Главная страница MolBiol.ru > Методы > Клонирование > Gene Editor system Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Мутагенез с помощью Gene Editor system

 

    5'- фосфорилирование олигонуклеотидов

  1. собрать смесь:   
  2. олигонуклеотид 100pmol 40pmol 20pmol
    10x киназ. буфер 2.5µl 1.0µl 0.5µl
    T4 PNK 5u 2u 1u
    ATP, 10mM 2.5µl 1.0µl 0.5µl
    H2O / до 25µl / до 10µl / до 5µl
  3. 37oC, 30';
  4. 70oC, 10' - инактивировать PNK;
  5. развести мутагенизирующий олигонуклеотид:
  6. 2µl+4.4µl(H2O)=>6.4µl (1.25pmol/µl),

  7. олигонуклеотид селекции:
  8. 2µl+30µl (H2O)=>32µl (0.25pmol/µl);

  9. хранить при -20oС;
  10. денатурировать матрицу:
  11. Щелочная денатурация dsDNA

    7a1. денатурировать ~0.25pmol (~1µg) dsDNA, добавив:

    2M NaOH 1µl,
    EDTA до 2mM,
    H2O до финального V=9µl;

    7b1. 10' NT
    7c1. добавить

    2M NH4Ac (pH 4.6) 1µl,
    100% EtOH 38 µl;

    7d1. -70oC, 30';
    7e1. ЦФ;
    7f1. 70% EtOH;
    7g1. растворить в 50µl TE7.5, 10µl => анализ (форез);


    Щелочная денатурация без переосаждения

    7a2. собрать смесь:

    pDNA 1µg
    NaOH (1N)1µl
    H2O/ до 2µl

    7b2. 10' NT;
    7c2. добавить

    1N HCl 1µl,
    TE7.5 44µl


    Отжиг.

  12. собрать смесь:
  13. DNA матрица (~0.05pmol) => 10µl (если из п.12а. (8б.))
    олигонуклеотид селекции (0.25 pmol/µl) => 1.0µl
    мутагенизирующий олигонуклеотид (1.25 pmol/µl) => 1.0µl
    буфер для отжига 10х => 2.0µl
    H2O до => 20µl

  14. 75oC, 5';
  15. медленно (0.5oС за 20'' в PCR приборе или в 200ml водяной бане) охладить до 37oС;


  16. Синтез мутантной цепи

  17. прямо на 37oС добавить (до суммарногоv=30µl):
  18. H2O => 5µl
    буфер для синтеза 10x => 3µl
    T4 DNA pol. => 1µl (5-10u)
    T4 DNA lig. => 1µl (1-3u);

  19. 37oC, 1.5h.


  20. Трансформация бактерий

  21. трансформировать BMH 71-18mutS клетки 1.5µl мутагенизированной реакции;
  22. вместо высева + 4ml LB (c 100µl GE антибиотика, 10µl Amp), качать 37oC 16-18h;
  23. очистить pDNA, оценить концентрацию;
  24. трансформировать "нормальные клетки" ~10ng pDNA;
  25. 1/5 высеять на чашку (20ml LB agar + 20µl Amp + 150µl GE антибиотика);


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 9646

    Растворы

    ATP, 10mM

    (хранить смесь при -200С).

    Конц.Сток50µl
    ATP10mM100mM5µl
    H2O mQ45µl

    Буфер для отжига 10х

    (хранить при -200С долговременно, при +40C в течение дня).

    Конц.Сток1ml
    TrisCl(pH *)0.2M1M0.2ml
    MgCl20.1M1M0.1ml
    NaCl0.5M5M0.1ml
    H2O mQ0.6ml

    * pH 7.5 при 370C (то же, что и рН 7.8 при 250С)

    Буфер для синтеза 10х

    (хранить при -200С)

    Конц.Сток200µl
    TrisCl (pH 7.5)0.1M1M20µl
    dNTP’s (mix)5mM100mM10µl
    ATP10mM100mM20µl
    DTT80mM1M4µl
    H2O mQ146µl

    SOC

    (хранить при NT)

    Сток200ml400ml
    Bactotryptoneтв.4.0g8.0g
    Bacto Yest extr.тв.1.1g2.2g
    NaCl5M0.4ml0.8ml
    KCl1M2.0ml4ml
    H2OmQ~196ml~391ml
    1. автоклавировать, охладить до <60oС;
    2. добавить:
    3. 0.01V 2M Mg2+{= 1M MgCl2 + 1M MgSO4}  
      0.01V 2M glucose  ;

    4. фильтровать через 0.2µm фильтр;
    5. аликвотить, хранить при -20oC, (-70oC).

    Смесь антибиотиков GE (50x).

    Конц.40ml
    cefotaxime 25µg/ml25µg/ml1mg
    ceftriaxone 25µg/ml25µg/ml1mg
    KPO4(pH 6.0) 0.1M 40ml

    * Стерилизовать фильтрованием или готовить на стерильной KPO4из стерильного порошка.
    * Хранить при -200С, min количество циклов замораживания-оттаивания.

    NaOH/EDTA

    Конц.Сток1ml
    NaOH2M10M200µl
    EDTA2mM0.5M4µl
    H2O mQ796µl



Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/



    Комментарии

    Общие

  • Мы пытались приготовить компетентные клетки используя ТВ (Okajama), но получил компетентность лишь ~2x106. Электрокомпетентные клетки получились с компетентностью ~7x108.
  • Вполне возможно, что в этап денатурации неплохо будет ввести 30' обработку слабой DNase на 37oС (так, чтобы <1 разрыва на молекулу). Последующие разбавление, снижение температуры, 75oС - вполне могут ее инактивировать.
  • Мы пытались растить pSKII(-) и pSKII(-)ge на различных концентрациях GE-antibiotic mix:
  • GE-antibiotic mix на 5ml среды400µl200µl100µl (как в протоколе)50µl25µl10µl5µl
    pSKII(-)ge (8h;ON)+;++;++;++;++;++;++;+
    pSKII(-)(8h;ON)-;--;--;--;--;-+/-;-+;+
    pEM/7Z (8h;ON)-;--;--;--;--;--;-+;+

    Получается, что используемая для селекции концентрация в ~10 раз превышает предельную, но более, чем в 4 раза меньше, чем ингибирующая для Amp(ge)-гена.

  • При концентрациях, которые ингибируют рост бактерий, вначале кажется, что бактерии растут, но после ON среда оказывается прозрачной.

    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler