Главная страница MolBiol.ru > Методы > Электрофорез > Агарозный гель-электрофорез Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Агарозный гель-электрофорез

 
    Выбор концентрации агарозного геля

    Выбор % геля

    Особенности работы с низкопроцентными (0.3%) гелями.

    1. в плашку для электрофореза залить "подложку" — слой агарозы 1.5-2.0% толщиной ~2-3 mm, дать застыть;
    2. на этой подложке закрепить гребенку так, чтобы между зубцами и подложкой было расстояние 1-2mm;
    3. залить 0.3% агарозу (лучше в холодной комнате);
    4. гребенку удалять только под слоем буфера, иначе ячейки слипнутся.

    ВНИМАНИЕ! Работать в холодной комнате. Гель очень хрупкий, все манипуляции проводить только вместе с 2% подложкой; не лить буфер на поверхность геля. Низкопроцентные гели особенно чувствительны к перегрузке по количеству DNA на дорожку.


    Разделение линейных молекул

    Диапазон нормального разделения линейных dsDNA молекул для гелей с различной концентрацией агарозы:

    % агарозы0.30.50.60.70.80.91.01.21.52.0
    Размер DNA [kbp]5-601-301-200.8-120.6-100.5-80.5-70.4-60.2-30.1-2

    Меньший предел определяется (в основном) диффузией полосы в геле. Т.е. в гелях с низкой концентрацией агарозы мелкие фрагменты вполне разделяются, но полосы не четкие.

    Верхний предел сильно зависит от напряженности поля, при которой проводится форез. Чем меньше напряженность поля, тем более длинные молекулы можно эффективно разделить.


    Разделение суперскрученных и кольцевых молекул

    К сожалению относительная подвижность линейных и кольцевых молекул зависит от условий фореза: % геля, скорость фореза (в частности, это означает, что нельзя пользоваться линейным маркером для оценки размера кольцевых молекул).

    Приведенная таблица дает некоторое представление о соотношении подвижностей при умеренной (~6V/cm) скорости фореза (в скобках - при более быстром разгоне):

    Размер суперскруч. DNA [kbp] Размер линейной DNA [kbp] для различных % агарозного геля
    0.7%1%1.5%2%
    21.21.31.3 (1.6)1.5 (1.0)
    31.71.82 (2.4)2.9 (1.8)
    42.22.32.7 (3.7)-
    52.72.93.5 (5.5)-
    63.23.55 (8.5)-
    73.94.28.5 (>12)-
    84.45.0>12-
    95.15.9--
    105.86.8--
    1278.7--

    В присутствии 0.5 µg/ml EtBr разрешение релаксированной и суперскрученной pDNA увеличивается примерно в 20 раз при повышении ионной силы буфера до 4хТАЕ. Того же увеличения можно добиться понижая концентрацию EtBr.


    Одноцепочечная DNA

    На 1% агарозном форезе ssDNA бежит чуть быстрее (~10%), чем dsDNA того же размера. ssDNA окрашивается EtBr заметно слабее, чем ds (разница в ~4-5 раз). Tо есть, чтобы полосы имели одинаковую интенсивность окраски, требуется взять ~ в 5 раз больше ssDNA.

    Чтобы разделить цепи, нужно либо непосредственно перед форезом прогреть ~1' 100oC, либо добавить к образцу NaOH до 0.1 М, 5-10' (NT или 37oC);



    Форез при различной напряженности поля

    Напряжённость поля

    При оценке напряженности поля для горизонтального фореза принято пренебрегать конкретной геометрией камеры и измерять расстояние непосредственно между электродами.

    На рисунке показана схема форезов, при разном напряжении. Форезы проводились разное время, так, чтобы 0.5kb фрагмент прошел одинаковое расстояние. Видно, что проведение фореза при высоком напряжении эквивалентно уменьшению длины геля.

    Разумный компромисс между скоростью и качеством фореза для высококачественных или препаративных форезов: ~2V/cm(можно меньше для ON форезов). Для аналитических форезов приемлемое качество сохраняется до ~6V/cm.

    DNA особенно легко теряет EtBr при повышенной температуре (что обычно случается, если гонять форезы при высоком напряжении).

    EtBr при форезе движется от (+) к (-). Если хочется, чтобы он не уходил из геля, лучше ввести его и в форезный буфер.


    Количество DNA, которое можно наносить на дорожку

    Нижний предел определяется используемым методом детекции. Если применяется окрашивание EtBr, то не стоит надеяться увидеть <10ng на 5mm полоску.

    Верхний предел: слишком большое количество DNA на дорожке приводит к двум неприятным эффектам:

    1. изменению подвижности полосы в геле (идёт быстрее). Так что не надо сразу паниковать, когда, например, слишком большое количество pDNA идёт быстрее, чем разбавленная исходная плазмида. (к такому же эффекту может привести и слишком большое количество RNA в препарате pDNA).
    2. при визуальной или при денситометрической оценке количества DNA получаются заниженные оценки (точность совсем низкая, начиная приблизительно с 0.5 µg на 5mm дорожку). Оптимальный диапазон для денситометрического определения: 0.02-0.15 µg на полоску.

    Буфер для внесения

    Присутствие красителя:

    * облегчает внесение в лунку;
    * позволяет иметь представление, где в геле находится фрагмент;

    но в то же время:

    * может мешать наблюдению фрагментов под UV;
    * может оказаться нежелательной примесью при элюции фрагмента из геля.

    Подвижность красителей в гелях с различной концентрацией агарозы:

    % Подвижность красителей
    КЦКрезоловый кр.Бромфен. синийOrangeG
    0.7~10.5 (9-15)~3.8 (3.2-4.5)~0.8 (0.7-1.2)~0.15 (0.1-0.2)
    0.8~8 (7-9)~2.9 (2.7-3.2)~0.5 (0.4-0.6)< 0.25
    1.0~6 (4.8-7)~2.2 (2-2.5)~0.5 (0.4-0.6)< 0.25
    1.5~2.2 (1.8-2.6)~1.0 (0.9-1.3)~0.25<< 0.25
    2.0~0.75 (0.6-0.9)~0.35 (0.3-0.4)< 0.25<< 0.25

    Выбор красителя:

    • Бромфеноловый синий и ксиленцианол — (стоковые растворы 1% в H2O; рабочая концентрация в 1х буфере ~0.005-0.02%) могут заметно мешать наблюдению фрагментов под UV. По нашему опыту, элюция фрагмента в РEG вместе с любым из этих красителей не оказывает заметного влияния на меченье, лигирование и трансформацию.
    • Cresol red (Na соль) — (стоковый раствор 50mM в H2O; рабочая концентрация в 1х буфере ~0.1mM) совместим с ферментативными реакциями, практически не мешает наблюдению под UV.
    • OrangeG — (стоковый раствор 1% в формамиде; рабочая концентрация в 1х буфере ~0.01-0.05%) наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне "рабочей зоны". Заметен под UV.

    Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле. Обычно приводимые в методиках ~0.025% для бромфенолового синего и ксиленцианола (в 1х буфере) по нашему мнению слишком большое количество.

    Лучше иметь на столе

    * буфера с различными красителями.
    * различные разведения буфера для внесения (10х, 2х, 1х). При этом образец любого объема собирается из двух компонентов (буфер+образец), а не из трех (буфер+ вода + образец).
    1x если объем образца < 25%
    2x ==> 25-75%;
    10x ==> 75%

    Буфер для внесения 10х, (хранить при NT).

    Конц.Сток1ml5ml10ml25ml
    SDS0.5%10%50µl250µl500µl1.25ml
    EDTA, pH8.00.1M0.5M0.2ml1.0ml2.0ml5.0ml
    глицерол50%100%0.5ml
    0.625g
    2.5ml
    3.125g
    5.0ml
    6.25g
    12.5ml
    15.63g

    H2O mQ0.25ml1.25ml2.5ml6.25ml


    MolBiol.ru: http://molbiol.ru
    e-mail: redactor@molbiol.ru
    просмотров: 62361


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы

    Гость /11.01.2006 20:33/
    Для оптимального разделения не очень больших фрагментов, можно пользоваться буфером для внесения по рецепту, указанному в каталоге MBI Fermentas:

    6x Orange Loading Dye Solution (#R0631)
    0.2% orange G
    0.05% xylene cyanol FF
    60% glycerol
    60 mM EDTA

    При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый - с 50 bp. Такой подход позволяет оптимизировать рабочее напряжение, а, соответственно, и разделение.

    И еще - я человек в мол.биологии непросвещенный, а потому да простят меня профессионалы, если я скажу всем известную вещь: вносить образцы в лунки гораздо проще, если под камеру подложить листок темной (черной или синей) бумаги, чтобы оттеняла лунки.



    Гость /24.01.2006 14:40/
    Люди, хелп! Если кто-нибудь знает что-то про технологию внесения биополимеров в гель под названием Shark Teeth, напишите, пожалуйста!



    mesentsev /24.01.2006 17:08/
    А почему бы заодно не добавить в текст, что рабочая концентрация бромистого этидия, например, 0,5 мкг/мл и что его можно добавлять прямо в гель, что гель с добавленным в него EthBr спокойно стоит ночь под электродным буфером без заметного вымывания из него краски? Полезные, вобшем-то факты, хоть и мелкие, но, с моей точки зрения, вполне не лишние.



    Re /24.01.2006 19:16/
    (Гость @ 24.01.2006 11:40)
    Ссылка на исходное сообщение  Люди, хелп! Если кто-нибудь знает что-то про технологию внесения биополимеров в гель под названием Shark Teeth, напишите, пожалуйста!

    Акульи зубы - не гель. а гребенка в виде этих самых зубок. Втыкается в гель, и не вынимается, а образец наносится тонким-тонким носом в дырки между зубами. См. инструкцию к Макрофору. Только это не про агарозный форез.



    Гость /25.01.2006 13:42/
    2Re: что это гребенка такая, я знаю... Только сейчас вижу, что по формулировке моего вопроса кажется, будто это гель так называется:) Все, спасибо, уже поздно:) Только по моим данным, это имено про форез. Не знаю уж, про агарозный или ПААГ, по-моему, в данном случае не суть важно



    Oligolamer /30.05.2006 15:09/
    Народ, а какова длина волны для визуализации ПЦР-фрагментов?
    Я так понял, если окрашивают этидиум бромидом - то и Агарозный или ПААГ гель-электрофорез - всё равно?

    Хм, нашёл ответы на свой вопрос:
    ПДРФ и сиквенс ( http://molbiol.ru/forums/lofiversion/index.php/t3529.html )
    вопрос про трансиллюминаторы ( http://molbiol.ru/forums/lofiversion/index.php/t4931.html )
    Трансиллюминаторы ( http://molbiol.ru/forums/lofiversion/index.php/t22011.html )

    Лучше читать последнюю.



    Totty /25.09.2006 23:49/
    народ, а как точно называется маркер мол веса (лестница)? и куда, как ее наносить?



    :) /26.09.2006 11:35/
    а почему в гел Этьбромид а не GelStar ? GelGreen ? GelRed ? SYBRSafe ?

    а почему ТБЕ ТАЕ а не SB (sodium borate) ?

    а почему UV а не Blue ( Safe Imager , Dark Reader , FlashGel)


    А ПОКОЧАНУ smile.gif))))



    :) /26.09.2006 11:40/
    ответ от радио Molbiol - Не выпендрюйся Василий Иваныч-слушай свои "Валенки" smile.gif



    :) /27.09.2006 12:53/
    1: Biotechniques. 2004 Feb;36(2):214-6. Links

    Erratum in:
    Biotechniques. 2005 Jan;38(1):60.
    Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis.

    * Brody JR,
    * Kern SE.

    Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA.

    PMID: 14989083 [PubMed - indexed for MEDLINE]



    :) /27.09.2006 12:54/
    All: 1
    Review: 1
    [Click to change filter selection through My NCBI.]

    1: Electrophoresis. 2001 Mar;22(5):814-28.Click here to read Links
    A whole new way of looking at things: the use of Dark Reader technology to detect fluorophors.

    * Seville M.

    Clare Chemical Research, Inc, Denver, CO 80206, USA. mseville@clarechemical.com

    The Dark Reader optical system (Clare Chemical Research, Denver, CO, USA) uses relatively low intensity broad-band visible blue light in combination with broad-band optical filters to detect fluorescence with a level of sensitivity that often surpasses that of UV transilluminators and can rival that of laser-based scanners. Applications of DR (Clare Chemical Research) devices include the detection of DNA and SYBR-stained protein samples following, and also during, electrophoresis. Unlike laser-based imaging systems, the fluorescence is directly visible to the user as well as being fully compatible with charge-coupled device (CCD) and Polaroid camera-based detection and imaging. Additionally, the DR optical system functions well in multicolor fluorophor environments. Because the Dark Reader does not emit any UV light, the extent of DNA damage incurred when visualizing DNA samples is drastically reduced compared to the damage produced by a UV device and this can have a significant benefit on downstream cloning protocols. Furthermore, dye photobleaching is minimal, extending the length of time that a fluorescent sample is visible. The inherent flexibility of the DR optical system allows many different configurations of the Dark Reader to be constructed such as transilluminators, hand lamps and integrated transilluminator-electrophoresis units.

    PMID: 11332748 [PubMed - indexed for MEDLINE]



    :) /27.09.2006 13:01/
    Today's Featured Review
    Biotium GelRed



    Nucleic Acid dye

    Until recently Sybr green had been our labs nucleic stain of choice. We have, however, recently migrated to Biotium’s GelRed. GelRed is a newer nucleic acid gel stain that is safer and more temperature stable than other dyes. GelRed is safer because it is non mutagenic and is diluted in water. It is more thermostable than Sybr dyes because it does not degrade with repeated freeze-thaws or long storage (couple months at RT) and can be stored at room temperature, and sensitivity seems to at least equal if not exceed Sybr green when visualized with UV transilluminator.

    The dye is used similarly to Sybr dyes with staining (available at 10,000X ) or direct sample additions. The technology is not particularly ground breaking or new but the safety profile of this product makes it a viable alternative to potentially more dangerous dyes.

    Review by Vitelli
    Join Today
    Scientific & Medical Experts Needed!



    :) /27.09.2006 13:06/
    Using GelGreen 'In-Gel'
    GelGreen DNA used in-agarose and viewed on a Dark Reader transilluminator Save Time......
    GelGreen can be added to the agarose just before pouring a gel. DNA bands are stained almost immediately and there is no need to incubate in a bath of stain after electrophoresis.

    Save even more Time......
    Because GelGreen is very stable in aqueous solution, it is possible to make up and store agarose containing GelGreen for immediate use at a later date. Left; DNA samples separated using agarose containing GelGreen and viewed on a Dark Reader transilluminator.

    GelGreen Safety
    GelGreen is among the safest of the nucleic acid stains. Based on the Ames test, GelGreen shows no mutagenic effects on bacterial strains TA98 and TA1537 both with and without metabolic activation. Download the Biotium safety report here.
    GelGreen versus SYBR Safe
    GelGreen is more sensitive than SYBR Safe GelGreen is 2 - 3 times more sensitive than SYBR Safe. Using GelGreen in-agarose, it is possible to detect about 0.5 ng of dsDNA by eye and about 0.2 ng using a CCD camera.



    :) /27.09.2006 13:17/
    FlashGel™ DNA System
    Home > Research Products > Electrophoresis > Nucleic Acid Electrophoresis > FlashGel™

    The FlashGel System is the fastest way to separate DNA and the only way to watch DNA migration as it happens. This revolutionary new tool separates DNA in 2 – 7 minutes. Monitor gel runs right at the bench, without UV light. The highly sensitive system allows a 5X reduction in DNA levels – saving both time and money.

    * Get results in 5 minutes or less.
    * Watch DNA migrate at your bench, in real-time without UV light.
    * Enjoy outstanding resolution and exquisite sensitivity.

    The FlashGel System consists of enclosed, disposable, precast agarose gel cassettes and a combination electrophoresis and transilluminator unit.

    * FlashGel Cassettes contain precast, prestained agarose gels and buffer – no need for gel preparation, buffer addition or gel staining.
    * The FlashGel Dock is an electrophoresis apparatus with a built-in transilluminator that provides both separation and detection.

    See FlashGel Run!



    :) /27.09.2006 13:23/
    это все называется "ДНК технология" - не путайте с одноименной фирмой smile.gif



    Ameba /30.04.2007 19:03/
    всем привет.
    вопрос: какие установки нужны для источника питания Эльф кроме вольтажа на см ванночки. Т.е. какие цифры в Амперах и Ваттах надо устанавливать???
    спасибо



    varvarka /23.07.2007 22:14/
    Здравствуйте!
    Есть ли у кого-нибудь что-то по типу таблицы, выражающей зависимость подвижности красителей(бромфеноловый синий и ксилен цианол) от процентности агарозного геля? Какому размеру фрагментов они соответствуют при разделении в 0,7%, 0,8%, 1%, 2% и 3% геле? Заранее спасибо ответившим, особенно ответившим правильно wink.gif mol.gif



    varvarka /23.07.2007 22:17/
    "...При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый - с 50 bp..."

    а при какой процентности геля? Я так понимаю, как мигрируют красители именно от этого и зависит



    Alexkiev /25.07.2007 14:44/
    Как лучше выделить днк 200п.н. из геля для последующей амплификации. Скорее всего малая концентрация? Спасибо



    guest: ммм /25.07.2007 16:56/
    --Заранее спасибо ответившим, особенно ответившим правильно

    --...При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый - с 50 bp..."

    --а при какой процентности геля? Я так понимаю, как мигрируют красители именно от этого и зависит.

    Вроде красители в агарозе мигрируют на одно и тоже Rf не зависимо от процентности.

    А вот фрагменты сильно зависимо от процентности.

    Берете 2 маркера 100b и 1000b и в разных процентностях агарозы гоните с красителями и очень хорошо определяете, что с чем бежит.

    3 процентный агароз вам уже трудно будет растворить. Я так дУмаю-у<c>



    Ъ /25.07.2007 18:24/
    (Alexkiev @ 25.07.2007 14:44)
    Ссылка на исходное сообщение  Как лучше выделить днк 200п.н. из геля для последующей амплификации. Скорее всего малая концентрация? Спасибо

    Мне кажется это лишняя работа элюировать ДНК из геля для последующей амплификации. Срез геля в воду, заморозить-разморозить и 1-2 мкл на ПЦР. Вы реамплифицируете кг.



    Alexkiev /26.07.2007 14:46/
    (Ъ @ 25.07.2007 18:24)
    Ссылка на исходное сообщение  Мне кажется это лишняя работа элюировать ДНК из геля для последующей амплификации. Срез геля в воду, заморозить-разморозить и 1-2 мкл на ПЦР. Вы реамплифицируете кг.


    Спасибо, попробую на следующей неделе. А что если уже выделил из геля с помощью QG и при исходнике с приблизительной количеством 50 нг получил 40 мкг в 40 мкл. На форезе 1,2% в 10 мкл пробы ясен перец ничего не видно, агароза супер. Поставил на ПЦР, отправил 20 мкл в смесь, жду результатов. Сколько приблизительно может быть продукта? Спасибо



    Guest /27.07.2007 00:16/
    Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка??
    Вопрос 2: Кстати, знает ли кто-нибудь можно ли полученный продукт из ПЦР, точнее всю смесь после реакции ПЦР (уже полученная вставка, с конц. 1нг в 1 мкл, праймеры, нуклеот., полимераза, вода...), разделить на двое (по 25мкл) и довести оба эппендорфа до 50 мкл, добавив dNTP, праймеры, полимеразу... и запустить реакцию по новой, тем самым обезвредив концентрацию пирофосфатов... и в результате получить больше нужного продукта? ПЦР не дает внушительного количества. Спасибо



    Lesha /07.05.2009 12:21/
    Если требуется разделить суперскрученный и линейный 3kbp вектор, лучше использовать ~1% агарозу (в 2% линейная ДНК идет очень близко к суперскрученной, в 0.7% -- близко к релаксированной).

    Если требуется проконтролировать циклизацию 3kbp фрагмента, то надо использовать 2% агарозу.



    RJ Dio /08.05.2009 14:09/
    (Guest @ 27.07.2007 01:16)
    Ссылка на исходное сообщение  Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка??
    Вопрос 2: Кстати, знает ли кто-нибудь можно ли полученный продукт из ПЦР, точнее всю смесь после реакции ПЦР (уже полученная вставка, с конц. 1нг в 1 мкл, праймеры, нуклеот., полимераза, вода...), разделить на двое (по 25мкл) и довести оба эппендорфа до 50 мкл, добавив dNTP, праймеры, полимеразу... и запустить реакцию по новой, тем самым обезвредив концентрацию пирофосфатов... и в результате получить больше нужного продукта? ПЦР не дает внушительного количества.  Спасибо

    если у Вас не нарабатывается большое кол-во продукта (20 нг в мкл и выше), дело уж конечно не в пирофосфатах- откуда бы им взяться, коли буквы не включились в амплификат (его мало)? Скорее всего проблемы с праймерами- посмотрите, нет ли "бомбы" (димер праймеров) внизу, или полимераза дохнет, что вря ли. Если проблема не лечится "в лоб", то просто замешайте исходно большой объем смеси, грубо говоря, накопите продукт экстенсивным путем, и всех делов.



    Ъ /08.05.2009 14:59/
    (Guest @ 27.07.2007 00:16)
    Ссылка на исходное сообщение  Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка??
    Вопрос 2: Кстати, знает ли кто-нибудь можно ли полученный продукт из ПЦР, точнее всю смесь после реакции ПЦР (уже полученная вставка, с конц. 1нг в 1 мкл, праймеры, нуклеот., полимераза, вода...), разделить на двое (по 25мкл) и довести оба эппендорфа до 50 мкл, добавив dNTP, праймеры, полимеразу... и запустить реакцию по новой, тем самым обезвредив концентрацию пирофосфатов... и в результате получить больше нужного продукта? ПЦР не дает внушительного количества.  Спасибо

    Я наверное перегрелся на солнцепёке (отпуск все-таки) - не понимаю в чем проблема confused.gif плазмида или вставка, одна пара праймеров... confused.gif По классике в ПЦР сильнее амплифицмруется всегда более короткий фрагмент... Без бутылки не разберешься, дождусь вечера. smile.gif



    guest: dragon /08.07.2009 09:55/
    Здравствуйте, подскажите чем красить агарозный гель после щелочного электрофореза? И на какой стадии (до или после фиксирования в кислоте). Обязательно ли сушить?
    Спасибо



    guest: ммм /08.07.2009 12:08/
    -Здравствуйте, подскажите чем красить агарозный гель после щелочного электрофореза?

    Бромий этидием или сибирским зеленым и иже с ними

    -до или после фиксирования в кислоте.
    После нейтрализации
    -Обязательно ли сушить?
    нет



    Guest /22.07.2009 22:15/
    "если я скажу всем известную вещь: вносить образцы в лунки гораздо проще, если под камеру подложить листок темной (черной или синей) бумаги, чтобы оттеняла лунки"

    Чем тогда думали в Сигма, если сделали столик в камере для фореза из белого пластика, к тому же скользкого smile.gif



    Dmitry S /24.07.2009 11:19/
    (Guest @ 23.07.2009 02:15)
    Ссылка на исходное сообщение   ...если сделали столик в камере для фореза из белого пластика, к тому же скользкого smile.gif


    в первом случае можно наклеить синей изоленты под место, где карманы)) Но от скольжения избавиться сложно - гель частенько уплывает от любых дуновений во время фореза. хоть гвоздями прибивай



    Бору /16.06.2010 17:24/
    Можно ли заменить ТВЕ-буфер на Трис-СІ+EDTA для фореза ДНК, и какой молярности?



    -Ъ- /16.06.2010 18:19/
    (Бору @ 16.06.2010 18:24)
    Ссылка на исходное сообщение  Можно ли заменить ТВЕ-буфер на Трис-СІ+EDTA для фореза ДНК, и какой молярности?

    За Трис.НСI в форезном буфере ставлю кол. no.gif



    Бору /16.06.2010 18:37/
    Борная кислота испорчена у нас.
    Мож трис-ацетат тогда приготовить? Только порошок все равно 2в1 - Трис-СІ, других Трисов нет...



    genseq /17.06.2010 08:49/
    (Бору @ 16.06.2010 16:37)
    Ссылка на исходное сообщение  Борная кислота испорчена у нас.
    Мож трис-ацетат тогда приготовить? Только порошок все равно 2в1 - Трис-СІ, других Трисов нет...


    Похоже, это ко мне jump.gif . Поставляем наборы готовых гелей для электрофореза ДНК, рассчитанные на использование в ПЦРных лабораториях. В каждый комплект входит пузырёк ТАЭх20 (50 мл) для приготовления литра электрофоретического буферного раствора (EtBr 0,5 мкг/мл). Если нужно, то эти пузырёчки можно продавать и без гелей rolleyes.gif . Если интересно, то пишите. Ели реклама здесь неуместна, то удалите.



    Файл/ы:

    Скачать файл ГОТОВЫЕ_ГЕЛИ_05.pdf
    Размер:: 19.19к
    кол-во скачиваний: 1304




    -Ъ- /17.06.2010 11:40/
    (Бору @ 16.06.2010 19:37)
    Ссылка на исходное сообщение  Борная кислота испорчена у нас.
    Мож трис-ацетат тогда приготовить? Только порошок все равно 2в1 - Трис-СІ, других Трисов нет...

    Ну как может испортиться борная кислота? confused.gif Купите тогда в аптеке.
    Только ТРИС.ОН. Никаких CI- и Na+ в буфере для фореза.
    5 mM борат тоже годится в качестве буфера для агарозного фореза. Читайте выше или поищите по форуму.



    Бору /17.06.2010 13:02/
    Борная кислота старая и "Ч." по квалификации чистоты. Надо заказывать новые реактивы.



    -Ъ- /18.06.2010 12:04/
    (Бору @ 17.06.2010 14:02)
    Ссылка на исходное сообщение  Борная кислота старая и "Ч." по квалификации чистоты. Надо заказывать новые реактивы.

    Могу отсыпать сухой (белый порошок) ТВЕ. И дам пропись как самому готовить. Но про Трис.НСI для фореза - забудь. Лучше водопроводную воду...



    genseq /21.07.2010 21:22/
    (-Ъ- @ 18.06.2010 10:04)
    Ссылка на исходное сообщение  Но про Трис.НСI для фореза - забудь. Лучше водопроводную воду...


    Забудьте и про Трис-HCl, и про все прочие буферы на основе Триса. Наиболее продвинутые пользователи за бугром переходят на Li-борат и Li-ацетат. Давно хотел попробовать карбонатный буфер, но всё руки не доходили. Недавно дошли. Приготовили Li-карбонатный буфер. Форезы получаются отлично! При 10V/см ни перегрева, ни закисления или защелачивания. Очень рекомендую!



    mrotzek /21.07.2010 21:27/
    (genseq @ 21.07.2010 22:22)
    Ссылка на исходное сообщение  Забудьте и про Трис-HCl, и про все прочие буферы на основе Триса. Наиболее продвинутые пользователи за бугром переходят на Li-борат и Li-ацетат. Давно хотел попробовать карбонатный буфер, но всё руки не доходили. Недавно дошли. Приготовили Li-карбонатный буфер. Форезы получаются отлично! При 10V/см ни перегрева, ни закисления или защелачивания. Очень рекомендую!



    * ubMed will retrieve 2 records.

    J Virol Methods. 2010 May 13. [Epub ahead of print]
    Fast short-fragment PCR for rapid and sensitive detection of shrimp viruses.

    Mrotzek G, Haryanti, Koesharyani I, Tretyakov AN, Sugama K, Saluz HP.

    Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology, Hans Knoell Institute, Beutenbergstrasse 11a, 07745 Jena, Germany; Friedrich-Schiller-University, Jena, Germany.
    Abstract

    This article describes a fast short-fragment PCR method for the detection of white spot syndrome virus (WSSV), infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV), and monodon baculovirus (MBV). Fast two-temperature (95 degrees C denaturation and 60 degrees C annealing/extension) PCRs were performed in 5-10mul volume samples in miniaturized microplates using a fast Peltier thermal cycler. 40 cycles were completed in 25-30min. Rapid high-resolution agarose gel electrophoresis of 70-150bp PCR fragments was performed in 10min. High sensitivity of PCR product detection (50-100pg) was obtained using ultra sensitive dyes such as GelStar(®) and a gel documentation system equipped with a blue-light transilluminator. This novel method is faster and more sensitive than its TaqMan(®) real-time PCR counterparts. Copyright © 2010. Published by Elsevier B.V.



    Tom1 /21.07.2010 21:29/
    да уж сам себя не похвались как оплеванный ходишь......©
    Такие времена....©



    mrotzek /21.07.2010 21:30/
    (Tom1 @ 21.07.2010 22:29)
    Ссылка на исходное сообщение  да уж сам себя не похвались как оплеванный ходишь......©
    Такие времена....©


    Томычь - получишь по морде smile.gif



    mrotzek /21.07.2010 21:33/
    (Tom1 @ 21.07.2010 22:29)
    Ссылка на исходное сообщение  да уж сам себя не похвались как оплеванный ходишь......©
    Такие времена....©


    Кстати - тебе не лень баблоебством заниматся на www.molbiol.ru ? smile.gif



    Tom1 /21.07.2010 21:42/
    Лень просто себя ломаю....
    Такие времена....©



    achiffa /23.09.2011 11:25/
    Подскажите, в чем можно мыть агарозные гели. Раньше мыла в ванночках для проявки фотографий, а сейчас их нет. Может, продаются специальные емкости?



    guest: ммм /23.09.2011 11:44/
    Чашки Петри Вот она наша ванночка. А так иже коробочки и под маргарина и ПП контейнеры для холодильника.



    basil2 /23.09.2011 12:27/
    (guest: ммм @ 23.09.2011 12:44)
    Ссылка на исходное сообщение  Чашки Петри Вот она наша ванночка. А так иже коробочки и под маргарина и ПП контейнеры для холодильника.

    ... и не забыть добавить фейри!
    В деревне Виллариба трагедия: горят их конопляные поля. А деревне Виллабаджио праздник! Ветер дует в их сторону! (с)



    RJ Dio /23.09.2011 13:25/
    зачем мыть? Что мыть? А потом что? Не понял ничего. Новые высокие технологии?



    achiffa /25.09.2011 11:51/
    Если красить в этидии после фореза и потом промыть, чтобы не было излишнего перекрашивания фона. Понятно, все используют подручные средства. smile.gif



    Daemonarchestratygos /25.09.2011 14:02/
    Прикреплённое изображение\\\\\



    Beauveria /20.07.2012 17:18/
    Доброго времени суток!
    Очень прошу полить свет на чудеса, которые у меня происходят: сегодня впервые сама от начала до конца готовила все, что нужно для фореза: и TAE 50хи 1х, и гель тоже.
    Гель получился какой-то страшный, мутный бурого цвета. И, что самое обидное, ничего в нем не светится. В процессе всей этой возни выяснилось, что все это бурое загрязнение из геля можно выгнать все тем же форезом, даже леддер засветился в какой-то момент. Но до приемлимого уровня гель можно было бы очистить, разве что, за ночь. Попробовала три варианта агарозы, все равно мутнеет.
    Очень прошу объяснить мне природу всей этой ерунды и рассказать, как с этим бороться.



    guest: ммм /20.07.2012 21:06/
    Как же вам рассказать. если вы не рассказываете что и как делаете.



    Kost /12.03.2014 13:18/
    Что за газ в буфере (TAE) выделяется при электрофорезе?



    Агроном /12.03.2014 15:25/
    водород и кислород



    максимушка /02.04.2014 09:42/
    как приготовить акриламидный гель (от 6 до 12%), предназначенного для анализа ДНК?



    LMP /02.04.2014 10:01/
    (Beauveria @ 20.07.2012 15:18)
    Ссылка на исходное сообщение  Доброго времени суток!
    Очень прошу полить свет на чудеса, которые у меня происходят:


    кто производитель агарозы?
    Чешская агароза 80-х годов со старых складов иногда так себя ведет...



    LMP /02.04.2014 10:06/
    (максимушка @ 02.04.2014 07:42)
    Ссылка на исходное сообщение  как приготовить акриламидный гель (от 6 до 12%), предназначенного для анализа ДНК?

    http://microbiology.ucdavis.edu/heyer/prot.../dna%20page.pdf ( http://microbiology.ucdavis.edu/heyer/protocols/dna%20page.pdf )
    /через гугл - 2 мин./




    ---