Главная страница MolBiol.ru > Методы > ДНК из геля > С помощью silica spin колонок Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Выделение ДНК из агарозного геля с помощью silica spin колонок

Чуть более удобный способ, чем очистка на silica particles, так как не приходится беспокоиться о том, чтобы не повредить осадок частиц. Можно чистить как двухцепочечную, так и одноцепочечную DNA.
  1. вырезать фрагмент DNA и взвесить получившийся кусочек агарозы (100mg=100µl);
  2. добавить к нему 4х кратный объём буфера AB(или NIB);
  3. инкубировать ~10' при 50оС перемешивая время от времени;
  4. когда агароза растворится проверить цвет раствора и довести pH, если необходимо;
  5. добавить объём изопропанола, равный объёму геля, смешать;
  6. нанести на колонку (ЦФ 1 – 2');
  7. промыть колонку 400µl AB(или NIB) (optional, отмывка от остатков агарозы);
  8. дважды промыть колонку 400µl WB;
  9. убрать элюат из 2ml пробирки-резервуара и высушить колонку ЦФ 2';

  10. элюция DNA:
  11. поместить колонку в чистую 1.5ml микроцентрифужную пробирку;
  12. нанести на колонку ~30µl EB, инкубировать >1';
  13. центрифугировать 2'.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 15253

    Растворы

    AB (adsorbtion buffer)

    (хранить при 4oС):
    Guanidine isothiocianate = GuSCN

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    GuSCN5M118.16g/M5.91g29.54g
    MES, pH 5.550mM1M0.5ml2.5ml
    EDTA, pH8.020mM0.5M0.4ml2.0ml
    Triton X-1000.5%10%0.5ml2.5ml
    Cresol red0.05mM50mM10µl50µl
    H2O mQ4.09ml20.45ml

    MES, pH 5.5, 1M

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    MES (Na)1M217.2g/M2.17g10.86g
    Укс. к-та (лед.)853mM17.4M0.49ml2.45ml
    H2O mQ   

    WB

    (хранить при NT):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    Этанол80%100%8.0ml40.0ml
    TrisCl, pH7.510mM1M0.1ml0.5ml
    H2O mQ1.9ml9.5ml

    EB

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток10.0ml50.0ml
    TrisCl, pH8.510mM1M0.1ml0.5ml
    H2O mQ9.9ml49.5ml


    Комментарии

    Общие

  • Изготовление silica spin колонок описывается в протоколе "Очистка pDNA на silica spin колонках". Там же описаны проблемы, которые может вызвать очистка на стеклянных мембранах (ингибирование некоторых ферментов).
  • Принцип метода: агароза растворяется в GuSCN (или NaI), ДНК обратимо сорбируется на поверхность стеклянной мембраны в растворе с высокой концентрацией хаотропной соли, примеси отмываются GuSCN и 80% этанолом, и очищенная DNA элюируется в буфере с низкой ионной силой (годится для сиквенса и практически всех других применений).
  • Практически все методы работы на silica spin колонках с минимальными модификациями адаптируются для "silica particles (glass milk)" или "diatoms" и наоборот (единственное серьёзное преимущество стеклянных мембран перед частицами — нет нужды беспокоится о сохранности осадка).
  • Все промывки можно проводить не только на центрифуге, но и с помощью вакуумной промывалки.

  • По пунктам

    п. 2.

  • Вместо буфера на основе Guanidine isothiocianate, можно использовать буфер на основе NaI, который тоже растворяет агарозу. NIB: 6.6M NaI, 16mM Na2SO3, 0.05mM Cresol Red (хранить в темноте при 4oC)
  • п. 4.

  • Крезоловый красный введён в AB как краситель, изменяющий цвет в зависимости от pH: жёлтый при pH<7.5 и красный при pH>7.5. Дело в том, что связывание ДНК с мембраной резко ухудшается при pH>7. Если цвет смеси (п.1) оказался оранжевым или фиолетовым, следует уменьшить pH добавив немного 3M ацетата натрия, pH 4. Крезоловый красный можно не добавлять, если протокол очистки уже оптимизирован для конкретного буфера.
  • п. 8.

  • WB. Это - забуференный 80% этанол. Он используется для того, чтобы отмыть мембрану от хаотропных солей. Tris — необходимый компонент WB, так как чистый 80% этанол денатурирует двухцепочечную ДНК во время промвки.
  • п. 11.

  • EB. Низкосолевой буфер с pH в районе 7.0 - 8.5. В принципе, можно использовать просто воду, но нужно убедиться, что её pH находится в указанных пределах.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы

    Poltavets /15.06.2006 14:43/
    Хотелось бы попробовать применить этот метод для очистки матрицы перед сиквенсовой реакцией. Нашла еще один похожий протокол, но там требуется MES-кислота и соль Na.Где бы раздобыть немного чтобы попробовать?



    Poltavets /15.06.2006 14:47/
    Хотелось бы попробовать применить этот метод для очистки матрицы перед сиквенсовой реакцией. Нашла еще один похожий протокол, но там требуется MES-кислота и MES-соль Na.Где бы раздобыть немного, чтобы попробовать? Коллеги, поделитесь опытом, как дешево и качественно чистить ПЦР-продукт. Заранее благодарю за добрый совет!



    Lesha /15.06.2006 15:43/
    (Poltavets @ 15.06.2006 13:47)
    Ссылка на исходное сообщение  требуется MES-кислота и MES-соль Na


    Это просто буфер. Годится практически любой (т.е., фосфат я бы трогать не стал smile.gif ), который держит буферную емкость в этом диапазоне pH



    Demyanov /20.06.2006 19:36/
    MES вроде обычно нужен для того, чтоб сделать концентрированный гуанидин. Я как-то покупал MES у Хеликона. Еще есть готовые отечественные наборы, которые могут подойти для вас см. ссылку

    http://cytokine.ru/gate.html?name=Content&pa=showpage&pid=13 ( http://cytokine.ru/gate.html?name=Content&pa=showpage&pid=13 )



    Chlorum /20.06.2006 23:51/
    А разве нельзя выгонять ДНКу из геля центрифужными методами? Я не нуклеинщик, поэтому вопрос наивный, но читал в некоторых спецификациях, с которыми жизнь сводит...



    Progenitor /09.02.2012 09:43/
    А такой вот вопрос - у Qiagen gel extraction kit как понимаю колонки по тому же принципу работают и в протоколе помимо максимального количества ДНК, которое можно осадить, указано что через 1 колонку можно прогонять не более 800ul раствора с гелем, с чем это может быть связано? А то кроме коммерческого интереса ничего в голову не идет...



    -Ъ- /09.02.2012 10:11/
    (Progenitor @ 09.02.2012 10:43)
    Ссылка на исходное сообщение  А такой вот вопрос - у Qiagen gel extraction kit как понимаю колонки по тому же принципу работают и в протоколе помимо максимального количества ДНК, которое можно осадить, указано что через 1 колонку можно прогонять не более 800ul раствора с гелем, с чем это может быть связано? А то кроме коммерческого интереса ничего в голову не идет...

    С тем, что колонки не резиновые и более 800 мкл за раз не нанесете....
    А коммерческие интересы какие в голову лезут - попытаюсь тоже ответить? smile.gif



    vtosha /09.02.2012 10:12/
    Это связано с объёмом колонкиsmile.gif. Больше 800 мкл в колонку просто не поместится. Но это не означает, что на колонку нельзя наносить дважды по 800 мкл, трижды по 800 мкл и т.д., пока не нанесёшь весь образец.



    -Ъ- /09.02.2012 10:28/
    (vtosha @ 09.02.2012 11:12)
    Ссылка на исходное сообщение  Это связано с объёмом колонкиsmile.gif. Больше 800 мкл в колонку просто не поместится. Но это не означает, что на колонку нельзя наносить дважды по 800 мкл, трижды по 800 мкл и т.д., пока не нанесёшь весь образец.

    Втоша, увлекаться не стоит - солюбилизированный гель может напакостить, потихоньку задерживаясь (засоряя) на мембране (фильтре).



    Progenitor /09.02.2012 11:19/
    (-Ъ- @ 09.02.2012 13:11)
    Ссылка на исходное сообщение  С тем, что колонки не резиновые и более 800 мкл за раз не нанесете....
    А коммерческие интересы какие в голову лезут - попытаюсь тоже ответить? smile.gif


    Я понимаю что не резиновые и можно нанести несколько раз, просто у меня концентрация днк небольшая, плюс еще теряется почему-то много и соответственно есть желание прогнать побольше геля для повышения концентрации в элюате, а производитель настаивает на использовании нескольких колонок...



    vtosha /09.02.2012 13:05/
    В мануале и стоит дополнительная промывка хаотропным буфером QG после нанесения. Как раз от возможных засоров гелем, как я понимаю. Дополнительные колонки не обязательно использовать.

    Если много теряется, попробуйте следующие изменения. Все центрифугирования на максимуме эппендорфовской "черепашки".

    Первый пункт, где может теряться. От буфера QG надо отмывать зверски. На пробирках экономить можно, но если этого не делать, выход сильно улучшается. После QG перенесите в новые пробирки (2 мл с отрезанными крышками или Collection tubes). Промойте буфером PE, при этом первую каплю нанесите на ободок крышки (чтобы с него тоже смылось). Перенесите в новые 2 мл пробирки и снова промойте буфером PE. Снова перенесите в новые 2 мл пробирки
    Второй пункт, где может теряться. Сушить от буфера PE в этих новых пробирках, центрифугируя в течение 3 минут.
    Третий пункт, где может теряться. Залейте половину +1 мкл требуемого объёма EB-буфера в центр колонки. Подержите 5 минут. Центрифугируйте 3 мин. Нанесите вторую половину +1 мкл требуемого объёма EB=буфера в центр колонки. Можно не держать. Центрифугируйте 5 мин.

    Ещё нам советовали смывать горячим EB-буфером, но это не для всех приложений подходит.
    Если ДНК с большим содержанием АТ, то её нельзя перегревать, и в этом случае растворять гель тоже нужно только при комнатной температуре.



    -Ъ- /09.02.2012 13:18/
    Втоша права - работать надо аккуратно, но ... без фанатизма. smile.gif
    Мне особенно понравилось "Залейте половину +1 мкл требуемого объёма..." smile.gif
    А может все-таки 1,7 мкл? wink.gif



    RJ Dio /09.02.2012 13:37/
    ох...Уж сколько раз твердили миру...Неужто медики все вокруг!



    vtosha /09.02.2012 14:37/
    "Мне особенно понравилось "Залейте половину +1 мкл требуемого объёма..." smile.gif
    А может все-таки 1,7 мкл?"
    Нет, конечно. При элюции EB-буфером расчёт идёт на тот объём, который нужно в итоге получить. Он различается в зависимости от задач пользователя. 1 мкл --- это некий "мёртвый объём" колонки, я так понимаю, то, что на ней остаётся. Если нужен конечный объём 30 мкл, то смывать рекомендуется двумя порциями: 16 и 16 мкл. Если нужен конечный объём 50 мкл, то 26 и 26 мкл. Если нужен конечный объём 15 мкл, то 9 и 8 мкл. И так далее.



    RJ Dio /09.02.2012 15:04/
    вас плохо учили, или ученье не пошло впрок. Во-первых, ошибка пипетирования- неужто вы считаете всерьез, что если взяли 8 мкл, то там 8? во-вторых, если есть метода, где важен каждый мкл. иначе расстрел- это плохая метода, написанная медиком, у которого за десятилетия непрерывной долбежки имен бугорков костей все свободные валентности в мозгу заполнились бессмысленной латынью



    Guest /09.02.2012 15:33/
    (RJ Dio @ 09.02.2012 15:04)
    Ссылка на исходное сообщение  вас плохо учили, или ученье не пошло впрок. Во-первых, ошибка пипетирования- неужто вы считаете всерьез, что если взяли 8 мкл, то там 8? во-вторых, если есть  метода, где важен каждый мкл. иначе расстрел- это плохая метода, написанная медиком, у которого за десятилетия непрерывной долбежки имен бугорков костей все свободные валентности в мозгу заполнились бессмысленной латынью

    ню-ню smile.gif
    Small differences in volumes (±0.5 μl) can sometimes give rise to very large differences in cluster numbers (~100,000) - это откуда? confused.gif

    мануалы иллюминовские не медики писали yes.gif



    RJ Dio /09.02.2012 15:44/
    нанотехнологии не обсуждаем, мы все больше про молотки и отвертки с пипетками



    -Ъ- /09.02.2012 17:28/
    Диджей, не сбивай с толку девушку, пусть работает как учили, как расписано... Вообщем, так работать не вредно и рукойводителю спкойнее. smile.gif
    Это потом появится "творчество", когда опыта наберется...
    Кстати, при составлении ПЦР смеси я допускаю погрешность до 20% от оптимальных конц-ций... А для всяких там выделений и очисток - стыдно говорить. eek.gif



    RJ Dio /09.02.2012 18:48/
    истинная правда



    guest: Andrey N /12.02.2012 13:11/
    to Progenitor

    А Вы мысленно увеличте объем пары колонка-пробирка в 2-3 раза (допустим для 1,5-2мл). Мого Вы знаете роторов в которые ЭТО залезет?! Коммерческий интерес фирм еще и в том чтобы их товар подходил всем и под наиболее распространенные роторы.

    Вообще-то, по-моему во всех рукрводствах все это (и то что говорила Вам Vtosha) подробно описано. Сейчас специально глянул в инстукцию к колонкам Fermentas, ибо под рукой. Там все есть -- и то что просто несколько раз нанести по 800мкл, если раствора много, и про прогрев, и про эллюцию в два этапа..... и т.д.
    ЧИТАЙТЕ МАНУАЛЫ!!!!!!!




    Invision Power Board Database Error  

    There appears to be an error with the database.
    You can try to refresh the page by clicking here.

    Error Returned

    We apologise for any inconvenience




       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler