Главная страница MolBiol.ru > Методы > Плазмиды > Максипреп - лизис щелочью Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Выделение pDNA (максипреп - лизис щелочью)

Лучший метод для получения pDNA высокого качества (годится даже для трансфекции). Его преимущества:
- очень низкая цена,
- высокая скорость.
  1. растить ночную культуру 20-24 часа в 100-500ml богатой среды: 37oС, 200-300rpm;
  2. ЦФ 4oС, 10-15', слить среду;
  3. ЦФ 4krpm, 1', отсосать остатки жидкости;
  4. ресуспензировать в 10(5)ml раствора "I";
  5. + 1(0.5)ml свежеприготовленного раствора лизоцима (10mg/ml в р-ре "I");
  6. NT, 15';
  7. + 20(10)ml раствора "II", вылить резко, смешать:
  8. Конечн. Сток: 10ml20ml
    NaOH0.2N1N
    10N
    2ml
    0.2ml
    4ml
    0.4ml

    SDS1%10%1ml2ml
    H2O   mQ 7ml
    8.8ml
    14ml
    17.6ml

  9. 0oС, 5';
  10. + 10(5)ml холодного 10М AcONH4 (добавлять 5 ml пипеткой по каплям), смешать;
  11. 0oС, 5';
  12. ЦФ 5krpm, 4oС, 10';
  13. супер снять, разделить на 2 пробирки, добавить к каждой по 12.5 ml изопропанола. Делать это на весах, чтобы пробирки имели равный вес;
  14. NT, 10';
  15. ЦФ 5krpm, 4oС, 10', сбросить супер;
  16. ЦФ NT, 3', отсосать остатки жидкости (не подсушивать);
  17. cуспендировать осадок в 800µl 2 M AcONH4, объединить в одной 2ml пробирке;
  18. NT, 5';
  19. ЦФ NT, 10';
  20. cупер перенести в пробирку с 800µl изопропанола;
  21. NT, 5';
  22. ЦФ NT, 5';
  23. сполоснуть 70% EtOH;
  24. растворить в 0.2-1ml H20.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 16178


    Комментарии

    Смотри комментарии к 04_01 Выделение pDNA (минипреп).



    Дополнение от человека знающего (но неизвестного):
    • Я обнаружил, что если добавить к раствору II Triton X-100 до конечной концентрации 0.2%, осадок становится устойчивее и геномная ДНК высаживается полнее. Это не рекомендуется делать при очистке больших космид.
    • Чтобы получить более чистую плазмиду полезно перед осаждением изопропанолом профильтровать лизат через фильтровальную бумагу или Miracloth (Calbiochem).

    Дополнения, комментарии, вопросы

    Гость /25.08.2006 09:13/
    A [NT] eto [Normal Temperature]?



    Redactor /25.08.2006 10:24/
    да



    Гость /19.09.2006 11:42/
    Раствор 1 (с лизоцимом) в случае колей можно не применять. Они со свистом лизируются в р-ре 2.



    Гость /15.09.2008 15:26/
    Скажите, пожалуйста, можно ли на конечной стадии прогреть плазмиду 90 град минут 5? Осадок почему-то не растворился почти и более низкотемпературный прогрев не помогает...



    pacak /27.10.2008 00:49/
    Здравствуйте,
    Вам может покозаться странным но у нас в лаб. нет амония ацетата, можно ли применят для высаживания ДНК в данном протоколе ацетаты калия или натрия? Надо ли изменить пропорцию соли в растворе для калия и натрия ?
    Спасибо.
    пацак



    guest: ммм /31.10.2008 16:14/
    --можно ли применят для высаживания ДНК в данном протоколе ацетаты калия или натрия.
    Калия и Натрия можно, лучше калия см Маниатиса. Стандарт для любой ДНК и спирта 0.3М раствор.

    Для третьего раствора бывают вариации с рН. и Соотношением объемов.



    guest: Глеб /06.11.2008 14:30/
    >Скажите, пожалуйста, можно ли на конечной стадии прогреть плазмиду 90 град минут 5?

    Нет, плазмиде настанет п-ц. Проверено. Была та же проблема, решилась включением промежуточной стадии - очистка хлороформом перед тем как спирт добавлять. Т.к. ваш осадок скорее всего содержит массу всякой шняги, вот и не растворяется.

    >можно ли применят для высаживания ДНК в данном протоколе ацетаты калия или натрия? Надо ли изменить пропорцию соли в растворе для калия и натрия ?

    Можно, так и делаем.



    polymerase /19.03.2009 17:35/
    При какой температуре нужно хранить выделенную pDNA, элюированную водой?



    guest: mlog /22.03.2009 22:50/
    Годится ли этот метод для выделения низкокопийных плазмид?



    guest: ммм /24.03.2009 19:25/
    --Годится ли этот метод для выделения низкокопийных плазмид?

    Да! Но! Нужно брать много культуру 300-1000мл. Очень высокая примесь РНК. Поэтому нужно РНКазить мощнее чем обычно.








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler