Главная страница MolBiol.ru > Методы > Клонирование > Микроклонирование Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

'Микро'клонирование ПЦР-продуктов в TOPO-системе

    Исходный TOPO TA Cloning протокол

  1. собрать смесь:
    • свежий ПЦР-продукт — 0.5÷2µl
    • H2O
    • солевой раствор {1.2M NaCl; 60mM MgCl2} 1µl
    • TOPO вектор — 1µl

    • -- общий объём 5µl --
  2. инкубировать 30' на комнатной температуре (22÷23oC);
  3. охладить пробирку во льду, использовать 2µl для трансформации.


  4. Модифицированный протокол — "микро"клонирование

  5. поместить в 0.2ml стрип по 0.1µl ПЦР-продукта, закрыть стрипы крышками;
  6. охладить стрипы;

  7. -- дальнейшую работу проводить в холодной комнате --
  8. сбросить капельки на дно на микроцентрифуге;
  9. приготовить общую смесь "соль/вода/TOPO-вектор" с небольшим избытком;
  10. раскапать общую смесь по 0.5µl;
  11. сбросить на микроцентрифуге;
  12. смешать;
  13. перенести пробирки на 22÷23oC на 30';
  14. охладить пробирки, в холодной комнате внести в каждую по 4.2µl компетентных клеток;
  15. 0oC, 30';
  16. 42oC, 30'';
  17. немедленно поместить пробирки в лёд;
  18. добавить в каждую пробирку по одной капле SOC;
  19. 37oC, 30';
  20. высеять всё на чашку (лучше высевать неравномерно);
  21. инкубировать чашку ON 37oC, работать с клонами дальше.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 14149



    Комментарии

    Общие

  • TOPO Cloning — система для клонирование от Invitrogen, использующая вместо лигазы фермент Topoisomerase I из Vaccinia virus. Изготовители обещают очень высокую эффективность клонирования (95% для pCR4-TOPO), и это очень похоже на правду. В наших руках эта система очень эффективно работала для клонирования конкретных ПЦР-фрагментов, однако, почему-то давала не слишком большое количество клонов при изготовлении библиотек (лигазная система дала на порядки больше из той же смеси).
  • Общая идея микроклонирования — получить не десятки тысяч клонов, а приблизительно сотню и за счёт этого сэкономить на реактивах и компетентных клетках. Мы даже пробовали брать по 0.08µl ПЦР смеси (и, соответственно, меньшее количество остальных реагентов, тоже все получалось нормально. Никаких особых пипеток при этом не требуется — мы пользовались обычными 2µl пипетками и стандартными типчиками для них.

  • По пунктам

    п. 4.

  • Прежде чем проводить "большое клонирование" имеет смысл поставить раститровку на нескольких ПЦР-продуктах и выяснить, какое оптимальное количество ПЦР-смеси следует брать в реакцию. Указанное в протоколе количество было оптимальным для нашей реакции.
  • п. 8 & 12.

  • Мы раскапываем на в крышки одним и тем же типчиком, а потом стряхиваем капельки в пробирки на микроцентрифужке.
  • п. 14.

  • Прогрев на 40oC можно поставить в предварительно разогретом ПЦР-приборе.
  • п. 16.

  • Одна капля SOC — ~30µl.
  • п. 18.

  • Удобно использовать VentedQTray with Divider /Genetix X6029/ — это плашка размером 242х240х20mm в которую вставляется решётка с 48 отдельными ячейками 35х30mm. Если фабричную плашку с ячейками купить нельзя, ячейки можно нарезать самому из какого-нибудь тонкого пластика (стерилизовать спиртом и ультрафиолетом).
  • Неравномерный рассев. Например, мысленно разделить ячейку на три части (допустим, левую среднюю и правую). Нанести две капли по 10µl SOC в левую и среднюю части. Каплю с клетками нанести в правую часть (всё/ кроме приблизительно пары микролитров). Оставшуюся пару микролитов внести в среднюю каплю и пару раз пипетировать. Из пипетированной средней капли отобрать 1µl и перенести в левую каплю. Растирать пластиковой петлёй слева направо.
  • п. 19.

  • В каждой ячейке вырастает около сотни колоний.
  • Что делать дальше — зависит от поставленной задачи. Если требуется проклонировать ПЦР-продукты с точностью до "размера на форезе", удобнее выколоть сразу по паре-тройке клонов, подрастить их в 96- или 384-луночной плашке, переколоть репликатором в плашку с ПЦР-смесью, проверить, что получилось с помощью ПЦР и выбрать подходящие клоны.
  • Если требуется клонирование с проверкой последовательности сиквенсом, то при достаточно большом количестве клонов имеет смысл выкалывать лишь по одной колонии для каждого фрагмента (плашку хранить в холодильнике). После первого раунда сиквенса большая часть клонов окажется правильной, а для неправильных имеет смысл выколоть уже по нескольку клонов и проверять их сначала на соответствие по размеру, а потом уже сиквенировать.
  • Когда ради проверки чистоты клонирования/выращивания в 384-луночной плашке мы рассеяли несколько десятков клонов ещё раз, то в некоторых случаях выросли явно гетерогенные колонии (например - примерно половина колоний чисто белые, а другая половина - голубоватые или колонии нескольких дискретных размеров). Бог знает, почему так происходит — проверка сиквенированием показала, что несмотря на различный внешний вид колонии во всех случаях содержали идентичные вставки.


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


    Дополнения, комментарии, вопросы

    Redactor /10.08.2006 00:57/
    sgsdfgsdgsg



    Гость /01.12.2006 18:25/
    Kit!

    http://www.stratagene.com/products/showProduct.aspx?pid=710 ( http://www.stratagene.com/products/showProduct.aspx?pid=710 )



    pkanew /22.06.2008 12:14/
    Коллеги,

    D-topo и topo Kits Invitrogen`а вещь хорошая и удобная.
    Но срок их хранения весьма ограничен, а вектор капризная штука. Перестает работать если передержать хоть чуток на тепле.
    Основная проблема - это некачественная транспортировка нашими поставшиками invitrogena (Хеликон). Ни разу не получил компетентные клетки - (входят в состав кита, OneShot)- в неразмороженном варианте.
    Метод борьбы - в госконтракт прописываем отдельным пунктом что поставщик обязуется заменить товар в случае обнаружения содержимого криоампул вне зоны заводской фасовки.
    Хотя лучше комптентные клетки готовить самому.



    RJ Dio /22.06.2008 15:38/
    компетешки и ТА-вктора почти всегда тухлые. По последнему предмету имел опыт с Ферментасом- купил, сделал-что чашка, что литовское небо, голубое-голубое, ни облачка



    Гость /15.08.2008 12:37/
    Люди !!! Помогите со ссылкой на тех, кто прогдает оборудование (микролабратории) для так называемого меристемного размножения растений (или как говорят микроклонирование).
    Заранее спасибо...
    Семен.



    Vladlush /11.02.2013 06:15/
    Одна тема нашлась, даи тадохлая, нужен метод выращивания апикальной меристемы(микроклонирование), поиск в интернете желаемого результата не дал. Может у кого есть методическое пособие или практикум,зарание спасибо,
    Влад








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler