Главная страница MolBiol.ru > Методы > Плазмиды > Очистка центрифугированием в CsCl Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Очистка pDNA равновесным центрифугированием в CsCl

Адаптированная методика для центрифуги Optima TL-100 (Beckman). Используется бакет-ротор, пробирки запаивать не нужно. Удобна, когда требуется не слишком большое количество (до 1mg) pDNA высокого качества.
  1. взять 0.2-1.0mg pDNA, довести объём до 540µl (H2O или TE),
  2. добавить

    0.800g CsCl;
    60µl EtBr 10mg/ml;

  3. смешать, NT, 5';
  4. ЦФ NT, 10';
  5. перенести водную фазу в полипропиленовую ультроцентрифужную пробирку для ротора TLS-55; наслоить поверх последовательно по 0.73ml растворов "p2" и "p1";
  6. уравновесить пробирки (вместе с бакетами) попарно на точных весах (с точностью до 1mg);
  7. ЦФ на Optima TL-100 (Beckman) 55krpm, NT, >12h (лучше ~24h);
  8. собрать в 1-2ml шприц суперскрученную pDNA (нижняя полоса), перенести в 1.5ml пробирку;
  9. несколько раз (до исчезновения окраски) экстрагировать раствором "изопропанол /CsCl";
  10. очистка от CsCl:
  11. * либо диализ,
    * либо разбавить H2O в 3 (а лучше в 6) раз и осадить 1х объёмом EtOH (мягко смешать, преципитат промыть 75% EtOH, дважды перенося типом в новую пробирку);

  12. подсушить, растворить в H2O или TE, спектрофотометрически определить концентрацию.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 9904

    Растворы

    p1 p2 p3     

    (хранить при NT):

    200ml
    VH2OmCsClVEtBr, 10µg/µl
    "p1=1.378"160.0ml
    100.0g
    15.00ml
    "p2=1.564"147.5ml
    150.0g
    "p3=1.750"135.0ml
    200.0g

    миниобъёмы для разведения pDNA:

    0.8mlVH2O/DNAmCsClVEtBr, 10µg/µl
    "p1=1.378"0.640ml0.400g60.0µl
    "p2=1.564"0.590ml0.600g
    "p3=1.750"0.540ml0.800g


    Изопропанол/CsCl

    Насыщенная трехфазная смесь изопропанола, H2O и CsCl (хранить при NT).



    Комментарии

    Общие

  • При очистке pDNA на центрифуге Optima TL-100, ротор TLS-55 имеет смысл преформировать ступенчатый градиент CsCl, т.к.
    1. время установления градиента концентрации CsCl без преформирования ~65h;
    2. время установления градиента концентрации CsCl с преформированием ~ 8h;
    3. время миграции молекулы DNA вдоль градиента ~11h.
  • В зависимости от того, от чего важнее очистить DNA (от белков+никованной DNA или от RNA), pDNA вносится либо только в верхнюю, либо только в нижнюю ступень градиента. При таком внесении примесям не приходиться проходить через плотный слой pDNA и их отделение происходит быстрее и качественнее.


  • По пунктам

    п. 1.

  • pDNA смешивается с CsCl и EtBr. EtBr интеркалирует в двухцепочечную молекулу DNA, при этом происходит некоторое раскручивание спирали. В линейную молекулу dsDNA (или никованную кольцевую) краситель может входить без всяких проблем, связанных с раскручиванием. С кольцевой ковалентно замкнутой начинаются проблемы, связанные с перекручиванием спирали (красителя связывается меньше). Интеркаляция EtBr вызывает понижение плотности DNA, следовательно, линейная и никованная DNA оказываются легче, чем кольцевая ковалентно замкнутая. За счет этого и происходит их разделение.
  • EtBr играет и еще одну роль. Его интеркаляция меняет геометрию DNA и это помогает снять с нее тесно ассоциированные белки. Существуют методы выделения DNA, где EtBr используется только в этой роли (без всякого ультроцентрифугирования).
  • п. 4.

  • Этот этап позволяет избавиться от белков, которые выпали в осадок в высокосолевом растворе. Отбирая водную фазу, постарайтесь не разрушить белковый преципитат. Лучше, если удастся прилепить его к стенке пробирки.
  • п. 5.

  • При очистке векторной pDNA более важно очиститься от примесей RNA (они мешают дефосфорилированию)=> pDNA вносится только в нижнюю ступень градиента (RNA опускается вниз, а DNA поднимается вверх).
  • п. 6.

  • Центрифуга будет нормально работать и при точности ~10mg, но с весьма заметным свистом. При точности ~1mg она будет работать совершенно бесшумно (если не считать лёгкого пыхтения форвакуумного насоса).
  • п. 9.

  • "Изопропанол/CsCl" по нашему опыту лучше и удобней, чем такие способы удаления EtBr, как экстракция бутанолом или использование ионообменной смолы. То, что смесь трехфазная, позволяет избежать обезвоживания раствора DNA (что чревато выпадением в осадок DNA и соли).
  • На самом деле (особенно при очистке вязких растворов, когда приходится делать несколько экстракций) некоторое обезвоживание всё же происходит. Поэтому удобно маркером отметить на пробирке уровень водной фазы и добавлять "на глаз " mQ до этой отметки после каждой экстракции.
  • п. 10.

  • Преципитация при NT (не на -20oС!, иначе CsCl выпадет в осадок).
  • Непроверенная информация Есть сообщение, что если разбавить раствор в большее количество раз, то выход pDNA выше.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler