Главная страница MolBiol.ru > Методы > Олигонуклеотиды > PAAG электрофорез Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Форез олигонуклеотидов

 

    Подготовка форезного аппарата

  1. вымыть камеры детергентом, хорошо ополоснуть;
  2. мыть стекла детергентом (если очень грязные или из сомнительного источника - хромпиком);
  3. если хочется, чтобы гель легко снимался со стекол — силиконизировать (достаточно 1 раз на ~10 прогонов).


  4. Количество олигонуклеотидов на дорожку

  5. - нижний предел - для того, чтобы увидеть, но бледно (если хочется получить чёткую картинку, лучше взять раз в 5 больше):
    • по теням или по окрашиванию метиленовым синим требуется ~0.10µg олигонуклеотида на 3mm ячейку (для 20b олигонуклеотида: 0.10µg => ~20pmol);
    • окрашиванием SYBR Green II (Molecular Probes): ~1ng (для 20b олигонуклеотида => ~200fmol);
  6. - верхний предел : разрешение еще приемлимое, если брать ~10µg на 10х0.5 mm2 ячейку (если взять раза в два меньше - получится чёткая полоса);


  7. Выбор % геля

  8. длина олигонуклеотида:
  9. менее 25 => 20%
    25-40 => 15%
    40-100 => 12%

  10. на 12х8х0.07см3 гель требуется ~7ml (лучше приготовить 10ml).   


  11. 10ml
    12% 15% 17.5% 20%
    40%AA 3.0ml 
    3.1g 
    3.75ml 
    3.9g 
    4.4ml 
    4.6g 
    5.0ml 
    5.2g 
    H2O 3.0ml  2.25ml  1.6ml  1.0ml 
    10xTBE 1.0ml    1.07g 
    мочевина 4.2g 
    PSA 50µl 
    TEMED*5µl 

    * - добавлять непосредственно перед заливкой;

    Дегазация геля
  12. дегазировать ~5' на струйном насосе;
  13. собрать верхнюю камеру форезного прибора. Вставить (не полностью) гребенку между стеклами;
  14. расплавленную 2% агарозу (в ТВЕ 1x) налить на ровную горизонтальную поверхность. Сразу же установить прибор со стеклами (агароза поднимется между стеклами на ~2mm). "Пролить" агарозой внешние края спейсеров;
  15. к гелю +TEMED, быстро и хорошо смешать, залить между стеклами, опустить гребенку в рабочее положение;
  16. полимеризация ~30';


  17. Заливка геля

    Форез

  18. собрать форезный аппарат; если верхний буфер примыкает к стеклу, лучше перед заливкой подогреть буфер до ~50oC;
  19. префорез ~30V/cm,~15';
  20. перед нанесением: +1 V 2x буфера; 55oС, 5';
  21. форез ~30V/cm.


  22. После фореза

    1. окрашивание SYBR Green II (Molecular Probes):
      1. поместить гель в TE или TBE буфер с разведённым в 10000 раз стоковым раствором красителя, ~10-30' на качалке;
      2. фотографировать.
    2. окрашивание метиленовым синим:
      1. поместить гель в окрашивающий раствор, ~10-30' на качалке;
      2. отмывать в H2O;
      3. фотографировать.
    3. наблюдение олигонуклеотидов по теням на флуоресцирующей поверхности:
      1. гель завернуть в Saran wrap, положить на флуоресцирующую поверхность;
      2. фотографировать (освещая сверху 250-270nm UV).


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 20432

    Растворы

    TBE

    10x, pH~8.3;(хранить при NT в чистой посуде)

    1x10xСток1L
    Tris base89mM0.89M121.14g/M107.8g
    Boric acid89mM0.89M61.83g/M55.03g
    EDTA, pH 8.02mM20mM500mM40ml
    43.84g

    H2O  mQ863.3ml

    * 10х сток вполне устойчиво хранится при NT, если его профильтровать через 0.4µm фильтр.

    PSA

    Ammonium persulfate 10% (хранить при 4oС несколько недель).

    Стоковый раствор акриламида 40%

    (19:1, p=1.044) (хранить при 4oС несколько месяцев).

    Конц.Сток50ml
    Акриламид38%тв.19g
    BIS-AA2%тв.1g
    H2O mQ32.2ml

    2% агароза в 1xТВЕ

    (хранить на NT несколько месяцев).

    Смесь для окрашивания

    (хранить при NT в защищенном от света месте).

    Конц.Сток100ml200ml
    AcON(pH 5.2)0.5M3M17ml33.3ml
    Met. Blue0.04%тв.
    0.2%
    40mg
    20ml
    80mg
    40ml

    H2O mQ83ml
    63ml
    166.6ml
    126.6ml

    2х буфер для нанесения

    Формамид с одним или несколькими красителями (бромфеноловый синий, ксиленцианол, Orange G) в концентрации 0.01-0.05% (по вкусу). Обычно коммерческий формамид имеет вполне приемлимое качество, но если он желтый, то лучше деионизовать ("Сложные" буфера.).

    Конечная концентрация формамида при нанесении может быть от ~50 до ~100%.




Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/



    Комментарии

    Общие

  • Мы не можем поручится, что описанные ниже проблемы не были связаны с качеством геля, но когда мы пытались разогнать на индивидуальной дорожке (3x0.6mm2) ~40fmol меченных олигонуклеотидов, мы получили фон > сигнала. Если брать большее количество олигонуклеотидов, фон остается приблизительно тем же, а сигнал увеличивается. Видимо проблему так же можно решить добавлением "носителя": tRNA или totalRNA.
  • Дополнение от Маши: Чтобы ускорить процесс полимеризации, можно пластины с залитым гелем поставить в термостат с 37-60OC по Цельсию (или направить на них струю горячего воздуха от обогревателя). Это можно сделать после 10-15' после начала полимеризации. Реакция полимеризации идёт по свободно-радикальному механизму, поэтому она при повышении температуры ускоряется (несмотря на то, что экзотермическая).


  • По пунктам

    п.3.

  • Силиконизирование - см. "Сиквенс". Пластину из окиси титана тоже можно силиконизировать.
  • п.6.

  • Вполне можно пользоваться и промежуточными концентрациями.
  • п. 7.

  • Дополнение:
    Удобно приготовить раствор ПААГ (все, кроме персульфата аммония и ТЕМЕD) и отливать для заливки по мере надобности. Хранится такой сток два-три месяца совершенно спокойно.
  • п.8.

  • Кислород - ингибитор полимеризации. Без дегазации гель, конечно, заполимеризуется, но за большее время (в этом случае стоит увеличить в ~1.5 раза количество PSA и TEMED).
  • п. 9.

  • Если вставить гребенку после заливки геля, можно сдвинуть прибор и повредить агарозную пробку.
  • п.12.

  • Удобно отлить из остатков гелевого раствора ~0.5 -1.0ml в 1.7ml пробирку и использовать ее как индикатор полимеризации.
  • Дополнение:
    Залитые ПАА гели можно хранить в холодильнике (месяц - точно). Чтобы не высохли, лучше обернуть их Saran Wrap.
  • п.13.

  • Если проводить форез при повышенной температуре, будет меньше проблем со вторичной структурой олигонуклеотидов.

    п.15.

  • Лучше (но обычно не обязательно), если олигонуклеотиды наносятся на форез прямо с 55oС.
  • Выбор красителя в 2х буфере. Любой из красителей облегчает нанесение на форез.
  • Бромфеноловый синий и ксиленцианол - (стоковые растворы 1% в H2O; рабочая концентрация в 1х буфере ~0.01-0.05%) позволяют иметь представление о том, где в геле находятся олигонуклеотиды определенной длины. Но они могут создавать проблемы при наблюдении олигонуклеотидов.
    OrangeG - (стоковый раствор 1% в формамиде; рабочая концентрация в 1х буфере ~0.01-0.05%) идет очень низко, для препаративных форезов лучше использовать именно его (а БФ и КЦ наносить где нибудь у края на пустую дорожку).

  • Подвижность красителей в денатурирующемPAAG.
  • % PAAGXylene cyanolBromphenol blue
    20~28~8
    15~30~9-10
    12~40~11
    10~55~12
    8~76~19
    6~106~26
    5~130~35

  • Подвижность красителей в неденатурирующемPAAG.
  • % PAAGXylene cyanolBromphenol blue
    204512
    156015
    127020
    816045
    526065
    3.5460100


    п. 17.

  • Наибольшая чувствительность достигается при окрашивании геля SYBR Green I (~1ng; для 20b олигонуклеотида => ~200fmol).

  • Два других метода (тени и метиленовый синий) приблизительно эквивалентны.
    1. Метиленовый синий можно использовать в концентрации 0.0002-0.04%. Чем меньше концентрация красителя, тем дольше идёт окрашивание, но тем короче отмывка. AcONa (pH 5.2) введен, по-видимому, для фиксации олигонуклеотидов в геле. Но быстро окрасить можно и в воде. Окрашивание метиленовым синим легко обратимо, поэтому за отмывкой нужно следить и выбирать для фотографирования оптимальный момент.
    2. В качестве флуоресцирующей пловерхности можно использовать бумагу (например, для принтера), хроматографическую пластинку /Merck, Art. 5735, DC-Plastikfolien Kieselgel 60 F254 25 Folien 20x20cm/ (для эстетов, так как чувствительность та же, что и для бумаги) или любую другую флуоресцирующую поверхность (посветите коротковолновой UV лампой и сами найдёте). Удобно запаять пластинку в UV прозрачный пакет и никогда ее оттуда не вынимать.
  • Окрашивание Etidium Bromide. В гель и буфер нужно добавить EtBr до 0.5µg/ml. Но! Окрашивание EtBr имеет чувствительность приблизительно равную чувствительности метиленового синего лишь для олигонуклеотидов ds > 20bp; ss > 40b.
  •  Met.синий
    [µg]
    EtBr
    [µg]
    ss16 b0.0510
    20 b0.051
    40 b0.050.01
    ds16 bp0.050.1
    20 bp0.050.05
    40 bp0.005-0.010.005-0.01

    Дополнения, комментарии, вопросы

    Гость /16.06.2005 12:39/
    Прошу написать знающих людей, как можно разогнать на электрофорезе изоформы цитохрома Р 450 (2% агароза, горизонтальный электрофорез).



    Mac-1 /17.06.2005 22:12/
    (Гость @ 16.06.2005 05:39)
    Ссылка на исходное сообщение  Прошу написать знающих людей, как можно разогнать на электрофорезе изоформы цитохрома Р 450 (2% агароза, горизонтальный электрофорез).


    Попробуйте ИЭФ - изоэлектрофокусирование в амфолитах (фармалитах, если их еще выпускают).
    Я когда-то видел фотографию разделения изоформ цитохрома именно таким способом.
    К тому же, если не ошибаюсь, эти изоформы входили даже в кит маркеров для ИЭФ. smile.gif



    _Danil_ /11.01.2006 21:25/
    При проведение количественного фореза (т.е. такого после которого вы будете вырезать кусок геля с нужным вам производным олигонуклеотида) НЕ следуйте дополнению от Маши (нагревание геля ускоряет полимеризацию)!
    Нагревание геля в процессе полимеризации чаще всего его (процесс) безусловно ускоряет но может привести к тому что гель получится корявый



    Oligolamer /10.04.2006 14:52/
    Автору (Администрации):
    почему бы не развести форез на качественный и количественный (главы в одной теме?), чтоб не было путаницы и "ляпов" из-за применения одного для кардинально другого?



    Guest /10.04.2006 15:33/
    Потому что надо всегда всё делать как следовает, и не делить форезы на "допустимо корявые" и "картиночные".



    guest: Oligolamer /11.04.2006 16:59/
    2Guest
    Не понял Вашего (логики) ответа.



    Redactor /11.04.2006 17:03/
    (Oligolamer @ 10.04.2006 13:52)
    Ссылка на исходное сообщение  Автору (Администрации):
    почему бы не развести форез на качественный и количественный (главы в одной теме?), чтоб не было путаницы и "ляпов" из-за применения одного для кардинально другого?


    Я сам просто не смогу разделить на две методики. У меня опыта не хватает нормально описать отличия одного от другого.



    Oligolamer /13.04.2006 13:06/
    Хорошо, может методики разводить и не надо (а просто я - ...lamer teapot.gif ).

    Но если можно (кто-нибудь добрый), объясните/уточните такие позиции в методике:

    *
    Подготовка форезного аппарата
    ...3. Если
    (кстати, "если после номера пункта стоит точка - то предложение пункта пишется с заглавной буквы)
    хочется, чтобы гель легко снимался со стекол — силиконизировать.

    У нас в лаборатории говорят, что силиконизирование даёт обратный эффект - гель лучше прилипает.
    З.Ы. При этом в комментариях для п.3. идёт ссылка на:
    п.3.
    Силиконизирование - см. "Сиквенс"

    Где
    bind-silane очень летучее вещество и даже небольшого его количества достаточно, чтобы приклеить гель к стеклу


    *
    Количество олигонуклеотидов на дорожку

    нижний предел (с красочками) - явно рассчитан на качественное определение...
    верхний предел (без красок) - для кол-венного определения
    Только что значит - разрешение ещё приемлемое? Если больше - то,что будет - дорожки "перекрываются" или олиги не "бегут"? confused.gif

    *
    Выбор % геля
    7. на 12х8х0.07см3 гель требуется ~7ml (лучше приготовить 10ml).

    Что за величины?!
    Выше же было "если брать ~10µg на 10х0.5 mm2 ячейку", т.е. толщина 0,5 мм;
    а тут вдруг 0,07 см какие-то (откуда ещё 0.2 мм "нарисовались")? eek.gif

    *
    расплавленную 2% агарозу (в ТВЕ 1x) налить ...


    КАКУЮ АГАРОЗУ?! - ведь в ПААГе олиги гоняют?! mad.gif
    Или эта статья выложена на всеобщее обозрение чтобы задурить головы возможным конкурентам?! frown.gif - ну, нельзя же так, право слово



    Тот Самый /13.04.2006 16:55/
    Слыш, ты эта... субординацию соблюдаи. Раз ламер, значит выводы не делай, особенно про задурить голову. Тебе не надо.
    Силан для силиконизирования двух сортов бывает: связывающий и отталкивающий.
    Ну и т.д. и т.п.



    A Chemist /14.04.2006 09:37/
    Силан для силиконизирования двух сортов бывает: связывающий и отталкивающий.

    Это не совсем точное утверждение. Есть еще как минимум один сорт, третий (не брак).



    Re /14.04.2006 11:44/
    (Oligolamer @ 13.04.2006 11:06)
    Ссылка на исходное сообщение  Хорошо, может методики разводить и не надо (а просто я  - ...lamer  teapot.gif ).

    Но если можно (кто-нибудь добрый), объясните/уточните такие позиции в методике:
    У нас в лаборатории говорят, что силиконизирование даёт обратный эффект - гель лучше прилипает.
    КАКУЮ АГАРОЗУ?! - ведь в ПААГе олиги гоняют?!  mad.gif
    Или эта статья выложена на всеобщее обозрение чтобы задурить головы возможным конкурентам?!  frown.gif  - ну, нельзя же так, право слово

    Спокойно. дружище, спокойно...
    Стекла мойте, силиконизировать "repel" - силаном вряд ли понадобится.
    Агарозу, если посмотрите на картинку, используют как пробку, чтобы акриламид до полимеризации не вытекал. Если толщина геля не как для сиквенса, он может вытекать даже при заливке в горизонтальном положении. тут уж кто резиночку прокладывает, кто агарозную пробку делает, кто спейсеры смазывает, - словом, лучше самодельную методику перенимать из рук в руки, или фирменную - по инструкции к прибору.



    Oligolamer /19.04.2006 16:22/
    ...и не видел я
    "инструкции к прибору"
    Это как - прибор для олигофореза? - звучит забавно
    (:
    К сожалению, хотелось бы чтоб эта онлайновая методика была концептуальна. А то пока что выгдляит так, как будто натянули материалу из разных методичек...



    Guest /10.05.2007 06:39/
    помогите пожалуйста.
    по методике на сайте, олиги можно увидеть по теням на бумаге или хроматографической пластинке. Не знаю что я делаю не так, но никаких теней не видно.
    Источник УФ - обычный трансиллюминатор.








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler