Главная страница MolBiol.ru > Методы > Плазмиды > Экспресс-метод Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Экспресс-метод выделения pDNA

Очень удобный и быстрый метод, когда требуется быстро проанализировать наличие вставки в векторе, размер плазмиды и т.п.
  1. растить ночную культуру 16-24 часа в богатой среде: 37oС, 200-300rpm;
  2. 0.2ml ночной культуры поместить в 1.7ml пробирку;
  3. ЦФ 30'', удалить супер;
  4. ресуспензировать осадок в 40µl 1х TE (или TAE), вортекс 5'';
  5. добавить:

    40µl Ф:Х,
    4µl 10х SDS(+)-буфера для внесения;

  6. вортекс 20'';
  7. ЦФ 5';
  8. 15-20µl водной фазы на форез.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 15065


    Комментарии

    Общие

  • На форезе видны геномная DNA, pDNA, рибосомная RNA и tRNA. Если размер pDNA < 3.5-4kbp она идёт слишком близко к рибосомной RNA и для аккуратного определения размера требуется включить в п.4 обработку RNase .
  • Легкое неудобство, связанное с методом : раствор в п.8 весьма вязкий и имеет склонность выскальзывать из лунки на поверхность форезного буфера при неаккуратном нанесении (важно, чтобы над гелем было ~2-3mm буфера, иначе, как ни наноси - всё равно выскользнет).
  • Если плазмида со строгим контролем (низкокопийная) нужно быть готовым к тому, что видно ее будет очень плохо.


  • По пунктам

    п. 1

  • Дополнение: для выкалывания бактериальных колоний и старта минипрепов можно выкалывать колонии 200µl типами и отстреливать их сразу в пробирки со средой - экономит время и стерильно (меньше возни, чем с зубочистками).
    Александр Чубыкин.
  • Бактерии можно выращивать в 2ml или 1.7ml эппендорфах.
  • п. 4

  • Если требуется избавиться от RNA, п.4 =>
  • 4а. ресуспензировать осадок в 40µl TE+RNase(50µg/ml), вортекс 5'';
    4b. NT, 5-10';

    п.5.

  • Лизис бактерий, белки уходят в органическую фазу, в водной остаются нуклеиновые кислоты.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    Гость /31.10.2006 13:53/
    A chto predstavljaet soboj SDS(+)-буфер?



    Guest /31.10.2006 14:21/
    какой такой?



    DNAuser /02.11.2006 23:19/
    У меня недавно времени не было для минипрепа, и наткнулся на даный метод. Хороший метод для быстрого анализа, к тому же отфенолил без SDS - получилось красиво, и вышеописанная проблема выскальзывания не возникла ни разу.



    guest: Igor /15.02.2007 14:31/
    Добрый день,
    а какие минусы при экспресс методе? Можно ли использовать дальше для секвенирования полученную таким образом пДНК, разумеется после вырезания с агарозного геля?
    Заранее спасибо.



    curious67 /15.02.2007 16:09/
    таким методом можно только относительно быстро проскринировать несколько десятков клонов на наличие вставки, более ни для чего такая "ДНК" не годится, разумеется. Но то же самое много быстрее и проще можно сделать ПЦРом прямо с колоний, несколько сотен за раз -не проблема. А потом что так, что эдак наращивать и выделять по-человечески, ПЦР культурнее и грязи меньше вокруг



    guest: Igor /15.02.2007 22:37/
    Большое спасибо за ответ!



    би-олух /16.02.2007 17:09/
    А если вместо Ф+Х взять просто хлороформ. По идее, ничего особенно не поменяется?



    curious67 /16.02.2007 18:23/
    только не все белки уйдут. Можно ыообще не фенолить, соотв. не хлороформить, для сиквенса и рестрикции аналитической сойдет и так, убрать соли 80% спиртом, и ладушки



    би-олух /17.02.2007 10:49/
    "только не все белки уйдут. Можно ыообще не фенолить, соотв. не хлороформить, для сиквенса и рестрикции аналитической сойдет и так, убрать соли 80% спиртом, и ладушки "

    Спасибо!
    Мне тоже так показалось.
    Только, если совсем не фенолить, то надо аккура-атненько, а то гадость всякая будет плавать. А если с хлороформиком открутить, то вполне чистенько и быстренько получается.

    Хотя, это, наверное, кто как привык smile.gif



    curious67 /17.02.2007 16:37/
    хлороформ ничему не повредит, это точно. Хотя у меня и без него ничего не плавает- кручу 13400 об. 10 мин при комн. Т, это после нейтрализации, потом изопропиловый спирт и все. Не забывать промывать хорошенько 80% этанолом



    Dzmitry /20.02.2007 17:14/
    Поясните плиз этот момент

    40µl Ф:Х - это фенол и хлороформ? В какой пропорции? Какие концентрации? Или что?



    curious67 /20.02.2007 17:55/
    во-первых, слово хлороформ нужно понимать как 24:1 хлороформ:изоамиловый спирт, это всегда так, смешиваете и забываете
    Во-вторых, Ф:Х бывает по-разному, я люблю Х побольше, чтобы потом еще раз не добавлять чисто Х. Рутинно, я добавляю от 1/2 до 2/3 Ф к водному раствору, трясу до белой пены, после чего добавляется Х реально по вкусу, но поскольку так методики не пишутся, раза в 1.5 больше, чем Ф (по прописи 1:1,но с учетом трудности пипетирования Х из-за его текучести и быстрого испарения, Х попадает в пробирку меньше, чем Вы выставили на самплере). Вотб и снова яростно потрясти. Все. Счастье. Крутить по макс 3 мин



    Dzmitry /20.02.2007 21:12/
    Ясно. спасибо.



    guest: al /21.02.2007 16:47/
    (curious67 @ 20.02.2007 16:55)
    Ссылка на исходное сообщение  во-первых, слово хлороформ нужно понимать как 24:1 хлороформ:изоамиловый спирт, это всегда так, смешиваете и забываете


    Ну, это классика, всегда так было.

    Только вот мне давно очень любопытно - а для чего изоамиловый
    нужен? Чем плох один хлороформ?
    Может кто знает?



    Guеst /21.02.2007 18:20/
    (guest: al @ 21.02.2007 14:47)
    Ссылка на исходное сообщение  Чем плох один хлороформ?
    Может кто знает?

    пенится сильнее



    curious67 /21.02.2007 18:21/
    это просто- из курса коллоидной химии. Изоамил- ПАВ, который как все ПАВы, снижает поверхностное натяжение, поэтому фазы лучше разделяются. Литература по этому поводу будет интересная- не из PubMed-просто что-нибудь из Верна или Стивенсона- как китовый жир при шторме льют за борт



    curious67 /21.02.2007 21:08/
    (Guеst @ 21.02.2007 18:20)
    Ссылка на исходное сообщение  пенится сильнее

    полная чушь- попробуйте вспеньте хлороформ!!!!!!!!



    K6O6T613 /18.02.2008 17:46/
    Один хлороформ при стоянии превращается во всякую гадость типа фосгена. Обычно добавляют 0.5% метанола для стабилизации или серебряную фольгу (для использования в оргюсинтезе или ЯМР соответственно). 1/25 часть изоамилового спирта в хлороформе также может оказывать стаб. действие...

    Хотя идея, что изоамиловый спирт - это ПАВ, увлекающий белки в орг.фазу, мне нравится больше.



    The problem /18.02.2008 21:29/
    хлороформ превращается в фосген- утверждение сильное- на самом деле, фосген имеется в следовых количествах, и может чему-то там и вредит, но уж точно не ДНке.
    Не берите в голову, Вам же им не дышать (надеюсь!), не траванетесь



    Гость /16.04.2008 14:13/
    а фенол сатурированый буфером или водой?








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler