Главная страница MolBiol.ru > Методы > ДНК из геля > С помощью PEG/TAE Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Выделение ДНК из агарозного геля с помощью PEG/TAE

На наш взгляд это самый удобный метод выделения DNA из геля. Он дёшев, позволяет выделить фрагменты DNA любого размера с эффективностью более 90%, очень быстр, позволяет выделить одновременно так много фрагментов, как много лунок вы вырежете.
    Схема элюции
  1. вырезать лунку перед полосой (под длинноволновым 365nm UV), убрать лишние куски агарозы;
  2. убрать из камеры лишний буфер (может быть придётся наложить фитили из фильтровальной бумаги (см. рис.));
  3. заполнить лунку PEG/TAE;
  4. вогнать DNA в лунку 20-25v/cm, за продвижением полосы DNA следить с помощью UV лампы (360nm);
  5. собрать раствор из лунки (хранить при -20oС);
  6. хороший тон - сфотографировать после этого гель под UV.
  7. обычно дальнейшая очистка не требуется, для каких то "особо чистых" случаев:

  8. экстрагировать Ф:Х:I;
  9. ЦФ 2-3 krpm NT, 5';
  10. ЦФ NT, 5';
  11. экстрагировать Х:I;
  12. ЦФ NT, 5';
  13. добавить
  14. 1/10V 3M AcONa,
    2хV EtOH, смешать;

  15. осадить, сполоснуть 70% EtOH,
  16. растворить в воде или TE.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 15352

    Растворы

    PEG/TAE

    (хранить при 4oС) p=1.033:

    Конц.Сток50ml
    PEG*15%тв.7.5g
    TAE1x50x1.0ml
    EtBr0.5µg/ml10µg/ml2.5µl
    H2O mQ43.1ml
    Конц.Сток50ml
    PEG*15%40%18.75ml
    20.16g

    TAE1x50x1.0ml
    EtBr0.5µg/ml10µg/ml2.5µl
    H2O mQ30.25ml

    * можно использовать PEG 6000 или 8000.



    Комментарии

    Общие

  • Метод основан на электроэлюции DNA из геля в буферный раствор. Чтобы DNA не проскакивала сквозь лунку, вязкость раствора повышается добавлением 15% PEG.
  • Видимо аналогичный метод может быть использован и для других форезных буферов, единственная модификация - заменить PEG/TAE на PEG/???.
  • Вариация метода: для снижения скорости движения DNA используется повышение концентрации соли в буфере. В этом случае в лунку заливается {3xTAE/EtBr}. Преимущество такого способа - буферный раствор легко можно заменить гель-фильтрацией.


  • По пунктам

    п. 1.

  • Коротковолновое UV- облучение (254nm) может очень сильно понизить эффективность трансформации (365nm облучение сказывается слабо). "Вредоносность" 254nm облучения зависит от размера pDNA. 1' облучения уменьшает эффективность клонирования pDNA в:
  • 3.2kb~ 4 раза
    4.8kb~ 30 раз
    8.2kb~ 500 раз
  • Если лунки достаточно близко друг к другу, нужно быть очень внимательным, чтобы не устроить разрез между ними.
  • лишние куски агарозы легче всего убрать с помощью обрезанного желтого типчика, подсоединенного к вакуумному насосу. Если лунки небольшого размера, то вырезать их проще всего стеклянной Пастеркой, подсоединённой к вакуумному насосу. Чтобы легко видеть конец Пастерки под ультрафиолетовой лампой можно вначале "всосать" в неё немного краски с обычного лабораторного маркера.
  • п. 4.

  • Электрофорез при высокой напряженности поля выравнивает скорости движения молекул DNA разного размера.
  • За продвижением полосы DNA удобнее следить, если фон под камерой темный.
  • п. 5.

  • Если использовать для электрофореза буфер TAE, выделенную ДНК без дальнейшей очистки можно использовать для лигирования, кинирования, реакции Random Primer. Примесь PEG не ингибирует рестрикцию.
  • Примесь PEG мешает анализу выделенного фрагмента с помощью электрофореза, вызывая размытие полосы при переходе DNA из лунки в гель. Чтобы получить четкие полосы, нужно перед нанесением экстрагировать раствор DNA равным объёмом водонасыщенного X:I (24:1).
  • п. 8, 9.

  • Центрифугирование выполняется в два этапа, т.к. PEG образует весьма плотную подушку, которая способна увлечь DNA в интерфазу.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    _Артем_ /11.01.2006 03:44/
    п.1
    При концентрации PEG 17% можно не пользоваться фитилями, так как раствор довольно вязкость и при аккуратном наслоении остается таковым при ЭФ. Вязкость PEG сильно зависит от температуры и при необходимости ЭФ можно проводить при пониженной температуре.



    Atropos /03.11.2006 20:12/
    Любопытная статья ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Retrieve&dopt=AbstractPlus&list_uids=8922632 ). Правда ли, что трансиллюминаторы на 312 нм столь сильно понижают эффективность трансформации и что добавление гуанозина/цитидина столь эффективно препятствует этому явлению? confused.gif



    Guest /04.11.2006 10:23/
    методэлюции из геля , описанный



    Guest /04.11.2006 10:30/
    метод элюции из геля , описанный выше а) трудоемок крайне б) грязен в смысле кросс-контаминации при выделении более 1 фрагмента в параллель в) с трудом справляется с разделением и элюцией одной из дву-трех близко идущих полос
    И потом, оценка повреждения ДНК при облучении зависит, кроме длины волны и размера фрагмента, еще и от времени облучения, расстояния от лампы до геля и тп- что очевидно, не сам свет плох, а количество поглощенных фотонов.
    Ну и про последнюю статью- смешно, как 99% всего, что сливается в Biotechnique, ей-богу. МОжно много чего налить в буфер (как в бензин!)- может, просто научиться работать быстро , чисто и не повреждать ДНК ультрафиолетом, а мозги- чтением бредовых методик и статей?!



    Platov /14.12.2006 01:24/
    Guest, a какой метод предлагаешь ты?



    Guest /14.12.2006 15:51/
    (Guest @ 04.11.2006 09:30)
    Ссылка на исходное сообщение  метод элюции из геля , описанный выше а) трудоемок крайне б) грязен в смысле кросс-контаминации при выделении более 1 фрагмента в параллель в) с трудом справляется с разделением и элюцией одной из дву-трех близко идущих полос
    И потом, оценка повреждения ДНК при облучении зависит, кроме  длины волны и размера фрагмента, еще и от времени облучения, расстояния от лампы до геля и тп- что очевидно, не сам свет плох, а количество поглощенных фотонов.
    Ну и про последнюю статью- смешно, как 99% всего, что сливается в Биотечнияуе, ей-богу. МОжно много чего налить в буфер (как в бензин!)- может, просто научиться работать быстро , чисто и не повреждать ДНК ультрафиолетом, а мозги- чтением бредовых методик и статей?!

    А можно работать МЕДЛЕННО smile.gif И не суетиться зазря smile.gif
    И не ОБЛУЧАТь ДНК улътрафиолетом сдуру smile.gif
    http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=11011 ( http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=11011 )



    mega monster kill /15.12.2006 20:08/
    Никаких методов ваще не надо для агарозы. Берете полосу из геля, замораживаете вместе с гелем и пропускаете через фильтр 0,2-0,4мкм и т.п. например ацетат целлюлозы, или любой другой low binding. ВСЕ!!!!!!!!!!!



    curious67 /16.12.2006 22:51/
    а зачем тогда киты для выделения из геля? А куды деваться от кусков (маленькие- но все же) агарозы- она отлично ингибирует все подряд, начиная с лигирования



    Guest /19.07.2007 15:28/
    (curious67 @ 16.12.2006 22:51)
    Ссылка на исходное сообщение  а зачем тогда киты для выделения из геля? А куды деваться от кусков (маленькие- но все же) агарозы- она отлично ингибирует все подряд, начиная с лигирования

    из агарозы естъ КлонВелл - НИЧЕГО ВЫРЕЗАТь НЕ НАДО smile.gif
    http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=11714 ( http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=11714 )



    Alexkiev /23.07.2007 12:55/
    mega_monster_kill, а каими последствиями чреват такой метод? для чего замораживать гель с ДНК, разрушить? ДНК выходит через гель с TBE? Как потом будут вести себя рестриктазы в этом буффере?



    Guest /23.07.2007 17:31/
    (Alexkiev @ 23.07.2007 12:55)
    Ссылка на исходное сообщение  мега_монстер_килл, а каими последствиями чреват такой метод? для чего замораживать гель с ДНК, разрушить? ДНК выходит через гель с ТБЕ? Как потом будут вести себя рестриктазы в этом буффере?

    тут полоска приходит в ЛУНКУ с ВОДОЙ smile.gif когда видищ что уже продукт подошел
    к лунке в геле - Просто добавь ВОДЫ smile.gif
    http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=11714 ( http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=11714 )



    Alexkiev /25.07.2007 14:51/
    тут полоска приходит в ЛУНКУ с ВОДОЙ когда видищ что уже продукт подошел
    к лунке в геле - Просто добавь ВОДЫ
    http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=11714 ( http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=11714 )

    Вариант неплохой, но прибор... Все равно спасибо, подкоплю денег и...


    Как лучше выделить днк 200п.н. из геля для последующей амплификации...? Скорее всего малая концентрация. Спасибо



    Alexkiev /27.07.2007 12:47/
    Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка??
    Вопрос 2: Кстати, знает ли кто-нибудь можно ли полученный продукт из ПЦР, точнее всю смесь после реакции ПЦР (уже полученная вставка, с конц. 1нг в 1 мкл, праймеры, нуклеот., полимераза, вода...), разделить на двое (по 25мкл) и довести оба эппендорфа до 50 мкл, добавив dNTP, праймеры, полимеразу... и запустить реакцию по новой, тем самым обезвредив концентрацию пирофосфатов... и в результате получить больше нужного продукта? ПЦР не дает внушительного количества. Спасибо



    Ъ /27.07.2007 15:31/
    (Alexkiev @ 27.07.2007 12:47)
    Ссылка на исходное сообщение  Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка??
    Вопрос 2: Кстати, знает ли кто-нибудь можно ли полученный продукт из ПЦР, точнее всю смесь после реакции ПЦР (уже полученная вставка, с конц. 1нг в 1 мкл, праймеры, нуклеот., полимераза, вода...), разделить на двое (по 25мкл) и довести оба эппендорфа до 50 мкл, добавив dNTP, праймеры, полимеразу... и запустить реакцию по новой, тем самым обезвредив концентрацию пирофосфатов... и в результате получить больше нужного продукта? ПЦР не дает внушительного количества. Спасибо

    Ваши ближайшие цели? Иначе быть пожару на Вашем рабочем месте. Я мею ввиду пожар в виде контаминации ПЦР продуктом. frown.gif .



    Alexkiev /30.07.2007 11:06/
    Да насчет ПЦР, это просто интерес, слишком мало продукта получилось из вставки, хотя саму вставку до реакции на форезе вообще видно не было. Вставка была около 1нг в 1мкл... Нет смысла элюировать из геля, да и другими способами, больше потеряю чем выделю. А вот по поводу амплификации плазмиды, а не вставки, это серьезно. Я уже решил порезать ее и использовать кусок со вставкой для амплификации, а не целую. Что думаете?



    Ъ /01.08.2007 16:53/
    (Alexkiev @ 30.07.2007 11:06)
    Ссылка на исходное сообщение  Да насчет ПЦР, это просто интерес, слишком мало продукта получилось из вставки, хотя саму вставку до реакции на форезе вообще видно не было. Вставка была около 1нг в 1мкл... Нет смысла элюировать из геля, да и другими способами, больше потеряю чем выделю. А вот по поводу амплификации плазмиды, а не вставки, это серьезно. Я уже решил порезать ее и использовать кусок со вставкой для амплификации, а не целую. Что думаете?

    Если у Вас выход ПЦР продукта низкий, это не по причине что Вы взяли в качестве матрицы вставку (это ПЦР продукт?) или плазмиду. Для ПЦР эти количества матриц практически одно и то же. Теоретически, линейка-плазмида лучшая матрица, но проблема Ваша в самой ПЦР - низкий выход из-за плохо оптимизированной смеси. Оставьте плазмиду и вставку в покое и ищите причину в другом, начиная со структуры праймкров (нет ли ошибок). umnik.gif Происхождение Ваших реактивов и, вторично, Ваши ближайшие цели? confused.gif



    guеst /01.08.2007 17:21/
    (Alexkiev @ 27.07.2007 11:47)
    Ссылка на исходное сообщение  Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка??

    Может, если перебухать фермента и поставить неоправданно большое время элонгации (минуты две).

    Вы ничего не написали о вашей амплификации. На основании такой информации никто Вам помочь не сможет. Если наугад, то чаще всего "низкий выход" получается, когда людям требуется амплифицировать сравнительно короткий фагмент, но они берут "обычную" концентрацию праймеров.



    Alexkiev /02.08.2007 15:08/
    Реактивы кваген и ферментас, есть свое, собственноручное. Вставка ок.200 п.н. Цель получить транскрипт. Вставка кодирует тРНК, мутантную (узнается как пролиновой, так и аланиновой АРСазой). Проблема с праймерами, возможно, потому что разн. темп. плавления, но всего 2 градуса. А скорее из-за того, что разное соотношение GC, считывание полимеразой начинаеться у одного праймера с Т, у другого с А ( по-разному садиться). Время элонгации 1 мин,30 циклов ( вряд ли влияет), температура отжига 58 град. при темп. их плавления 68-66, но так сказали.) Больше ничто не может влиять. Фермента не много, праймеров больше чем в методике с molbiol. Спасибо

    Кстати насчет перебуха - верно, но после нескольких казусов в таком состоянии на работу не прихожу



    Ъ /03.08.2007 15:57/
    Меня смущает низкая температура отжига при такой высокой темп. плавления праймеров. frown.gif Можете ли выставить праймеры и расписать точный состав ПЦР смеси, соблюдаете ли "горячий старт"?
    Вносите миллионы копий матрицы (нг вставки или плазмиды!) в реакцию и низкий выход ПЦР продукта - это надо уметь. frown.gif



    Guest /03.08.2007 17:27/
    (Ъ @ 03.08.2007 15:57)
    Ссылка на исходное сообщение  Меня смущает низкая температура отжига при такой высокой темп. плавления праймеров.  frown.gif  Можете ли выставить праймеры и расписать точный состав ПЦР смеси, соблюдаете ли "горячий старт"?
    Вносите миллионы копий матрицы (нг вставки или плазмиды!) в реакцию и низкий выход ПЦР продукта - это надо уметь. frown.gif

    Сегодня около Венеции- погода дер;мо- рву -Миласн-Генуя lol.gif lol.gif lol.gif



    Guest /03.08.2007 17:29/
    (Ъ @ 03.08.2007 15:57)
    Ссылка на исходное сообщение  Меня смущает низкая температура отжига при такой высокой темп. плавления праймеров.  frown.gif  Можете ли выставить праймеры и расписать точный состав ПЦР смеси, соблюдаете ли "горячий старт"?
    Вносите миллионы копий матрицы (нг вставки или плазмиды!) в реакцию и низкий выход ПЦР продукта - это надо уметь. frown.gif

    Привет lol.gif lol.gif lol.gif Ты еше не охерел lol.gif lol.gif lol.gif



    Guest /03.08.2007 17:34/
    (Ъ @ 03.08.2007 15:57)
    Ссылка на исходное сообщение  Меня смущает низкая температура отжига при такой высокой темп. плавления праймеров.  frown.gif  Можете ли выставить праймеры и расписать точный состав ПЦР смеси, соблюдаете ли "горячий старт"?
    Вносите миллионы копий матрицы (нг вставки или плазмиды!) в реакцию и низкий выход ПЦР продукта - это надо уметь. frown.gif

    НУ ИЗВИНИ - из италии приходится мессаги кидат weep.gif weep.gif weep.gif
    завтра рвану на другой берег lol.gif lol.gif lol.gif



    Ъ /03.08.2007 20:15/
    (Guest @ 03.08.2007 17:34)
    Ссылка на исходное сообщение  НУ ИЗВИНИ - из италии приходится мессаги кидат weep.gif  weep.gif  weep.gif
    завтра рвану на другой берег lol.gif  lol.gif  lol.gif

    Я думал, что ты давно загораешь. Привет. smile.gif А я уже загораю на том же месте, где и был на майских, на острове в Средиземном. Это к юго-востоку от тебя.








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler