2 из воздуха не нейтрализовал NaOH => посудина должна быть с плотно завинчивающейся крышкой, и лучше пластиковой (стекло растворяется в щелочи).


  • По пунктам

    п. 1.

  • Дополнение: для выкалывания бактериальных колоний и старта минипрепов можно выкалывать колонии 200µl типами и отстреливать их сразу в пробирки со средой - экономит время и стерильно (меньше возни, чем с зубочистками).
    Александр Чубыкин.
  • п. 6.

  • Это время необходимо для работы лизоцима. Если лизоцим не добавлен, можно сразу переходить к п.7.
  • п. 7.

  • Лизис бактерий и щелочная денатурация DNA. Нужно постараться как можно меньше раздробить геномную DNA на этом этапе, иначе возникнут проблемы с ее осаждением в п.11.
  • Требования, предъявляемые в п.7, противоречивы. Для того, чтобы получить полный лизис, требуется хорошо смешать бактериальную суспензию с раствором "II", однако, интенсивное смешивание грозит дроблением геномной DNA. Мы поступаем следующим образом:
  • 7.1.    непосредственно перед внесением (<1') раствора "II" вновь взболтать суспензию бактерий: вортекс - 2-4'';
    7.2.    не касаясь пробирки типом быстро внести 400µl раствора "II"; сразу же закрыть пробирку; резко встряхнуть 2-3 раза. Для того, чтобы прошел лизис требуется ~2''. надо уложиться со встряхиванием в это время;
    7.3.    через ~1' медленно перевернуть пробирку 2-3 раза.

    п. 8.

  • Превышение времени денатурации чревато тем, что плазмида денатурирует необратимо - одно кольцо сдвинется относительно другого так далеко, что достигнет локально устойчивого состояния. Необратимо денатурированные плазмиды вполне годятся для сиквенса, но не режутся рестриктазами и обладают аномальной подвижностью на электрофорезе.
  • Необратимо денатурированная плазмида

    п. 9.

  • Нейтрализация раствора.
  • Геномная DNA случайно регибридизуется образуя большие сети, кольцевая pDNA благополучно ренатурирует. Белки с SDS агрегируют при высокой концентрации соли (на холоду это получается лучше).
  • Важно, чтобы нейтрализация была полной и не осталось областей с вязким раствором. Нужно смешивать раствор вначале мягко, чтобы не дробить геномную DNA, но после того как она уже ассоциирует (через ~1'), ничто не мешает встряхнуть посильнее. Однако, всё же не на вортексе.
  • п. 10.

  • Можно прерваться (+4oC, несколько суток).
  • п. 12.

  • В этой методике можно прерваться при любом осаждении нуклеиновых кислот после добавления спирта (-20oC, любое время).
  • п. 15.

  • В этом месте важно работать быстро и аккуратно, так как pDNA будет плохо растворяться если оставить много изопропанола или пересушить осадок.
  • п. 16.

  • Устранение большей части рибосомной RNA. В высокой соли одноцепочечная RNA образует большие ассоциаты (может быть за счет случайной гибридизации) и не растворяется. Однако tRNA (видимо, из-за легкости образования внутримолекулярных двухцепочечных участков) сравнительно легко растворяется в высокой соли. Если требуется устранить и её, нужно выполнить п.п. 21a-e.
  • В этом месте важно работать быстро и аккуратно, так как pDNA будет плохо растворяться если оставить много изопропанола или пересушить осадок.
  • п. 21.

  • Отмывка от изопропанола.
  • п. 21a-e.

  • Расщепление tRNA и остатков рибосомной RNA.
  • Важно, иметь в виду, что рибонуклеотидтрифосфаты, образующиеся после расщепления RNase вполне способны выпасть в осадок вместе с плазмидной DNA и выдержать споласкивание 70% EtOH. => измерять концентрацию pDNA с помощью спектрофотометра дело опасное даже после обработки RNase.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы

    Gosh /27.09.2006 14:50/
    У меня вопрос, будет ли данный BAC пригоден для субклонирования?



    Гость /27.09.2006 16:44/
    Объясните, пожалуйста, в каких случаях ДНК лучше растворять в воде, а к каких - в ТЕ?



    guest: ммм /27.09.2006 19:21/
    Вода, если недолгое хранение, но главное, с последующими реакциям в магниевых буферах, ТЕ если на длительное хранение или какая проба форезная для многоразового использвания и тд.



    Гость /17.10.2006 07:03/
    скажите, пожалуйста, при каком g или rpm центрифугировать?



    guest: ммм /17.10.2006 09:13/
    ---скажите, пожалуйста, при каком g или rpm центрифугировать?

    Какой материал или на какой стадии выделения плазмиды, уточните.



    curious67 /17.10.2006 10:23/
    (guest: ммм @ 27.09.2006 20:21)
    Ссылка на исходное сообщение  Вода, если недолгое хранение, но главное, с последующими реакциям в магниевых буферах, ТЕ если на длительное хранение или какая проба форезная для многоразового использвания и тд.

    вообще, старайтесь избегать использования ЕДТА, т.е. вместо ТЕ используйте просто 5-10 мМ Трис, и никакой воды. Трис нейтрального рН предотвратит гидролиз ЛНК, и ничему не помешает. А ЕДТА- это пережиток старых времен, когда Mg очень боялись, сейчас вроде методы поячище стали (а вот руки 0 нет, да...)



    Гость /17.10.2006 11:38/
    меня интересует какое g или rpm на всех стадиях, в приведенной методике ни для одной стадии это не указано.



    curious67 /17.10.2006 12:14/
    все просто, если подумать головой, при этом интервалы g сильно варьируют без видимых различий в результате. Так вот- клетки- чтобы не полопались, надо крутить не более 3-5 тыс об., осветление лизата- макс, тут ничего не испортишь, равно как и все последующие стадии- 10-12 тыс. Меньше- ДНК садится хуже, что очевидно. Избегаите охлаждения- на выход ДНК не влияет, а вот соли попадают лишние



    Гость /17.10.2006 13:23/
    спасибо! постараюсь подумать головой:)



    Гость /18.10.2006 10:27/
    Скажите, пожалуйста, для чего добавляется AcONH4.



    Гость /18.10.2006 10:30/
    что такое ТЕ?



    curious67 /18.10.2006 10:42/
    вот AcONH4 не надо, следы аммония ингибируют например, лигазу. воспользуйтесь ацетатом калия. Вообще, это соли, которые спрособствуют высаживанию ДНК из спиртовых растворов. А ТЕ- ну, почитайте в конце концов



    Гость /18.10.2006 11:21/
    Скажите, пожалуйста, у меня плазмида pCMV-Tag2 для экпрессии белка. После стадии 14 (после центрифугирования с изопропанолом) образуется осадок, который в дальнейшем не растворяется в воде.



    curious67 /18.10.2006 13:51/
    е-мое, что за степ 14 и сколько их всего? Конкретно Вашей методы не видел, но они все об одном, различия в деталях. Осадок не растворяется по тому, скорее всего, сто это и не может раствориться- дебрис небось прихватили после осветления раствора после добавления ацетатного буфера. Не растраивайтесь, ДНК-то растворилась, посмотрите на форезеб а нерастворимое дерьмо выкиньте в педальное велдро



    Гость /18.10.2006 13:57/
    большое спасибо! вроде разобрался.



    curious67 /18.10.2006 14:34/
    если дальше будут вопросы- пишите в личку или майл, так проще



    green mouse /18.10.2006 19:43/
    Мне больше нравится лизис кипячением. по маниатису. там только один тонкий момент - в кипяток надо опускать СРАЗУ после добавления лизоцима и держать 40 секунд



    curious67 /19.10.2006 10:11/
    чтоб лизоцим поскорее сдох?-тогда зачем егл вллбще добавлять?



    green mouse /20.10.2006 18:36/
    все что надо он лизирует за несколько секунд. это же минипреп. а если не добавлять, то клетки не полопаются при кипячении, если передержать, то геномная днк тоже выделится.
    главное, плазмида, так выделенная, всегда ярко светится на форезе. надо будет методику выложить shuffle.gif



    Guest /21.10.2006 12:50/
    Я думал, яркость свечения на форезе зависит исключительно от количества пДНК, а не от метода, которым ее выделяли...



    Guest /21.10.2006 21:45/
    (green mouse @ 18.10.2006 19:43)
    Ссылка на исходное сообщение  Мне больше нравится лизис кипячением. по маниатису. там только один тонкий момент - в кипяток надо опускать СРАЗУ после добавления лизоцима и держать 40 секунд


    мне больше нравится выделять квайджиновским китом wink.gif
    хотя промеговским или сигмовским тоже неплохо было smile.gif



    curious67 /21.10.2006 23:43/
    еще Клонтеховкий неплох. Да все это одно и тоже, народ, о чем спорить? Я вот, не беру в руки лизоцим уже...лет эдак 10. И кто бы мне сказал, что плазмида плоха, не режется или не секвенируется, или еще что. А некоторые делают еще как-то. При этом жизнь все равно как-то идет вперед



    Guest /22.10.2006 00:49/
    (Guest @ 21.10.2006 21:45)
    Ссылка на исходное сообщение  мне больше нравится выделять квайджиновским китом wink.gif
    хотя промеговским или сигмовским тоже неплохо было smile.gif

    А скажите, у вас хорошо хранится ДНК, выделенная китами? У меня почему-то хранится значительно хуже, чем выделенная ручками с солями; через полгода-год многие препараты, выделенные китами, выглядят развалившимися на форезе, или после рестрикции выглядят как сплошной шмер.
    Как у вас с этим?



    Atropos /22.10.2006 23:58/
    (curious67 @ 18.10.2006 11:42)
    Ссылка на исходное сообщение  вот AcONH4 не надо, следы аммония ингибируют например, лигазу

    А зачем pDNA лигазить или киназить? confused.gif

    Да и вообще лигазу он похоже не ингибирует, USB, например, пишут:
    Inhibitors: Na (>0.2M), K (>0.2M)



    Atropos /23.10.2006 00:17/
    (Guest @ 21.10.2006 22:45)
    Ссылка на исходное сообщение  мне больше нравится выделять квайджиновским китом wink.gif
    хотя промеговским или сигмовским тоже неплохо было smile.gif

    У Эппендорфа и Сигмы так вообще есть пятиминутные киты. smile.gif Прогресс идёт. smile.gif



    curious67 /23.10.2006 13:09/
    что пишет USB, я не знаю, кладу только те ионы, которые встретятся потом в буферах для всяких реакций- логично? Тем более, что трезультат будет тем же.
    А что до хранения- не замечал, чаще всего плазмида идет на сиквенс, два дня, а дальше может, и не надо будет. Словом, тут ничего сказать не могу, но жалоб пока не было (от вторичных пользователей моих плазмид, к примеру)



    green mouse /23.10.2006 19:13/
    (Guest @ 21.10.2006 13:50)
    Ссылка на исходное сообщение  Я думал, яркость свечения на форезе зависит исключительно от количества пДНК, а не от метода, которым ее выделяли...

    я сначала тоже так думала, а потом мне кто-то сказал, что минипрепом оно столько не выделяется shuffle.gif



    green mouse /23.10.2006 19:17/
    (curious67 @ 22.10.2006 00:43)
    Ссылка на исходное сообщение  еще Клонтеховкий неплох. Да все это одно и тоже, народ, о чем спорить? Я вот, не беру в руки лизоцим уже...лет эдак 10. И кто бы мне сказал, что плазмида плоха, не режется или не секвенируется, или еще что. А некоторые делают еще как-то. При этом жизнь все равно как-то идет вперед
    дайте денег! wall.gif дайте мне много денег! wall.gif



    curious67 /24.10.2006 09:59/
    на самом деле денег не надо (то есть, конечно , всегда надо, но обсуждается не это) для успешного выделения плазмид, все отлично делается вручную, за копейки, и по времени не сильно отличается. Единственно, что если у Вас большой поток, то киты спасают, а если штуки до 20 примерно, то глобальной разницы нет. Да, и учтите, что вручную всегда больше выход ДНК



    Atropos /01.11.2006 11:26/
    Интересно, а что такое нужно в 3-й раствор добавить, чтобы осадок после нейтрализации/ЦФ всегда был маленьким компактным как в QIAprep Miniprep? Это из-за хаотропной соли?

    P. S.
    В итоге пришёл к выводу, что нужно просто посильнее/посмелее трясти при перемешивании и перед ЦФ. =)



    curious67 /01.11.2006 11:31/
    3-й раствор- это всегда либо ацетат (калия), либо гуанидин изотиоцианат сам по себе (редко) или в смеси с тем же ацетатом. В ручном выделении- просто ацетат, так что добавление хаотропов как раз и дает более компактный осадок



    Alexkiev /27.07.2007 17:32/
    Скажите пожалуйста, а что если я делал по такому же принципу, без колонок, но раньше не проделывал дважды пункты с КАс и изопропанолом? От этого что-либо меняется? Изменяться ли результаты последующего за этим фореза, имею виду неточности??? Особенно, если я потом буду резать данную плазмиду и пускать на ПЦР???



    guest: Студент /10.08.2007 18:03/
    Уважаемые молекулярные биологи, скажите пожалуйста, можно ли останавливать процесс выделения плазмидной ДНК в данной методике в пункте 16:
    « 1. + 100µl 2М AcONH4, вортекс 20'';
    2. NT, 5'; »
    «Устранение большей части рибосомной RNA. В высокой соли одноцепочечная RNA образует большие ассоциаты (может быть за счет случайной гибридизации) и не растворяется.»

    Убрать образцы на -20 и продолжить выделение на следующий день. :confused:

    А то я сначала сделал, потом подумал. :shuffle: :teapot:



    Atropos /12.10.2007 22:30/
    ЦФ 10'' дополнительно, отсосать остатки среды;

    При желании и на этом этапе можно прерваться, т. е. бросить эппендорф с осадком, например, на - 70.



    Atropos /12.10.2007 22:32/
    (guest: Студент @ 10.08.2007 19:03)
    Ссылка на исходное сообщение  Уважаемые молекулярные биологи, скажите пожалуйста, можно ли останавливать процесс выделения плазмидной ДНК в данной методике в пункте 16:
    Убрать образцы на -20 и  продолжить выделение на следующий день. confused.gif

    А то я сначала сделал, потом подумал. shuffle.gif  teapot.gif

    Как-то раз так делал, когда рабочий день на кафедре неожиданно закончился shuffle.gif, никаких отрицательных последствий не заметил.



    Atropos /12.10.2007 22:42/
    п.2. - ещё 2 раза;
    ЦФ 10'' дополнительно, отсосать остатки среды;


    Кстати, у кого какой опыт по поводу пользы дополнительной стадии ресуспендирования в р-ре I и осаждения (перед п. 5)?

    В Маниатисе в принципе рекомендуют

    The penalty for failing to remove all traces of medium from the bacterial pellet is a preparation of  plasmid DNA that is resistant to cleavage by restriction enzymes. This is because cell-wall components in the medium inhibit the action of many restriction enzymes. This problem can be avoided by resuspending the bacterial pellet in ice-cold STE @.25x volume of the original bacterial culture)
    and centrifuging again.

    но сравнивать как-то лень всегда было, то делал, то нет, по настроению. На практикуме такую стадию вроде делали.



    Гость /20.10.2007 20:51/
    Раствор 1 - просто трата времени, даже для максипрепа. Виход плазмиды тот же , а качество не обижает!



    PPK Rattus /21.12.2007 17:14/
    А так ли обязательны пп.17-22 для препаратов на форез ? У Маниатиса их вроде не было.
    Как я понял, их основной смысл - очистка от RNA. Может ли наличие RNA существенно ускорять полоску в геле (в 3-4 раза)?

    Когда мы пробовали с ними, под конец этой многократной очистки ИПСом осадка уже не было видно. Или так и должно быть?
    И, кроме того, в конце предлагается растворять в 25мкл буфера, но это сильно мало для последующей очистки фенолом-хлороформом (трудно отсасывать такие мелкие количества верхней фазы).
    Или после такой очистки можно сразу добавлять буфер для внесения - и в лунки?



    petr /21.12.2007 21:43/
    Вот только ща прочитал все. Какой-то мудреный метод, а потерь при нескольких переосаждениях будет много.
    Если выделять не китом (Кваген мидипреп пользую), то:
    1. в раствор I сразу налить РНКазу (собсна Квагеновцы так и делают)
    2. после инкубации в р-ре III (NaAc или NH4Ac) и открутки, супер надо отфенолить и отхлороформить (там же белков как грязи! потом после изопропанола хрен чего растворишь), и только потом осаждать.
    3. после растворения осадка дополнительные очистки - по вкусу.

    2 гость IP-штамп: frG/ehwVgdnf: Ну да, для минипрепа вместо раствора 1 пользую воду. Для миди - не пробовал.



    PPK Rattus /22.12.2007 08:06/
    (petr @ 21.12.2007 23:43)
    в раствор I сразу налить РНКазу
    Обязательно? Какую? Сколько? Этого достаточно, чтобы убрать всё, что помешает форезу?



    petr /22.12.2007 08:52/
    РНКазу-А. Сколько - поц-кажу завтра (ща под рукой нет протокола). Да, уберет все.



    curious67 /22.12.2007 23:01/
    открою Вам глаза на мир, хоть и лень писать, общее же место. Не знаю, какую идиотическию процедуру Вы там обсуждаете, похоже на бред. Выделять минипреп надо так- все в ультимативной форме, ибо практика- критерий истины, а то, что подставляюсь под всякие там "критические" замечания- по хренам. Имеющий уши...
    Итак, записывайте:
    1) крутим 2 раза по 2 мл (можно 1 раз, будет в 2 раза меньше ДНК) ночнушку на 10 тыс, 60-75 сек
    2) ресуспендируем в растворе 1 (300-400 мкл 10 мг/мл раствора РНКазы на 10-12 мл по фиг чего, допустим, 20 мМ Трис или РВS)- 250 мкл
    3) добавляем 250 мкл раствора 2 (стандартная NaOH-SDS), 5 мин при нежном перемешивании до полупрозрачной сопли
    4) 350 мкл 3 М КAc рН 4.8-5.2 (3М по К, 5 М по ацетату- по Маниатису). Интенсивно перемешиваем переворачиванием пробирки (не вортекс!) до образования творожистой взвеси. раствор уже не вязкий.
    5) крутим 10 мин на макс
    6) переносим все 850 мкл в 700 мкл изопропа, перемешиваем на вортексе хорошенько
    7) 10 мин на макс
    8) Имеем компактный осадок, размер которого зависит от: а) от копийности плазмиды, б) от наличия или отсутствия РНК. Изопроп удаляем, остаточное его количество коротко сбрасываем на минифуге и до-отбираем досуха
    9) Промываем (здесь аккуратнее- изопропные осадки можгут отделяться от стенки) 80% этанолом, произвольное количество, спирт удаляем, остатки его- также на минифуге и до-отбираем досуха
    10) СУШИМ 5 МИН НА 42-44 оС
    11) растворяем в 50-70 мкл 5 мМ Трис рН 8.0. Все
    Количество для нормальных плазмид типа pBlueScript или pGEM- 200-500 нг/мкл и выше, для менее копийных типа pQE или pET -от 50 нг/мкл и выше
    Качество- аналитическая рестрикция и сиквенс- ОК, для количественной рестрикции , трансфекции- надо фенолить
    На форезе- иногда много суперкойла, иногда в основном релакс, что ни хорошо и ни плохо. При наличии большого кол-ва РНК (в случае экспрессионных плазмид) можно добавить равный объем раствора 1 , проинкубировать мин 5-10 на 37 оС, и фенолить
    Вот и все. Проще метода не бывает, воспроизводимость -100%, количества достаточные, траха- мин



    Ъ /23.12.2007 00:15/
    (curious67 @ 22.12.2007 22:01)
    Ссылка на исходное сообщение  открою Вам глаза на мир, хоть и лень писать

    Но ничего нового и принципиального... confused.gif Но я все равно благодарю за то, что не поленились и высказались (эмоционально!). smile.gif В любом случае полезно, не только для начинающих. umnik.gif



    petr /23.12.2007 04:09/
    (curious67 @ 22.12.2007 20:01)
    Ссылка на исходное сообщение  
    3) добавляем 250 мкл раствора1 (стандартная NaOH-SDS), 5 мин при нежном перемешивании до полупрозрачной сопли

    5мин многовато. Достаточно 2-х мин. Вообще клетки лизируются моментально, главное аккуратно перемешивать
    Все равно, после отбора супера (после высаливания, перед осаждением изо-, хотя я всегда осаждал этанолом) я б отфенолил/отхлороформил, тогда ничего греть не придется (кстати, однажды открутил чачу, которая не растворилась даже при кипячении, а при следующей открутке, супер на форез -> шмер).
    В остальном - это ж классика, когда нет кита под рукой. smile.gif



    petr /23.12.2007 04:18/
    (petr @ 22.12.2007 05:52)
    Ссылка на исходное сообщение  РНКазу-А. Сколько - поц-кажу завтра (ща под рукой нет протокола). Да, уберет все.

    Да, до работы сегодня так и не добрался. Но что-то у меня в голове крутиццо - стоковый раствор РНКазы 10мг/мл, конечная концентрация 10мкг/мл. Возможно вру, как буду в лабе посмотрю.
    Кстати, если растворяете сухую РНКазу, добавьте к ней немного EDTA (этак 10мМ чтоб было) и прогрейте этак на 80оС минут 10-15. Она всегда загрязнена ДНКазой.
    Странно, но РНКаза вроде не боится кипячения, но почему-то однажды я вскипятил ее, и она сдохла...



    curious67 /24.12.2007 17:47/
    все так, разумеется, классика, однако 40 с лишним постов мусолят эти вот общие места. Что до фенола/хлороформа перед высаживанием изопропом, никогда не делаю, все растворяется нацело, если, конечно, в изопроп не попал ацететный дебрис. А про 5 мин в щелочи- можно и меньше, я в это время курю, точный хронометраж не веду



    PPK Rattus /26.12.2007 13:19/
    >крутим 2 раза по 2 мл (можно 1 раз, будет в 2 раза меньше ДНК) ночнушку на 10 тыс
    А 3 раза по 1,5мл можно? А то в эпендорф больше не влезает. shuffle.gif
    А если на 12 тыс. 2' можно?

    >добавляем 250 мкл раствора1 (стандартная NaOH-SDS)
    Вы, наверное, хотели сказать "раствора2" ?

    >КAc
    А AcONH4 не сильно хуже? А то ацетеата калия у нас вроде нету...

    >на макс
    В смысле на максимуме оборотов?

    >При наличии большого кол-ва РНК (в случае экспрессионных плазмид) можно добавить равный объем раствора 1 , проинкубировать мин 5-10 на 37 оС, и фенолить
    А без РНКазы точно никак для фореза?

    >растворяем в 50-70 мкл 5 мМ Трис рН 8.0
    А трудоемкость с феноленьем таких небольших количеств не возникает?



    curious67 /26.12.2007 14:08/
    ([PPK)
    Rattus,26.12.2007 13:19]Ссылка на исходное сообщение  >крутим 2 раза по 2 мл (можно 1 раз, будет в 2 раза меньше ДНК) ночнушку на 10 тыс
    А 3 раза по 1,5мл можно? А то в эпендорф больше не влезает. shuffle.gif
    А если на 12 тыс. 2' можно?

    Ответ: во-первых, 1,5 мл пробирки менее удобны, ибо дно заужено и перемешивание плохое, особенно в вязкой среде после добавления щелочи
    во-вторых, 12 тыс нельзя, клетки полопаются. И 2 мин не надо, 60-75 сек на 10 тыс. вполне достаточно

    >добавляем 250 мкл раствора1 (стандартная NaOH-SDS)
    Вы, наверное, хотели сказать "раствора2" ?

    Ответ: спасибо, уже исправил

    >КAc
    А AcONH4 не сильно хуже? А то ацетеата калия у нас вроде нету...

    Ответ:
    Аммонийных солей надо намного больше, если не ошибаюсь, 1/3 от объема- было как-то в древних методах. Все же надо б найти калий, это пустяк

    >на макс
    В смысле на максимуме оборотов?

    Ответ:- разумеется

    >При наличии большого кол-ва РНК (в случае экспрессионных плазмид) можно добавить равный объем раствора 1 , проинкубировать мин 5-10 на 37 оС, и фенолить
    А без РНКазы точно никак для фореза?

    Ответ: РНК вообще-то ничему не мешает, но этидий на себя сосет, и если РНК много, то ДНК (идущая сверху) недокрашивается- можно сильно недооценить ее (ДНК) количество со всеми вытекающими...

    >растворяем в 50-70 мкл 5 мМ Трис рН 8.0
    А трудоемкость с феноленьем таких небольших количеств не возникает?

    Ответ:
    Если фенолите, то разбавьте раза в 2, потери будут меньше. А если не фенолить, то 50-70 мкл- как раз тот объем, которые даст Вам удобные концентрации плазмиды для последующих манипуляций




    PPK Rattus /26.12.2007 14:14/
    >во-первых, 1,5 мл пробирки менее удобны, ибо дно заужено и перемешивание плохое
    Что-ж делать, чем богаты, тем и рады... :[

    >12 тыс нельзя, клетки полопаются.
    Но их же всё равно потом лизировать?

    >А если не фенолить
    Для неколичественного фореза необязательно?



    curious67 /26.12.2007 19:05/
    ([PPK] Rattus @ 26.12.2007 14:14)
    Ссылка на исходное сообщение  >во-первых, 1,5 мл пробирки менее удобны, ибо дно заужено и перемешивание плохое
    Что-ж делать, чем богаты, тем и рады... :[

    если нет возможности купить нужный пластик, непременно прекращайте мастурбировать с ДНК

    >12 тыс нельзя, клетки полопаются.
    Но их же всё равно потом лизировать?
    только Вы сначала  СЛИВАЕТЕ СУПЕР, вместе с содержимым полопавшихся клеток. Включите мозги

    >А если не фенолить
    Для неколичественного фореза необязательно?

    для такого фореза, котрый Вы продемонстрировали во втором Вашем топике, можно все что угодно- все равно ничего не выйдет- в том бреде, кторый Вы написали, неправильно буквально все, начиная от СТАРОГО!!!!!!!!!! TBE и кончая неправильным режимом электрофореза. О качестве презентации результата и не говорю. Хотя...Я понимаю, чем богаты, тем и рады. Как это все назавается, я упомянул парой строчек выше



    PPK Rattus /26.12.2007 20:57/
    >только Вы сначала СЛИВАЕТЕ СУПЕР, вместе с содержимым полопавшихся клеток. Включите мозги.
    ОК. Будем исправлять и пробовать.



    Гость /12.03.2008 16:55/
    сказите позалуйста, поцему ДНК пБлуесцрипт II К(+) после рестрикции, на електрефорезе имеет три стриха на снимке.



    The problem /13.03.2008 10:35/
    да хоть 5, не имеет значения. Да и не только BlueScript- у Вас имеются различные формы плазмиды: суперкойл, куча разных релаксов, у всех у них разная подвижность из-за разной способности этидия интеркалировать в разные спирализованные формы. /расслабьтесь, у ВАс все нормально



    Ъ /13.03.2008 10:56/
    (The problem @ 13.03.2008 09:35)
    Ссылка на исходное сообщение  да хоть 5, не имеет значения. Да и не только BlueScript- у Вас имеются различные формы плазмиды: суперкойл, куча разных релаксов, у всех у них разная подвижность из-за разной способности этидия интеркалировать в разные спирализованные формы. /расслабьтесь, у ВАс все нормально

    После рестрикции плазмиды 3 или 5 полос и расслабься confused.gif Я бы не расслаблялся... smile.gif



    The problem /13.03.2008 12:16/
    сорри, не заметил фразу про рестрикцию. Тады ой! Стало быть, сайтов у Вас много больше, чем должно быть. Или, что вероятнее, идет недорестрикт (детали неизвестны, сколько рестриктаз было в рестрикции)- надо дополнительно чистить плазмиду или же сменить фермент



    Гость /16.03.2008 22:21/
    болшое спасибо вам за ответ:)



    Гость /21.04.2008 17:06/
    У кого-нибудь было такое,что после инкубации с RNA-зой рDNA деградировала? Если добавлять RNA-зу в GTE, то сколько?



    guest: ммм /21.04.2008 17:25/
    --У кого-нибудь было такое,что после инкубации с RNA-зой рDNA деградировала? Если добавлять RNA-зу в GTE, то сколько?

    RNA-зу, прокипятите в кипяще бане минут 20 преред использованием. Вся ДНКаза, и загнется.



    Anna-K213 /22.04.2008 13:46/
    Скажите, пожалуйста, как можно избавиться от пятна РНК в плазмидной ДНК , выделенной вручную? я хочу ее далее секвенировать.



    guest: ммм /22.04.2008 16:48/
    --Скажите, пожалуйста, как можно избавиться от пятна РНК в плазмидной ДНК , выделенной вручную? я хочу ее далее секвенировать.

    А она по идее сильно мешать недолжна.
    А так обработать РНКазой только без фанатизма достаточно 10-30мкг/мл, а потом фенолить, но от фенол надо хорошо избавится переосаждением спиртом и спирт-эфиром.

    Можно еще осадить РНКу 6М LiCl. Но это малоэфективно.



    Ъ /22.04.2008 20:13/
    (Anna_K213 @ 22.04.2008 12:46)
    Ссылка на исходное сообщение  Скажите, пожалуйста, как можно избавиться от пятна РНК в плазмидной ДНК , выделенной вручную? я хочу ее далее секвенировать.

    В более продвинутых протоколах (китах) РНК-аза используется до начала лизиса клеток. Так что возвращайтесь на исходные позиции, а готовую плазмиду освобождать от РНК-аз - дороже обойдется. Если это пятно не такое яркое, не обращайте внимание и секвенируйте - авось обойдется. smile.gif



    Гость /25.07.2008 04:47/
    добавляю РНКазу между 1 и 2 растворами, держу 15 минут на 37С. Все работает



    Lexey /28.07.2008 12:13/
    1) Кто нибудь пробовал эту методу для выделения плазмидного профиля из диких штамов? Если есть опыт, поделитесь! Необходимость только в форезе.
    2) Теоретический. Откуда такая разница в концентрации плазмид, когда вместо LB используется МПА?



    викки /10.09.2008 20:29/
    Товарищи!
    Кто может подсказать почему TE буфер при выделении плазмиды мелодом щелочного лизиса дожен быть с рН именно 8.0?????



    Ъ /11.09.2008 12:09/
    (викки @ 10.09.2008 19:29)
    Ссылка на исходное сообщение  Товарищи!
    Кто может подсказать почему TE буфер при выделении плазмиды мелодом щелочного лизиса дожен быть с рН именно 8.0?????

    Независимо от метода, ТЕ всегда рН 8.0. Можно конечно с 8.5 и даже 9.0, но никак не меньше 8.0. и от метода выделения это не зависит.
    Кстати, сейчас весь мир использует только метод щелочного лизиса, а другие остались в 20 веке.



    викки /11.09.2008 20:47/
    упс... немного некорректно выразилась... я имела ввиду, как именно это значение рН влияет на дальнейший ход работы... ????? сам TE используется как хелатирующий агент... перед детергентом(SDS)...это понятно... но ПОЧЕМУ именно 8.0? какую роль играет это значение?



    Ъ /11.09.2008 21:57/
    (викки @ 11.09.2008 19:47)
    Ссылка на исходное сообщение  упс... немного некорректно выразилась... я имела ввиду, как именно это значение рН влияет на дальнейший ход работы... ?????    сам TE используется как хелатирующий агент... перед детергентом(SDS)...это понятно... но ПОЧЕМУ именно 8.0? какую роль играет это значение?

    Никакой. Мелочи в жизни. Для сведения, при понижении рН ниже 8 ЭДТА начинает потихоньку выпадать в осадок или по-другому, при рН ниже 8 ЭДТА не растворяется в воде. smile.gif
    http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=265077 ( http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=265077 )



    PPK Rattus /06.06.2009 22:45/
    (Lexey @ 28.07.2008 15:13)
    Ссылка на исходное сообщение  1) Кто нибудь пробовал эту методу для выделения плазмидного профиля из диких штамов? Если есть опыт, поделитесь! Необходимость только в форезе.
    У меня точно такая же задача стояла (см. выше). Полный алгоритм выделения, с щелочным лизисом и осаждением спиртом я пока оставил, поскольку он оказался весьма требовательным к чистоте реактивов.
    Взял поэтому за основу экспресс-метод http://molbiol.ru/protocol/04_03.html ( http://molbiol.ru/protocol/04_03.html ) в модификации DNAuser с некоторыми уточнениями:
    1. Ресуспендируем в 60 мкл. TE
    2. Фенол-хлороформим дважды, потом хлороформим однократно (правда работает это вроде как только на Грам- бактериях: из лизирующих компонентов, как я понял, там только фенол и для толстого пептидогликана Гр+ его, по-видимому, недостаточно).
    3. Полученный раствор (~45мкл) + 2 капли минерального масла (чтобы не испарился) прогреваем при 90°С ~4мин. и плавно остужаем (можно в руках) для ренатурации pDNA (иначе на форезе плазмида в виде разных конформаций пойдет несколькими полосами и не там, где надо)
    4. Собираем 35-40мкл. из мод масла и хорошо смешиваем в новой пробирке с 5-6мкл. 1x буфера для внесения.
    5. Вносим в лунки 0,8-0,9% геля и форезим 2ч. при 5в/см в 1x TBE буфере (гель нужен достаточно длинный).

    Выход, конечно, по меркам здешних суровых хтонических молбиологов будет дико слабый и грязный, но для фореза - достаточно.

    (Lexey @ 28.07.2008 15:13)
    2) Теоретический. Откуда такая разница в концентрации плазмид, когда вместо LB используется МПА?
    В принципе можно и на том и на другом - и так и так выход есть видимый. Где больше, где меньше пока не замечал.








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler