Главная страница MolBiol.ru > Методы > Электрофорез > Приготовление агарозного геля Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Заливка агарозного геля

 
  1. взвесить необходимое количество агарозы (после взвешивания весы на "0" не сбрасывать);
  2. долить буфер до нужного объёма (измерять по весу; объём, занятый агарозой вы учитываете, не сбрасывая на "0" в п.1);
  3. сбросить весы на "0" (но не выключать, они ещё понадобятся в п.5);
  4. агарозу довести до кипения, кипятить 30-60'' (вынимать из микроволновой печи осторожно - может резко вскипеть);
  5. банку на весы, довести вес до "0" добавляя H2OmQ (осторожно - может резко вскипеть);
  6. остудить до 50-60oС (можно спокойно держать банку в руках), лучше с покачиванием;
  7. (дополнительно - для сборных плашек) "пролить" спейсеры, дать агарозе застыть в течение 2-4';
  8. залить плашки, дать агарозе застыть в течение 0.5-1h;
  9. либо использовать плашки в течение ~2h, либо не вынимая гребёнку завернуть в SaranWrap (SaranWrap накладывать на гребёнку свободно, без натяжения, иначе он её "перекосит"), и убрать в холодильник (можно хранить в течение месяца; для <1% гелей вынимать гребенку из геля можно лишь непосредственно перед применением.).

    Расход геля для различных типов плашек

    сборная плашка 11х11см2110-140ml
    мягкая крышка "Techne"~90ml
    крышка от иммунологического планшета~30ml


    Форезная камера

  • Форезные камеры бывают двух типов: с двумя или с одним платиновым электродом.
  • * камеры с двумя платиновыми электродами можно подключать к источнику напряжения в любой полярности.
    * камеры с одним - только одним способом!!! Обычно на таких камерах указана полярность подключения. Будьте внимательны.

  • Подготовка камеры:
    1. мыть губкой, смоченной детергентом;
    2. сполоснуть раз 10 водопроводной водой;
    3. сполоснуть раза 2-3 дистиллятом.
  • Форезные камеры имеют два уязвимых места:
  • * сравнительно легко при мытье отодрать платиновый электрод;
    * если при споласкивании или переносе держать камеру за один бортик, то в этом бортике появится трещина.



MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 21497

    Дополнения, комментарии, вопросы

    mesentsev /17.08.2006 22:35/
    А это нормально, когда в описании электрофоретического метода отсутствует рецептура приготвления буферных растворов?



    mesentsev /17.08.2006 22:36/
    50x TAE Buffer (Tris-Acetate-EDTA)
    242 gm Tris base
    57.1 ml Acetic acid
    100ml 0.5M EDTA

    Add ddH2O to 1 liter and adjust pH to 8.5.



    mesentsev /17.08.2006 22:37/
    10x TBE Buffer (Tris-Borate-EDTA)
    108 gm Tris base
    55 gm Boric acid
    9.3 gm Na4EDTA

    Add ddH2O to 1 liter.

    The pH is 8.3 and requires no adjustment.



    guest: ant /18.08.2006 08:41/
    SB ( sodoum borate) smile.gif)

    Ultrafast COLD buffer - gel in 5 min smile.gif))

    Sigma - Bionic Buffer

    see Paper Biotechniques


    Low Cost smile.gif))



    guest: ant /18.08.2006 08:48/
    sb+GelStar

    +DarkReader ( blue transilluminator)

    and you see Real-Time agarose gel DIREKTLY !!!!!!!!

    on YOUR WORKING PLACE !!!!!!!!!

    NO DARK ROOMS !!!!!!!!!!

    5 min AND YOU SEE !!!!!!!!!!! results smile.gif))

    by using ORANGE Glasses



    guest: ant /18.08.2006 08:53/
    in SB
    you can Run agarose at 30V/cm at room temp smile.gif)



    guest: ant /18.08.2006 09:01/
    Display Show
    All: 1
    Review: 1
    [Click to change filter selection through My NCBI.]

    1: Anal Biochem. 2004 Oct 1;333(1):1-13.Click here to read Links
    History and principles of conductive media for standard DNA electrophoresis.

    * Brody JR,
    * Kern SE.

    Department of Oncology, The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center at The Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD 21231, USA.

    DNA electrophoresis has been a dominant technique in molecular biology for 30 years. The foundation for this common technique is based on a few simple electrochemical principles. Electrophoretic DNA separation borrowed from existing protein and RNA techniques developed in the 1950s and 1960s. For 30 years, common DNA electrophoretic conductive media remained largely unchanged, with Tris as the primary cation. DNA electrophoresis relies simply upon the negative charge of the phosphate backbone and the ability to distribute a voltage gradient in a sieving matrix. Nevertheless, the conductive properties in DNA electrophoresis are complicated by choices involving voltage, electric current, conductivity, temperature, and the concentration and identity of the ionic species present. Differences among the extant chemical recipes for common conductive media affect central properties. Tris-based buffers, even in optimal form, create a runaway positive feedback loop between heat generation and retention, temperature, conductivity, and current. This is undesirable, leading to limitations on the permissible electric field and to impaired resolution. Recently, we developed low-molarity conductive media to mitigate this positive feedback loop. Such media allow for application of a higher electric field. Applications of DNA electrophoresis can now be reengineered for lower ionic strength, higher field strengths, and lower requirements for heat dissipation.

    PMID: 15351274 [PubMed - indexed for MEDLINE]



    chlamy /20.04.2007 21:00/
    запаритесь pH подводить..



    curious67 /21.04.2007 21:46/
    а в чем проблема, собственно? Прописей нет на сайте? Ужас какой! Ну, в Маниатисе есть, я вообще не вижу смысла выкладывать банальные прописи, разве что действительно оригинальное, которое нигде (ил по крайней мере трудно) найти нельзя



    MirnyiAtom /12.10.2007 15:49/
    Сегодня услышал, что вроде как TAE буфер при нагревании (в отличие от ТБЕ) "неустойчив" и что чтобы все было ок, следует агарозу растворять в воде, а потом в этот раствор добавлять ТАЕ (50х).
    Прокомментируйте пожалуйста, я не понимаю-не могу догадаться какие могут быть причины подобного поведения confused.gif



    Yuri K /12.10.2007 16:13/
    (MirnyiAtom @ 12.10.2007 15:49)
    Ссылка на исходное сообщение  Сегодня услышал, что вроде как TAE буфер при нагревании (в отличие от ТБЕ) "неустойчив" и что чтобы все было ок, следует агарозу растворять в воде, а потом в этот раствор добавлять ТАЕ (50х).
    Прокомментируйте пожалуйста, я не понимаю-не могу догадаться какие могут быть причины подобного поведения  confused.gif

    I guess, if you boil it for like half an hour some acetic acid will evaporate.

    Don't forget to be very, very precise with volumes, as the Dogma demands: "57.1 ml Acetic acid" ;-)))))



    YuryK /12.10.2007 16:36/
    Не знаю, я миллион раз кипятил агарозу в ТАЕ, и всё ок. При этом кипячу хорошо, чтобы небыло неровностей геля.

    P.S. Я другой ЮрийК smile.gif))



    Айзек /19.11.2014 14:21/
    Добрый день, может быть кто-нибудь сможет помочь мне с моей проблемой. Довольно часто приходится готовить агарозный гель, и каждый раз проблема с его кипячением. Я отвешиваю агарозу и буфер в колбу, ставлю в микроволновку, а в ней смесь начинает дико кипеть и выливается из довольно таки высокой колбы. При этом растворяется агароза не очень хорошо, и нужно ещё много раз дать смеси закипеть. Я бы думал, что так оно и должно быть, если бы в предыдущей лабе, в которой я работал, не было всё очень просто. Смесь кипела, но не поднималась, я давал ей покипеть некоторое время и всё растворялось. На самой маленькой мощности СВЧ пробовал делать, та же история.



    ship /19.11.2014 15:23/
    попробуйте плавить в банке с плотнозавинчивающейся крышкой.



    MMM /19.11.2014 16:20/
    ship! Ну хоть бы смайлик поставил.

    Айзек! А вы не пробовали плавить/варить на водяной бане на электроплитке?

    А еще водяную баню можно организовать даже в микроволновке для этого надо колбу с агарозой погрузить в стеклянный(или ПП) стакан с водой.



    Flyamer /19.11.2014 17:15/
    Или делать гель не в высокой колбе, а, наоборот, в широком стакане, тогда кипеть будет, но выливаться - нет.
    А плотно некоторые завинчивают, кстати, быстрее закипает и температура чуток повыше - лучше растворяется. Но банка должна быть хорошая, и надо следить, чтобы не прокипятить слишком долго smile.gif



    MMM /19.11.2014 19:18/
    --А плотно некоторые завинчивают, кстати, быстрее закипает и температура чуток повыше - лучше растворяется. Но банка должна быть хорошая, и надо следить, чтобы не прокипятить слишком долго

    До поры, до времени!



    R.J.Dio /20.11.2014 14:47/
    не надо тничего никуда ставить, стакан с водой лдостаточно поставить РЯДОМ с колбой. Смысл в влажности воздуха ведь, в парциальном давлении паров воды, чтоб не выкипало



    MMM /20.11.2014 15:19/
    не надо тничего никуда ставить, стакан с водой лдостаточно поставить РЯДОМ с колбой.
    Достаточно.
    Смысл в влажности воздуха ведь, в парциальном давлении паров воды, чтоб не выкипало.

    Не, смысл в том, что эта масса воды поглощает мощность СВЧ-поля на свой разогрев. И тем самым агарозка греется мееедленнеее.



    R.J.Dio /20.11.2014 15:27/
    ничего подобного!!! Проверено многократно. когда агароза доходит до кипения, она все равно НЕ выплевывает НИКОГДА, если РЯДОМ стакан, так что мощность ни причем. Положите вместо стакана с водой что-нить аналагичное, чтоб грелось и не мешало, то есть неметалл той же массы, типа картошки кучку. Выкипит за милу душу



    guest: ммм /20.11.2014 22:15/
    Не могу я этого проверить у меня не выкипает,
    даже без стакана. Наверное слишком маленькая и пары в ней накапливаются быстрее smile.gif



    Flyamer /20.11.2014 22:19/
    Ну, если про пары речь, то, конечно, НЕ открывать микроволновку, пока не закипит, должно помочь smile.gif



    R.J.Dio /21.11.2014 11:22/
    все просто- практика- критерий истины. пробуйте со стаканом и без. а можно и внутрь (но тогда точно выкипит smile.gif)



    NMR-guy /22.11.2014 23:12/
    Смените микроволновку - если нагрев сверху, то пузыри автокаталитическим образом будут всегда перегреваться при значимом поднятии над уровнем в колбе, экранируя собой основную массу жидкости внизу. Вам нужна микроволновка с излучателями снизу или сбоку.



    R.J.Dio /23.11.2014 14:13/
    как правило, нужна большая микроволновка. Как ни смешно, это проблема, птому как часто помимо банок с агарозой, туда суют колбы агаром, а они не проходят по высоте. Но европейский рынок микроволновок, в отличие от американского, практикует какой-то странный формат изделий, они все низкие, даже если по объему приличные, словом, надо еще поискать соответствующую модель.



    вова098 /23.11.2014 19:22/
    вааще улыбнола наюкоемкость обсуждения процесса варки агарозы smile.gif



    вова098 /23.11.2014 19:47/
    (R.J.Dio @ 23.11.2014 15:13)
    Ссылка на исходное сообщение  как правило, нужна большая микроволновка. Как ни смешно, это проблема, птому как часто помимо банок с агарозой, туда суют колбы  агаром, а они не проходят по высоте. Но европейский рынок микроволновок, в отличие от американского, практикует какой-то странный формат изделий, они все низкие, даже если по объему приличные, словом, надо еще поискать соответствующую модель.


    вскипятил кастрюльку на тихом газу поставил колбы с агарозой и никаких притензий кроме Газпрома smile.gif



    R.J.Dio /24.11.2014 00:13/
    вова с прИтензией на ум?



    Pharmaсol /24.11.2014 00:17/
    не обращайте внимания, это бот-однодневка, давно здесь бродит, завтра будет под другим ником по постам скакать



    Pharmaсol /24.11.2014 15:02/
    может от формы колбы зависит?
    у нас никогда не выплескивается, микроволновка на полной мощности, 3 минуты, колба вот такая
    user posted image



    R.J.Dio /24.11.2014 15:53/
    (genseq @ 24.11.2014 15:30)
    Ссылка на исходное сообщение  У микроволновки, даже у слабенькой (800 W), мощность избыточна. При её уменьшении регулировка идёт не плавным снижением, а периодическим включением на полную мощность. Отсюда - выплёскивания небольших объёмов (100...200 мл) на любой мощности. "Лечится" добавлением дополнительной ёмкости с водой (~500 мл, не дистиллированной!). umnik.gif

    Агарозу перед нагревом нужно тщательно суспендировать. На начальных стадиях нагрева (до 60...80 градусов) пару раз доставать из микроволновки и перемешивать. Иначе на дне может образоваться плохо растворимый комок. Кипятить (с пробулькиванием) до полной прозрачности, после чего перемешать и прокипятить ещё 2...3 раз минуты. smile.gif

    Пытались вместо готовых гелей с повышенным разрешением (агароза+ПГМ) предлагать сам ПГМ (он же - Synergel), но гели с этой добавкой плавить ещё сложнее. wall.gif  Пришлось от этой идеи отказаться.  weep.gif


    ну, положим, в инверторных печах мощность регулируется не импульсами, так что этот аргумент вовсе не аргумент, ибо результат тот же ( в смысле выплескивания). далее, ставить емкость 500 мл, чтобы расплавить грамм-полтора агарозы в 50-100 мл- это, конечно, умно, так до морковкиного заговенья плавить придется. Все остальное- капитан очевидность протекстовал замечательно, особо прорекламировал гели, кот. за лет 5, прошедшие с момента первого обострения на эту тему, так никому и не нужны оказались (особенно в трогательной упаковке из-под конфет Ferrero)



    meschersky /24.11.2014 16:12/
    (Pharmaсol @ 24.11.2014 16:02)
    Ссылка на исходное сообщение  может от формы колбы зависит? у нас никогда не выплескивается, микроволновка на полной мощности, 3 минуты, колба вот такая
    user posted image

    +1
    Именно такая колба, и отродясь ничего не выплескивалось, сколько ни кипяти...



    R.J.Dio /24.11.2014 17:20/
    хм. интересно. Хотя завинчивающиеся банки Pirex предпочтительнее, можно хранить остатки, да и компактнее



    NMR-guy /24.11.2014 18:25/
    (R.J.Dio @ 24.11.2014 17:20)
    Ссылка на исходное сообщение  хм. интересно. Хотя завинчивающиеся банки Pirex предпочтительнее, можно хранить остатки, да и компактнее

    Останки стоявшего рядом в момент взрыва банки внутри микроволновки по механизму ЧАЭС? tongue.gif

    Мы тоже в колбе всегда в такой варили, но у нас излучатель внизу. Потому когда она закипает и начинает пузыриться ее можно даже проварить минутку с пузырями - они до горла никогда не долазят. А вот в пендосской моей лабе излучатель был сверху, там секунд 20-30 после начала кипения тоже в плоскодонной колбе - и всё на потолке и в виде пара/аэрозоля внутри.

    Единственное что объясняет два этих феномена - квадрат расстояния до излучателя.



    вова098 /24.11.2014 23:20/
    (Pharmaсol @ 24.11.2014 01:17)
    Ссылка на исходное сообщение  не обращайте внимания, это бот-однодневка, давно здесь бродит, завтра будет под другим ником по постам скакать

    лет так сто smile.gif








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler