Главная страница MolBiol.ru > Методы > Плазмиды > Выделение низкокопийных плазмид Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Амплификация и выделение низкокопийных плазмид

Татьяна Веремейко (veremeiko@ngs.ru)
ГНЦ ВБ "Вектор", НИИ биоинженерии.

    Амплификация плазмиды

  1. засеять на ночную инкубацию 1 колонию в 5ml среды LB с необходимым антибиотиком;
  2. в 3 колбы (по 750ml) разлить по 150ml среды LB, внести по 1ml ночной культуры клеток, добавить антибиотик;
  3. подращивать на качалке до D600=1;
  4. добавить в каждую колбу по 10mg хлорамфеникола и по 200µl 40% глюкозы;
  5. инкубировать ночь на качалке;


  6. Щелочное выделение ДНК

  7. ЦФ 8krpm 10';
  8. ресуспендировать бактерии в 10ml H2O;
  9. добавить 20ml раствора (0.2 M NaOH, 1% SDS), тщательно перемешать, 20-15' инкубации на столе;
  10. добавить 15ml 3М NaA c pH 5.0, тщательно перемешать, инкубировать в холодильнике (+4OС) 1h (можно и на ночь оставить);
  11. ЦФ 12 krpm 15';
  12. супернатант перелить, добавить к нему 80ml этанола, перемешать, инкубировать 30' при -20OС;
  13. ЦФ 12 krpm 10';
  14. растворить в 1-2ml H2O, разлить в 1.5ml пробирки;
  15. добавить 5M LiCl в пропорции 1:1. Перемешать, инкубировать 10' при -70OС;
  16. ЦФ 12 krpm 10';
  17. к супернатанту добавить двойной объём этанола, перемешать;
  18. ЦФ 12 krpm 10';
  19. растворить в 800µl H2O;
  20. добавить 10µl RNase A (10mg/ml);


  21. Очистка ДНК на колонке

  22. добавить к раствору ДНК 1g CsCl, растворить;
  23. инкубировать ночь при +4OС
  24. ЦФ 12 krpm 10';
  25. к супернатанту добавить краску для нанесения на форез и нанести на колонку с сефарозой СL-2B в TE буфере;
  26. снимать фракции по 0.5-1ml;
  27. проверить наличие ДНК во фракциях на 1% агарозе;
  28. провести диализ фракций с ДНК в буфере ТЕ.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 14450


    Комментарии

    Общие

  • Метод особенно хорош для низкокопийных плазмид. Качество получается практически такое же как и при очистке в градиенте CsCl, но работы меньше и ультрацентрифуга не нужна. Методика занимает 2-3 дня.
  • Из 450ml среды выделялось ~0.1mg низкокопийной плазмиды. Наращивание биомассы лучше делать на LB среде, обогащенные среды типа 2xYT ухудшают качество выделения.
  • Хлорамфеникол = левомицетин (при покупке в аптеке). Прислала taniusha.


  • По пунктам

    п. 4.

  • Глюкоза добавляется из соображений гуманности к бактериям после хлорамфеникола .
  • п. 14.

  • LiCl селективно осаждает RNA. Таким образом избавляются от большей части примеси РНК в препарате.
  • п. 23.

  • Колонку можно сделать из стеклянной пипетки на 10ml.
  • п. 26.

  • Диализ необходим только при многократном использовании колонки, как ее не промывай, следы CsCl остаются и мешают ферментативным реакциям.
  • А можно на фильтрах 100 kD, это гораздо быстрее. Сконцентрировать раствор ДНК с помощью фильтра до 0.2ml, а затем трижды добавлять ТЕ буфер по 0.3ml.

    Дополнения, комментарии, вопросы





       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler