Главная страница MolBiol.ru > Методы > Фаг лямбда > Выделение ДНК Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Выделение ДНК фага лямбда

 
  1. заранее подготовить ночную культуру клеток: 2-3ml LTB/Mg/мальтоза, в 17ml пробирке, бактериальная качалка 200-300rpm, 30oС, ON;
  2. пастеркой выколоть бляшку в 200µl SM + капля хлороформа;
  3. инкубировать 2h на качалке или в холодильнике ON;
  4. к 50µl клеток + 1/2 суспензии фага, 37oС, 30' (не качая);
  5. фаг/клетки -> в 60ml LTB/Mg в колбе V>150ml;
  6. бактериальная качалка 250-300rpm, 6-8h 37oС;
  7. если прошёл "хороший лизис":

  8. + 1ml хлороформа, встряхивать 5';
  9. 54ml среды -> в центрифужную пробирку, охладить до NT;
  10. + DNase и RNase до 5µg/ml (по 27µl стоковых 10µg/µl растворов);
  11. NT, 30';
  12. + NaCl (тв.) до 1М (3.15g);
  13. 0oС, 15';
  14. ЦФ 11kg 4oС, 10';
  15. супер слить через марлю в пробирку с 5.4g PEG 8000;
  16. 0oC 1h;
  17. ЦФ 11kg, 4oС, 10', слить жидкость;
  18. ЦФ еще 3', отсосать остатки жидкости;
  19. осадок ресуспензировать в 400µl STM;
  20. + 400µl хлороформа, трясти 1-2';
  21. ЦФ 2-3krpm, NT, 5';
  22. к cупернатанту добавить:
  23. RNase 10µg/µl 5µl
    DNase 10µg/µl 5µl;

  24. 37oС, 30';
  25. добавить:
  26. EDTA 0.5M до 20mM 16µl,
    ProtK 20µg/µl до 100-200µg/ml 4-8µl,
    SDS 10% до 0.5% 20µl;

  27. 56oС, 1-3h;
  28. охладить до NT, мягко экстрагировать Ф, Ф:Х, Х;
  29. добавить:
  30. AcONH410M 0.1ml,
    EtOH 96% 1.0ml;

  31. вытащить комочек лямбдаDNA типом, прополоскать в 70% EtOH;
  32. подсушить, растворить в 50-100µl H2O или TE.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 10381

    Растворы

    SM

    (хранить при 4oC).

    Конц.Сток10ml50ml100ml150ml
    NaCl0.1M5M200µl1.0ml2.0ml3.0ml
    MgSO4*10mM1M100µl0.5ml1.0ml1.5ml
    Tris Cl, pH7.550mM1M0.5ml2.5ml5.0ml7.5ml
    желатин0.01%2%50µl0.25ml0.5ml0.75ml
    H2O mQ9.15ml45.75ml91.5ml137.25ml

    * - добавлять после автоклавирования,
    Стерилизовать автоклавированием.

    STM

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml
    NaCl10mM5M100µl
    Tris Cl pH8.050mM1M2.5ml
    MgCl210mM1M500µl
    H2O mQ46.9ml


    Комментарии

    По пунктам

    п. 1.

  • Ночную культуру можно хранить 2-4 дня при 4oC
  • Состав среды:
  • * LTB - предпочтительнее, чем богатые среды (LB, SOB), так как клетки растут медленнее и ночная культура не успевает достичь насыщения;
    * Mg - в отсутствии Mg2+оболочка фага лямбда нестабильна;
    * мальтоза - стимулирует экспрессию бактериями мальтозного рецептора (связываясь с этим рецептором фаг лямбда проникает в клетку). Ни в коем случае не используйте среду с глюкозой - катаболитная репрессия приведет к выключению мальтозного оперона.

  • Непроверенная информация Есть сообщение, что включение в ростовую среду 0.3% глицерина существенно (в 10 раз) увеличивает выход фага.
  • Рост. Можно выращивать и при 37oС, но при этом требуется контролировать плотность бактерий, чтобы не допустить перехода клеток в стационарную фазу.
  • п. 2.

  • Для того, чтобы фаг нормально вырос, важно, чтобы бляшка была свежей - не более 2-х дней. Если она старая, лучше пересеять.
  • Капля хлороформа предотвращает грибковый или бактериальный зарост при последующем хранении.
  • п. 3.

  • Такие фаговые культуры надежно хранятся более года. Если требуется обеспечить действительно долгосрочное хранение - лучше добавить DMSO до 7% и заморозить при -70oС.
  • п. 4.

  • Размножение фага лямбда связано с гибелью зараженной им бактериальной клетки. То есть в культуре происходят довольно сложные события: одновременно размножаются и бактерии и фаг. Причем последний при этом губит первых. Странно, но несмотря на такую сложную взаимозависимость можно вполне надежно получать культуры фага лямбда с высоким титром.
  • Во многих методиках написано, что для успешного роста требуется вносить в среду "оптимальное" соотношение фаг:клетки. Однако, в реальной жизни мы ни разу не видели, чтобы причиной неудачного высева была "передозировка" фага. Обратная ситуация, когда в культуре "не прошел лизис" (передозировка клеток), встречается чрезвычайно часто. По видимому, фаг не способен размножаться на клетках, находящихся в стационарной фазе роста.
  • Так что, если есть возможность сразу после выкалывания фага с чашки высеять жидкую культуру, мы поступаем следующим образом:

    1. толстой пастеркой (чтобы захватить прилегающие участки "газона") выколоть бляшку в 200µl SM;
    2. > 2 часа на качалке;
    3. 37oС, 15' без качания;
    4. переходить к п.5.

    п. 5

  • Бедная среда предпочтительнее, нам кажется, что она снижает шансы бактерий перерасти фаг (см. замечание к п.4.).
  • Мальтозу лучше не добавлять. Говорят, что мальтозные рецепторы на оболочках лизировавших бактерий связывают фаг из раствора.
  • п. 6.

  • Культура бактерий должна вначале вырасти до весьма заметной плотности (обычно 5-12h). Затем, в течение относительно короткого (0.5-2 h) времени происходит лизис. Культура становиться практически полностью прозрачной, от бактерий остаётся только преципитат в виде крупных хлопьев или клубка нитей.
  • п. 7.

  • Мы читали, что эта процедура вызывает лизис тех клеток, в которых бактериофаг лямбда уже размножился. Сами мы дополнительного лизиса никогда не видели и добавляли хлороформ по тем же причинам, что и в п.2.
  • В этом месте можно прерваться и оставить колбы на несколько суток при +4oС.
  • п. 8.

  • Охлаждение для того, что бы RNase и DNase работали при NT.
  • п. 9.

  • Эта процедура дублирует п.21. Если DNA фага лямбда не должна быть высокого качества, эти пункты можно опустить. Дополнительное расщепление DNA и RNA введено потому, что за один раз очиститься от этих примесей сложно.
  • п. 11-13

  • На этом шаге осаждаются не лизировавшие клетки и преципитат, оставшийся от лизированных. Перед центрифугированием добавляется NaCl, т.к. это позволяет снять с бактериальных оболочек и перевести в раствор фаг лямбда, прилипший к мальтозным рецепторам.
  • п. 13, 16

  • Можно проводить центрифугирование и при 4.5kg.
  • п. 15

  • Преципитация PEG(ом) бактериофага лямбда.
  • В этом месте можно прерваться и оставить преципитацию на несколько суток при +4oС.
  • п. 16.

  • Если используется угловой ротор, то лучше отметить ту сторону пробирки, где будет располагаться осадок, т.к. он мало заметен.
  • п. 18.

  • В этом месте можно прерваться и оставить суспензию на несколько суток при +4oС.
  • п. 19.

  • Экстракция хлороформом вызывает преципитацию PEG и сохранившихся, не смотря на обработку в п. 11-13, компонентов бактерий.
  • п. 20.

  • Очень (!!!) важно не превышать указанную скорость центрифугирования, иначе фаг лямбда уйдёт в интерфазу. Видимо, при центрифугировании на высокой скорости образуется плотная "подушка" PEG которая может утянуть с собой в интерфазу ~90% лямбда. А лучше даже и указанное центрифугирование проводить в два этапа (сначала 1krpm, а затем 3krpm).
  • п. 21.

  • PEG осаждает не только бактериофаг лямбда, но так же DNA и RNA, от которых нужно избавиться.
  • п. 23.

  • Разрушение белковой оболочки бактериофага.
    1. EDTA - связывает ионы Mg2+ это:
    2. а) останавливает работу DNase из п.21;
      б) дестабилизирует фаговую оболочку.

    3. SDS - денатурация белков (нуклеаз из п.21 и фаговых).
    4. Prot K - расщепление белков (нуклеаз из п.21 и фаговых).


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler