Главная страница MolBiol.ru > Методы > Плазмиды > Максипреп - очистка с PEG Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Выделение pDNA (максипреп - очистка с PEG)

Анна Малашичева (anna.malashicheva@ens-lyon.fr)
  1. поместить 5ml "дневной культуры" в 250ml LB, растить ON 37OС, 200-300rpm;
  2. ресуспендировать бактерии в 8ml GTE + lysozyme (200µl 50µg/µl, свежеприготовленный), 5' во льду;
  3. добавить 16ml SDS/NaOH, мягко смешать, 5' во льду;
  4. добавить 12ml AcOK, 5' во льду, опять тщательно перемешать;
  5. ЦФ 15' при 4krpm, 4ОC;
  6. перенести супернатант в другую пробирку, добавить 12ml PEG 6000 40%, 20-30', перемешать, 30' во льду;
  7. ЦФ 30' 4krpm , 4ОC;
  8. супернатант слить, ресуспензировать осадок в 1ml H20;
  9. добавить 500µl NH4Ac 7,5M and перенести в эппенлорф,10-15' во льду;
  10. ЦФ 15' при 12krpm, 4OC;
  11. перенести супернатант в новый эппендорф;
  12. дальше: RNAse, Proteinase K, фенол:хлороформ, осаждение изопропанолом;


  13. Если нужна особо чистая DNA (для трансфекции), то

  14. ресуспензировать осадок после изопропанола в 500µl H20 и добавить 180µl PEG/LiCl;
  15. 20'-30' NT;
  16. ЦФ 15' при 12krpm, NT;
  17. дважды споласнуть 70% этанолом, подсушить, ресуспензировать.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 11981

    Растворы

    AcK 3M/H2CO2 1.8M

    (хранить при +4OС)

     500ml
    CH3COOK147g
    Formic acid5ml
    H2O 


    PEG 6000 40%

    (автоклавировать и хранить при +4OС)

      500ml
    PEG 600040%200g
    H2O  


    PEG/LiCl

    (автоклавировать и хранить при +4OС)

       50ml
    LiCl2.5M42.39g/M5.30g
    PEG 600040%тв.20g
    H2O mQ 




    Комментарии

    По пунктам:

    п. 1.

  • Не перерасщивать!.
  • п. 3.

  • Особенно, если большая плазмида, то перемешать надо тщательно, но сильно не трясти.
  • п. 4.

  • Должна получиться творожная каша, но немного не такая, как получается, когда лизируешь по Qiagen: более мелкие хлопья.
  • п. 5.

  • Я кручу в 50ml "фальконах". После открутки возможны два варианта - или очень ясный супер и твердый белый осадок, тогда всё OK. Не знаю, почему, но так иногда бывает, что осадок и супер не разделятся, это плохо прошедший лизис; тогда есть шанс отделить немого супера, но лучше все выкинуть :(( .
  • п. 8.

  • Это самый дурацкий шаг, его надо делать тщательно. Осадок растворяется очень плохо, но это нормально. Я наливаю воды, привинчиваю пробирку к "Вортексу" и трясу на максимальной скорости.
  • п. 13-16.

  • На этой стадии теряется до 50% DNA, но всё равно много остаётся.

    Дополнения, комментарии, вопросы





       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler