Главная страница MolBiol.ru > Методы > Олигонуклеотиды > PAAG очистка Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Очистка олигонуклеотидов из полиакриламидного геля

 
  1. после электрофореза перенести гель на Saran-wrap;
  2. локализовать нужный бэнд по тени на бумаге (или на хроматографической пластинке DC Alufolien Kieselgel 60F254);
  3. вырезать кусочек геля с бэндом и поместить его в 0.5ml пробирку с дырочкой во дне (эта 0.5ml пробирка вставлена в 1.5ml пробирку);
  4. добавить к кусочку геля 50µl 2M LiClO4 и разбить гель в мелкую крошку центрифугированием из 0.5ml пробирки в 1.5ml пробирку (14000rpm 0,5мин.)
  5. довести объём 2M LiClO4 до 350µl, элюировать олигонуклеотиды из крошенного геля при 60oC в течении 2 часов или в течении ночи на NT (лучше на шейкере);
  6. отделить раствор от кусочков геля фильтрацией сквозь 0.45µm микроцентрифужный фильтр;
  7. к супернатанту добавить 1ml ацетона и поместить на 1÷2 часа на -20oC;
  8. осадить олигонуклеотиды ЦФ 14000rpm 30мин. при 4oC;
  9. промыть осадок 200µl холодного ацетона, высушить при NT 15мин. и растворить в 15µl H2O;
  10. определить концентрацию спектрофотометрически и хранить раствор при -20oC.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 11098

    Комментарии

    Общие

  • В наших руках метод нормально работал для 20÷120-нуклеотидных олигов.
  • В наших руках получалось, что переосаждение ацетоном давало более чистые олигонуклеотиды, чем очистка на обратнофазной колонке. Для лигазной детекции нам пришлось переделать партию олигонуклеотидов (обратнофазные были менее чувствительны).


  • По пунктам

    п.2.

  • Белая бумага для принтера давала ту же чувствительность, что и хроматографическая пластинка. Дополнительное преимущество - можно использовать для каждого геля чистый лист.
  • Ультрафиолетовую лампу лучше расположить повыше и закрыть часть стекла картоном или пластиком так, чтобы оставшегося света едва хватало для локализации бэнда. Вырезать бэнды быстро. Всё это, чтобы не жечь олигонуклеотиды ультрафиолетом понапрасну.
  • Можно пользоваться сменным лезвием для скальпеля. Удобно иметь пакет с чистыми лезвиями, после вырезания сбрасывать лезвие в "грязное". Потом мыть и сушить сразу несколько лезвий.
  • Лучше сфотографировать гель до и после вырезания фрагмента. Можно использовать бытовой электронный фотоаппарат.
  • п.3.

  • Дырочку в пробирке можно сделать раскаленной иглой. Мы делали по две дырочки на пробирку со стороны "хвостика от обрезанной крышки", а при центрифугировании ориентировали пробирки "хвостиками наружу".
  • п.4.

  • Если вдруг после центрифугирования в верхней пробирке останется кусочек геля, можно вновь добавить 50µl 2M LiClO4 и центрифугировать ещё раз.
  • п.5.

  • Для ночной элюции можно оставить пробирки на бактериальной качалке.

    Дополнения, комментарии, вопросы

    Mks /08.11.2006 11:47/
    Уважаемые коллеги! Поделитесь опытом очистки олигонуклеотидов на полиакриламидном геле.Как проводится методика(более детально).Буду признателен и если смогу чем нибудь помочь Вам-всегда рад!
    Green4enko@bigmir.net



    Mks /30.11.2006 18:13/
    У меня есть вопросы по пункту 6-8.

    п.6 как отделить раствор от кусочков геля, если получается сплошная гелевая масса и настолько густая, что приходиться добавлять водный раствор лития перхлората больше 350 мкл, чтобы хоть что-нибудь отфильтровать. После фильтрации геля, часть его остается выше фильтра, а часть проходит сквозь фильтр, или же гелевая масса пролетает насквозь полностью.

    п.7-8 при добавлении ацетона фильтрат соответственно становится твердым веществом. Как поступать дальше - осадок содержит кусок геля. В п.9 требуется промывать осадок холодным ацетоном, но это не приведет к очистке олигов от остатков геля.

    Видимо, наша проблема заключается в фильтрации. Пробовали через наконечник пипетки с фильтром (предварительно измельчив и позамачивав).

    К гелевой массе добавляем жидкости достаточно: на 2 г геля 350+ мкл.

    Подскажите что мы делаем неправильно. Набили кучу шишек, а решения все невидно.








       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler