Главная страница MolBiol.ru > Методы > Плазмиды > Silica spin колонки Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Очистка pDNA на silica spin колонках

Описывается изготовление самодельных silica-spin колонок и состав буферов для выделения плазмидной DNA. В протоколе не используется RNase, тем не менее получается качество, достаточное для сиквеса и практически всех остальных приложений.

    Очистка pDNA

  1. 2 ml ночной культуры осадить центрифугированием в течении 2';
  2. убрать среду;
  3. ресуспензировать осадок в 150µl PB1;
  4. + 150µl PB2 и тщательно смешать, чтобы прошёл полный лизис;
  5. + 210µl PB3, тщательно смешать ~2';
  6. ЦФ 5 – 10';
  7. супернатант нанести на колонку (ЦФ 0.5 – 1.5');
  8. промыть колонку 400µl PB4 (ЦФ ~0.5');
  9. дважды промыть колонку 400µl WB;
  10. убрать элюат из 2ml пробирки-резервуара и высушить колонку центрифугированием 2';

  11. элюция DNA:
  12. поместить колонку в чистую 1.5ml микроцентрифужную пробирку;
  13. нанести на колонку ~30µl EB, инкубировать >1';
  14. центрифугировать 2'.

    Приготовление колонок

    самодельных:
  • у 0.5ml микроцентрифужной пробирки отрезать крышку (оставив соединяющий "хвостик") и проколоть в дне несколько отверстий раскалённой иглой;
  • плотно вставить два стеклянных фильтра GF/F, диаметром 7 mm;
  • для нанесения материала и промывок колонка вставляется в 2ml пробирку с завинчивающейся крышкой (используются многократно);
  • для элюции материала колонка вставляется в 1.5ml микроцентрифужную пробирку с отрезанной крышкой;


  • Последовательные стадии забивки фильтра (1 - 5); колонки с двумя (1 - 5) и одной (6) GF/F мембранами; 2ml пробирки с завинчивающимися крышками, используемые для загрузки и промывки колонок (7, 8) и 1.5ml пробирка для элюции (9). Внизу — круглый резак для вырезания мембран (10).


    на основе коммерческих (Qiagen) колонок:
  • ипользованную мембрану выдавить вместе с уплотнительным колечком (можно использовать разогнутую скрёпку);
  • вымыть уплотнительное колечко и пластиковый корпус раствором детергента и водой (удобнее делать это одновременно для ~сотни колонок);
  • высушить, вставить новую мембрану и зафиксировать её уплотнительным колечком.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 17537

    Растворы

    PB1 (plasmid buffer 1)

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    Глюкоза50mM2.0M0.25ml1.25ml
    EDTA, pH 8.035mM0.5M0.7ml3.5ml
    H2O mQ9.05ml45.25ml

    PB2

    (хранить при NT в плотно закрытой пластиковой посуде):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    NaOH0.2N10N0.2ml1.0ml
    SDS1%10%1.0ml5.0ml
    H2O mQ8.8ml44.0ml

    PB3

    1.25х GuHCl и EDTA смешиваются перед применением; смесь стабильна в течении рабочего дня
    1.25х GuHCl смесь (хранить при NT):
    Guanidine hydrochloride = GuHCl

    Конц.Сток8.0ml40.0ml
    GuHCl5.625M95.53g/M4.30g21.49g
    MES, pH 5.562.5mM1M0.5ml2.5ml
    Этанол25%100%2.0ml10.0ml
    Укс. к-та (лед.)0.3M17.4M0.140ml0.700ml
    H2O mQ2.3ml11.5ml
    непосредственно перед применением смешать 1.25х GuHCl с 0.5M EDTA в соотношении 4:1.
    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    GuHCl смесь1.25х8.0ml40.0ml
    EDTA, pH 8.00.1M0.5M2.0ml10.0ml
    кол-во минипрепов  ~45~225

    MES, pH 5.5, 1M

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    MES (Na)1M217.2g/M2.17g10.86g
    Укс. к-та (лед.)853mM17.4M0.49ml2.45ml
    H2O mQ   

    PB4

    (хранить при 4oС):
    Guanidine isothiocianate = GuSCN

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    GuSCN5M118.16g/M5.91g29.54g
    EDTA, pH 8.00.1M0.5M2.0ml10.0ml
    H2O mQ3.5ml17.5ml

    WB (washing buffer)

    (хранить при NT):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    Этанол80%100%8.0ml40.0ml
    TrisCl, pH7.510mM1M0.1ml0.5ml
    H2O mQ1.9ml9.5ml

    EB (elution buffer)

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    TrisCl, pH8.510mM1M0.1ml0.5ml
    H2O mQ9.9ml49.5ml


    Комментарии

    Общие

  • DNA purification on homemade silica spin-columns. Borodina TA, Lehrach H, Soldatov AV. Anal Biochem. 2003 Oct 1;321(1):135-7.
  • Приведённый протокол выделения плазмидной ДНК - модификация известного щелочного метода "Выделение pDNA (минипреп - лизис щелочью)". Там же можно посмотреть комментарии к пунктам 1 – 6. Принцип очистки на silica: DNA обратимо сорбируется на поверхность стеклянной мембраны в растворе с высокой концентрацией хаотропной соли, примеси отмываются хаотропной солью и 80% этанолом, и очищенная DNA элюируется в буфере с низкой ионной силой.
         На рисунке: плазмидная ДНК размерами 2.5 kbp, 3.0kbp, 5.5kbp и 12kbp выделена из 1.5ml ночной культуры на самодельных колонках с 2 слоями GF/F мембраны.
  • Самодельные колонки обеспечивают такое же качество, как и фирменные: ДНК годиться для сиквенса/ гибридизации, меченья, ПЦР и т.п.
         Тем не менее, нельзя сказать, что очистка на silica полностью безопасна. По крайней мере некоторые рестриктазы работают хуже на очищенной ДНК. На рисунке показано трёхкратное ингибирование EcoRI (дорожки: двукратные разведения рестриктазы EcoRI; панельки: "C" - pDNA очищенная стандартным методом; "F" - pDNA после дополнительной очистки на GF/F колонке; "Q" - pDNA после дополнительной очистки на QIAprep колонке). Рестриктазы имеют разную чувствительность: HindII, EcoRI, SphI, BglI, и NdeI чувствительны к очистке на silica, а BamHI, SacI, NheI — нет. Очень похоже, что причина ингибирования - мелкая стеклянная пыль, которая смывается с мембран. Ингибирование зависит от качества мембраны: одна очень старая (лет пятнадцать) партия GF/F ингибировала EcoRI в десятки раз.
  • Все промывки можно проводить не только на центрифуге, но и с помощью вакуумной промывалки.
  • Характеристики самодельных колонок: ёмкость резервуара 550µl; ДНК связывающая ёмкость - 16(8)µg для 2(1)GF/F мембран; минимальный элюирующий объём - 15µl. Эти же колонки можно использовать для очистки PCR продуктов, очистки DNA из агарозного геля и разделения смеси одноцепочечной и двухцепочечной DNA.
         На рисунке — элюция 5.5 kb плазмидной ДНК разными объёмами буфера EB с QIAprep (Qia) и самодельных колонок (2GF/F и 1GF/F).

  • В колонке используется GF/F мембрана, так как её сорбирующая способность в 3 – 4 раза выше, чем у остальных (GF/A, GF/B, GF/C, GF/D). Рисунок и таблица демонстрируют применение различных типов мембран для очистки pDNA.
  • Мемб.Кол-во слоёвОбщий вес[mg]Размер пор[µm]Кол-во пДНК[µg]
    GF/A8181.61.85
    GF/B4241.03.4
    GF/C8161.27.4
    GF/D4182.72.3
    GF/F6180.750.2
    QIAprep42615.6


    По пунктам

    п. 1.

  • Можно использовать до 2ml ночной культуры. Для больших количеств возникают проблемы с лизисом в (п.4). Их можно преодолеть используя большие объёмы PB1 - PB3 и нанося материал на колонку в несколько приёмов.
  • п. 5.

  • PB3. Нейтрализация раствора в (п.5) протокола происходит за счёт уксусной кислоты, присутствующей в PB3. Её количество подбирается таким образом, чтобы сдвинуть pH смеси PB1 и PB2 до ~5.5. MES введён в PB3 только для того, чтобы сделать протокол устойчивее; в принципе, его можно исключить совершенно безболезненно. MES был выбран из-за того, что он имеет самый кислый pKa среди обычно используемых буферов.
         GuHCl вместе с SDS преципитирует белки, хромосомную ДНК и клеточные мембраны и обеспечивает сорбцию нуклеиновых кислот на стекло.
         Этанол - улучшает сорбцию на стекло и, кроме того, имеет ещё один весьма удобный эффект: чем выше концентрация этанола в PB3, тем компактнее и устойчивее осадок после центрифугирования в (п.6).
         PB3 смешивается из двух компонентов непосредственно перед применением, так как EDTA неустойчив в кислом буфере и с течением времени выпадает в осадок.
  • п. 8.

  • PB4. Буфер состоит из GuSCN и EDTA. GuSCN - более активная хаотропная соль, чем GuHCl. Она отмывает мембрану от тех компонентов, которые оказались устойчивы к GuHCl. EDTA введён для отмывки от одноцепочечных нуклеиновых кислот (Beld M, Sol C, Goudsmit J, Boom R. Fractionation of nucleic acids into single-stranded and double-stranded forms. // Nucleic Acids Res. 1996 Jul 1;24(13):2618-9.). Именно EDTA обеспечивает отмывку от РНК, необратимо денатурированной плазмидной DNA и одноцепочечных фрагментов геномной DNA. В PB1 и PB3 EDTA введён из тех же соображений.
  • п. 9.

  • WB. Это - забуференный 80% этанол. Он используется для того, чтобы отмыть мембрану от хаотропных солей. Tris — необходимый компонент WB, так как чистый 80% этанол денатурирует двухцепочечную ДНК во время промвки.
  • п. 12.

  • EB. Низкосолевой буфер с pH в районе 7.0 - 8.5. В принципе, можно использовать просто воду, но нужно убедиться, что её pH находится в указанных пределах.


  • Приготовление колонок.

  • Если при повторном использовании коммерческих колонок требуется повышенное качество отмывки, можно дополнительно обработать пластик 5% раствором гипохлорида натрия (Prince AM, Andrus L. PCR: how to kill unwanted DNA. Biotechniques. 1992 Mar; 12(3):358-60).


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы

    Alexandra kyiv /01.03.2006 23:45/
    Вопрос: можно ли использовать такие колонки для очистки ДНК после бисульфитной обработки для постановки methilation-specific PCR?



    petr /02.03.2006 00:50/
    В принципе наверное можно, НО! В родном ките от Zymo Research прилагается Desulphonation buffer. Еще я встречал в разных фирмах, что используются разные колонки для разных фрагментов ДНК (по длине). Может оказаться, что если Вы возьмете плазмидную колонку, будут большие потери. Хотя чем черт не шутит, возьмите образец которого не жалко и попробуйте.



    Alexandra kyiv /02.03.2006 23:30/
    Ага... Спасибо. А если попробовать без колонок - например, на SiO2 завязать ДНК, отмыть - тогда, вероятно, потери будут поменее? И ещё - кто продает у нас продукцию Zymo Research и из чего состоит Desulphonation buffer (если кит приобрести не получится)? wall.gif



    Гость /29.01.2008 14:54/
    Сколько процентов ДНК теряется при такой очистке,



    muhryu /03.06.2008 14:46/
    А если взять не GF/F, а GF/C?



    Beta /02.09.2008 12:24/
    Privoditsia sravnenie c QIAprep columns - a chto za filtre v nix, kto znaet i budut li oni rabotat dlia razdelenija single and double stranded DNA?



    metrim /22.11.2015 01:07/
    Можно ли использовать коммерческие или самодельные колонки повторно без замены мембраны, ограничившись только промывкой?



    MMM /22.11.2015 08:12/
    А вы их в азотке конц(65%) подержите минут 10. А потом промойте 90 градусной дист. водой и пркипятите в ней минут 20 в сверх чистой воде. Можно этого и не делать если уверены, что остаточная контаминация предыдущей днк вам не помешает.



    metrim /22.11.2015 23:48/
    Мндя.
    При таком геморое - действительно проще менять мембрану, а пластик - ополаскивать хромпиком.
    Мне пока все это нужно для очистки продукта перед передачей на сиквенс.

    А еще такой вот вопрос: есть шприцевые префильтры со стеклянной мембраной 1µm . Они тоже подходят для таких манипуляций с нуклеиновыми кислотами?








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler