Главная страница MolBiol.ru > Методы > PCR > Компоненты PCR смеси Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Состав PCR реакции

 

    Состав обычной PCR реакции

    Конц.Сток100µl
    Буфер10х10µl
    MgCl2 (1-4mM)2.5mM25mM10µl
    dNTP’s (50-200µM)0.2mM10mM2.0µl
    Primer#1 & #2по 0.1µM10µMпо 1µl
    Polymerase0.05u/µl5u/µl1µl
    Матрица  ??
    Буфер для внесения20µl
    H2O mQдо 100µl 


  • Иногда в реакцию дополнительно вводятся различные вещества, которые улучшают специфичность (увеличивают выход).
  • PCR buffer 10x

    (хранить при +4oC):

    Конц.Сток500ml
    Tris Cl, pH 8.6*0.5M1M250ml
    KCl0.5M2M125ml
    MgCl215mM1M7.5ml
    Tween 201%100%
    p=1.108
    5.0ml
    5.54g

    H2O mQ112.5ml
    Конц.Сток500ml
    Tris Cl, pH 8.6*0.5M1M250ml
    KCl0.5M2M125ml
    MgCl215mM1M7.5ml
    Tween 201%10%50ml
    H2O mQ67.5ml

    p (10x Buf.) = 1.018 g/ml
    * - другой способ: 175ml (1M Trise-base) + 75ml (1M Trise-HCl).

    10х Буфер №2

    хранить при 4oС, p=1.022:

    Конц.Сток25ml300ml500ml
    Tris Cl, pH 9.00.1M1M2.5ml30ml50ml
    KCl0.5M2M6.25ml75ml125ml
    Triton X-1001%10%2.5ml30ml50ml
    H2O mQ13.75ml165ml275ml
    Конц.Сток25ml300ml500ml
    Tris Cl, pH 9.00.1M1M2.5ml30ml50ml
    KCl0.5M2M6.25ml75ml125ml
    Triton X-1001% 100%
    p=1.06
    0.25ml
    0.258g
    3.0ml
    3.09g
    5.0ml
    5.15g

    H2O mQ16.0ml192ml320ml

    Буфер для внесения

    5x, (хранить при 4oС)

    Конц.Сток100ml
    Сахароза60%тв.60g
    Cresol red (Na)0.25mM50mM0.5ml
    H2O mQ59.5ml

    p=1.2.

    3.33x, (хранить при 4oС)

    Конц.Сток%(w/w)100ml200ml700ml
    Betaine Na5M135.2g/M63.0067.6g135.2g473.2g
    Cresol red (Na)333µM50mM0.31333µl667µl2.33ml
    H2O mQ36.6939.37ml78.73ml275.6ml

    p~1.073g/ml

    PCR буфер 2.5х

    (хранить при +4oС)

    Конц.Сток100ml300ml
    Buffer (15mM MgCl2)2.5x10x25ml75ml
    Betaine3.75M5M74.75ml224.25ml
    Cresol red (Na)125 µM50mM250µl0.75ml

    p (2.5x buffer) = 1.06g/ml

    MgCl2

    25mM:

    Конц.Сток50ml
    MgCl225mM1M1.25ml
    H2O  48.75ml


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 57344


    Комментарии

    По отдельным компонентам.

    Буфер

  • Tris Cl. Высокое значение рН берется из-за того, что при повышении температуры рН Tris-буфера падает (температурный коэффициент ~ -0.031ед. рН/oC) и при 72oС составляет ~7.5.
  • KCl. Средние концентрации KCl стимулируют на 40-60% активность Taq полимеразы (но 0.2M - полностью ингибирует полимеразную активность).
  • Triton X-100. Предотвращает адсорбцию белка на поверхности пробирки.


  • MgCl2

  • Диапазон рабочих концентраций: 0.5-5.0mM (10mM - ингибирует полимеразу на 40-50%). Увеличение концентрации Mg2+ оказывает очень резкое влияние на специфичность и эффективность PCR: увеличивается выход, но более высокими темпами уменьшается специфичность. Оптимум зависит от последовательностей матрицы и праймеров.
  • Т.о. слишком низкая концентрация Mg2+ - низкий выход, слишком высокая - множество полос неспецифической амплификации.

  • На молекулярном уровне: Mg2+ образует комплексы с dNTP’s (именно эти комплексы являются субстратом для Taq pol). C Mg2+ стехиометрически связываются dNTP’s, PPi, EDTA, PO4. Повышение концентрации Mg2+ вызывает повышение температуры плавления DNA.


  • dNTP’s

  • Важно поддерживать концентрацию значительно выше, чем Km соответствующей полимеразы. Меньшие концентрации dNTPs - более высокая точность синтеза. Диапазон используемых концентраций 50-500 µM.
  • Количество: Если в 100µl реакции включится 50% dNTP’s, то количество продукта составит: m=50[%]x4[dNTP’s]x50[µM]x300[g/M]x100[µl]=3µg.
  • Важно иметь ввиду, что, т.к. dNTP’s обладают значительной буферной емкостью, сток dNTP’s должен иметь нейтральный рН.
  • Приготовление стока - "Однокомпонентные растворы".


  • Primer’s

  • Необходимое для реакции количество праймера совсем несложно оценить: если в 100µl будет синтезировано 3µg 500bp продукта, то на это должно пойти праймера: m=3[µg]/{300[g/M]x500[bp]x2[цепи]}=10pmol. Используемый диапазон концентраций: 0.1-0.6 µM.
  • Лучше, если пара "сбалансирована", т.е. разница температур плавления не превышает 2-4oС.
  • A-T - клонирование. Наиболее эффективно Taq полимераза добавляет "A", если 3'-концевой нуклеотид - "C" (разница по стравнению с другими концевыми буквами значительная). То есть, предпочтительно, чтобы праймеры начинались на "G".
  • Непроверенная информация Мы всегда полагали, что Taq-pol добавляет А к любому тупому концу, но есть статья, где сообщается, что это зависит от 3'-конца. Добавляется:

    G - если на 3'-конце G;
    A - если на 3'-конце C, T, A, причем весьма плохо, если последний нуклеотид A.
    => Лучше, если праймеры не начинаются на С или Т.

  • Хранение: иногда при длительном хранении на 4oС (или после большого количества замораживаний-оттаиваний) праймер "портится" - PCR с его участием даёт очень низкий выход. Мы не знаем, что при этом происходит, но проблема вполне решается 3х минутным кипячением и резким охлаждением.


  • Polymerase

  • Свойства различных полимераз описаны в "Свойства DNA полимераз".
  • Количество.
  • Taq pol.

    Если используется слишком маленькое количество Taq, выход продукта снижается, причем это снижение тем серьезнее, чем больше размер продукта. Не стоит использовать и слишком большой избыток Taq pol. При этом вначале появляются высоко- и низкомолекулярные шмеры (превышение ~2-4 раза), а затем весь продукт становится чрезвычайно маленьким (превышение ~4-16 раз).

    Pfu pol.

    Оптимум концентраций для Pfu polymerase существенно уже, чем для Taq. В случае (весьма редком), когда требуется провести амплификацию с Pfu pol. мы предпочитаем сразу ставить небольшой ряд разведений.

  • Для рутинного использования мы предпочитаем смесь Taq:Pfu=100:1. Судя по литературе у неё практически такая же, как у Pfu, точность синтеза, и мы убедились, что она не уступает Taq pol. в удобстве использования.
  • Стоит отметить, что полимераза - самый дорогой компонент реакции (если покупать коммерческую), и в то же время его совсем не сложно приготовить в лабораторных условиях и превратить в самый дешевый.
  • 1u Taq соответствует 43fmol белка (для Ampli Taq "Perkin-Elmer"). Ampli Taq. 250 000u - 1 mg, 1u -> 4ng, Mw=94kDa, => 1u=4ng/94 000Da=43x10-3pmol=43fmol.
  • Taq pol. обладает 5'-3' экзонуклеазной активностью. Эта активность может вызвать проблемы, связанные с деградацией 5' концов продукта.
  • Точность Taq-pol зависит от концентрации Mg2+, dNTP’s, сбалансированности dNTP’s, pH. В среднем, частота ошибок чуть ниже, чем 1 замена на 100-300bp.
  • Хорошо известно, что из-за того, что Taq полимераза с высокой частотой включает неправильные нуклеотиды для правильного определения последовательности нужно сиквенировать не одну клонированную матрицу, а несколько. Но!!! Это касается только клонированных PCR-продуктов. Если PCR-продукты сиквенировать непосредственно, то последовательность получается точной, т.к. для того, чтобы обнаружить мутацию, она должна присутствовать в >10% матриц. Это возможно лишь в том случае, если мутация произошла в первом цикле, а матриц при этом было не более 5 штук.


    Матрица

  • PCR продукт.
  • Достаточно ~ 22-25 циклов, чтобы довести PCR до насыщения, если матрица - другой PCR-продукт, разбавленный в ~ 106раз (учитывая и финальное разведение в самой реакции: например, развести PCR продукт в 16 000 раз и использовать 1µl разведения на 30 µl новой PCR-реакции). Внимание! Такие разведения требуют использования какого-либо агента, предотвращающего неспецифическую сорбцию на стенках пробирки: tRNA или какой-либо совместимой с PCR реакцией DNA в концентрациях ~ 0.1µg/ml.

  • Если используется :
    1. геномная DNA млекопитающих => <0.5-1µg;
    2. геномная DNA бактерий => ~1-10ng;
    3. DNA фага лямбда => достаточно 1µl из 200µl элюции одиночной бляшки;
    4. плазмидная DNA =>
      1. 0.1-1.0µl ночной культуры,
      2. совсем небольшое (на зубочистке) количество материала колонии;
      3. ~50ng очищенной суперскрученной DNA (такое большое количество берется из-за того, что pDNA - кольцевая и при понижении температуры она ренатурирует, не оставляя праймеру шанса связаться с ней. Если хочется уменьшить количество вносимой pDNA, нужно проводить предварительную щелочную денатурацию:
        1. pDNA (V<~4µl) в ТЕ, + 1µl 1N NaOH;
        2. 65-85oC, 5' ;
        3. резко охладить до 0oС или заморозить:
        4. + 1µl 1N HCl.
  • Если DNA перед реакцией переосаждается спиртом, то в качестве соли лучше всего использовать NH4Ac (NaAc может ингибировать PCR-реакцию).


  • Буфер для внесения

  • Мы обнаружили, что добавление 5x буфера с сахарозой улучшает результаты PCR, не сказываясь существенно на температурах отжига праймеров (по видимому, за счёт стабилизации фермента). Очень удобно использовать буфер, если требуется поставить одновременно целый ряд PCR- реакций, а затем проанализировать их на форезе. Сахароза делает раствор достаточно плотным для непосредственного нанесения, а Крезоловый красный служит цветным маркером (подробности "Агарозный гель-электрофорез").
  • 3.33x буфер с бетаином оказывает очень заметное стабилизирующее влияние на реакцию (суппрессируется действие различных ингибиторов, температуры плавления различных матриц становятся более близкими). Но нужно иметь в виду, что бетаин заметно снижает критическую температуру отжига праймеров (добавление сахарозы её не изменяет). В случае праймер-пары M-13/23 & M-13/30 Tamax снизилась с 71oС до 67oС при добавлении бетаина до 1.5M. Кроме того, если использовать 65-72oС как температуру полимеризации, то будут проблемы с A-T богатыми матрицами (мы пользуемся субциклами 59/65oC).


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/
  • Необходимое количество циклов, выбор температур и тому подобные параметры обсуждаются на странице "Параметры PCR реакции".
  • На сайте есть программа "Расчёт параметров PCR.", которая помогает оценить сбалансированность PCR реакции по нуклеотидам и праймерам и необходимое число циклов. Рассчитывается общее количество и концентрация полученного продукта. Оценивается, с какого цикла амплификация перестаёт быть экспоненциальной.


    Дополнения, комментарии, вопросы

    Гость /29.03.2006 11:45/
    Здравствуйте. Откликнитесь, пожалуйста, те, кто работает с пшеницей. Что используете в качестве положительного контроля, и если можно киньте ссылки. Работа застряла. Есть праймеры к пшеничному b-актину, но работать не хотят. Крепнет подозрение, что что-то с ними не то. Тем более статья, откуда дернули последовательности была какая-то сомнительная-не ссылок, не номеров.
    Буду отшень признателен.



    Гость /07.11.2006 08:50/
    а не подскажете сколько ксиленцианола можно добавить в ПЦР смесь?



    Redactor /07.11.2006 12:25/
    вот здесь есть:
    http://www.molbiol.ru/protocol/12_03.html ( http://www.molbiol.ru/protocol/12_03.html )



    Гость /18.04.2007 08:47/
    а что такое сток?



    Cathie22 /18.04.2007 10:26/
    (Гость @ 18.04.2007 08:47)
    Ссылка на исходное сообщение  а что такое сток?

    weep.gif



    ssve /18.04.2007 10:47/
    (Гость @ 18.04.2007 08:47)
    Ссылка на исходное сообщение  а что такое сток?

    сток = stock
    это концентрированный раствор реагента, из которого готовятся конечные растворы



    Борт /25.04.2007 20:42/
    Чем плох избыток фермента при протекании ПЦР?



    Yuri K /09.05.2007 05:34/
    (Борт @ 25.04.2007 20:42)
    Ссылка на исходное сообщение  Чем плох избыток фермента при протекание ПЦР?

    Тем, что с ним заносят избыток глицерина и пр. дряни.



    Гость /02.09.2007 16:24/
    Serg
    Известно полный сиквенс гена. Подскажите пожалуйста, как определить праймера для ПЦР, Меня интересуют в первую очередь программы.



    error /02.09.2007 19:21/
    (Гость @ 02.09.2007 10:24)
    Ссылка на исходное сообщение  Serg
    Известно полный сиквенс гена. Подскажите пожалуйста, как определить праймера для ПЦР,  Меня интересуют в первую очередь программы.
    http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest/



    Guest /04.09.2007 10:13/
    Уж сколько раз твердили миру: не праймерА, а прАймеры !!!



    Ъ /04.09.2007 11:02/
    (Guest @ 04.09.2007 10:13)
    Ссылка на исходное сообщение  Уж сколько раз твердили миру: не праймерА, а прАймеры !!!

    Да, действительно, ошибки на 3-штрих конце праймерОВ могут сыграть роковую роль. tongue.gif



    Гость /05.02.2008 16:07/
    Подскажите, плиз, сколько масла наслаивать?



    comp3v /05.02.2008 18:39/
    (Гость @ 05.02.2008 14:07)
    Ссылка на исходное сообщение  Подскажите, плиз, сколько масла наслаивать?
    да пофигу, главное чтобы смесь покрыло tongue.gif



    seqvencer /11.02.2008 12:38/
    По мне могу сказать проверяйте хлорид магния. Очень коварный реактив. И почаще его меняйте для своих смесей.



    seqvencer /11.02.2008 12:39/
    а насчет ошибок, ну полимеразку покупайте хорошую



    Гость /11.07.2008 07:52/
    Подскажите пожалуйста что можно сделать если температура плавления прямого и обратного праймеров сльно отличается-52 и 74С



    D evgenii /11.07.2008 07:57/
    Берите среднюю Tm-)))) Должно идти...



    Cinderella /11.07.2008 08:16/
    (seqvencer @ 11.02.2008 12:38)
    Ссылка на исходное сообщение  По мне могу сказать  проверяйте хлорид магния. Очень коварный реактив. И почаще его меняйте для своих смесей.

    всмысле? чем коварен?



    Cinderella /11.07.2008 08:19/
    (Гость @ 11.07.2008 07:52)
    Ссылка на исходное сообщение  Подскажите пожалуйста что можно сделать если температура плавления прямого и обратного праймеров сльно отличается-52 и 74С

    мне кажется лучше один из праймеров лучше поменять. что то очень большая разница.
    хотя я не знаю, если пцр не TagMan может оно и ничего. анализ колличественный?



    Guest /11.07.2008 08:34/
    Да, колличественный...должен быть, но пока вообще не идет. Праймеры брала по статье, и проверяла по бласту, но с большой вероятностью в них подвох...какой программой можно второй праимер подобрать?



    D evgenii /11.07.2008 09:07/
    Программ куча!!!
    #, Vector NTI...



    Cinderella /11.07.2008 10:09/
    вообще правда баз куча, единственно что нужно еще правильно ими пользоваться. лучше что бы кто нибудь показал. я пол года выбирала с какой удобно работать.

    я тут тоже долго вымучивала как и что, после всяких ехидничаний и посыланий мне все таки дали толковые советы.
    AlexanderL
    забавно. по-моему это прикольное разводилово ну да всё равно, может кому пригодится.
    1. идёте сюда и находите свой ген, например AFP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene )
    2. на странице гена http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?D...l.Gene_RVDocSum ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?D...l.Gene_RVDocSum )
    в разделе Genomic regions, transcripts, and products
    слева от схемки выбираете сини ссылки на mRNA (их может быть много), в открывшемся крохотном окне выбираете Genebank (про FASTA тоже помните на будущее)
    3. на странице данной мРНК можете всё про неё узнать, в том числе границы экзонов. ну и саму последовательнсоть в самом конце
    4. но работать удобнее с той же последовательнсотью в формате FASTA (идёте теперь по этой ссылке).
    5. копируете эту последовательность в окно программы http://frodo.wi.mit.edu/ ( http://frodo.wi.mit.edu/ )
    6. подбираете праймеры. неудобство тольо в том, что могут появиться праймеры, которые не будут работать на ДНК или на альтернативных транскриптах этого гена. иногда удобнее, чтобы праймеры работали на чем угодно (геномная ДНК, альтернативные транскрипты). тогда с учетом пункта 3 надо выбрать из последовательности только куски отдельных экзонов (разумеется, чем больше экзон для этого выберете, тем больше шансов найти в нем удачную пару праймеров).
    PS для работы с последовательностями лучше использовать специальные программы, возможно, вы не находите какие-то из праймеров только потому, что они даны в комплементарном виде к цепи, на которой их ищете (в норме так будут выглядеть тольо обратные праймеры). вообщем... сочувствую



    RJ Dio /11.07.2008 13:02/
    так можно, но сильно смахивает на чесание левого уха правой ногой



    Yuri K /11.07.2008 16:20/
    (Гость @ 11.07.2008 06:52)
    Ссылка на исходное сообщение  Подскажите пожалуйста что можно сделать если температура плавления прямого и обратного праймеров сльно отличается-52 и 74С

    Adjust primer concentrations. They do not have to be equal.



    RJ Dio /11.07.2008 16:33/
    а, вы опять про свое- неправда это. И вредно тоже. Разве что плазмиду ПЦрить, дык, оно по-всякому получится. Кстати, 74 гр- это нонсенс, выше 68-72 не имеет смысла считать вообще, двух-стадийный ПЦР- и все. Просто неграмотно



    Cinderella /11.07.2008 16:43/
    (RJ Dio @ 11.07.2008 13:02)
    Ссылка на исходное сообщение  так можно, но сильно смахивает на чесание левого уха правой ногой

    не знаю, мне понравилось. как то все картинки сложились, все по полочкам, систематизировалось.
    я по всяким базам раньше праймеры брала. как то знающие люди их проверили на всяких там программах типа бекондизайнер олиго аналайзер и т.д. сказали туфта, да и сама посмотрела - точно туфта, гомологов куча, Тм не совпадает с указанной...
    а из статей брать - опасненько. тоже накололась, поверила буржуям. есть правда нормальные, но там надо смотреть уже частности всякие, типа что и как использовали и для чего вообще.



    RJ Dio /11.07.2008 16:50/
    из статей- это точно, опасно бездумно копировать. Я хотел только сказать, что во многих случаях можно написать олиги просто глазками, работать будут не хуже Hi-tech-овых



    Cinderella /11.07.2008 17:19/
    (RJ Dio @ 11.07.2008 16:50)
    Ссылка на исходное сообщение  из статей- это точно, опасно бездумно копировать. Я хотел только сказать, что во многих случаях  можно написать олиги просто глазками, работать будут не хуже Hi-tech-овых

    согласна. просто еще по базе выдают Тм и конц магния и кучу еще всякой информации.



    Yuri K /11.07.2008 17:31/
    (RJ Dio @ 11.07.2008 15:33)
    Ссылка на исходное сообщение  а, вы опять про свое- неправда это.

    What, exactly, is "not true"?



    Guest /11.07.2008 19:53/
    (Гость @ 11.07.2008 06:52)
    Ссылка на исходное сообщение  Подскажите пожалуйста что можно сделать если температура плавления прямого и обратного праймеров сльно отличается-52 и 74С

    Если праймеры в реакции в эквимолярных количествах, конечно 52 лимитирует. Но можно увеличить т. отж. аж до 58-60, но при условии многократного избытка (в 5 раз) 52-праймера. Очень часто пользуюсь этим приемом, не жадничаю. Согласен с Хрипиным.
    RJ Dio, ну попробуйте хоть разок.



    Гость /20.07.2008 13:18/
    Знающие люди! Подскажите пожалуйста, из-за чего ещё могут образовываться димеры праймеров,кроме их высокой концентрации.



    Guest /21.07.2008 14:29/
    (Гость @ 20.07.2008 12:18)
    Ссылка на исходное сообщение  Знающие люди! Подскажите пожалуйста, из-за чего ещё  могут образовываться димеры  праймеров,кроме их высокой концентрации.

    Высокие концентрации праймеров на последнем месте. smile.gif
    В первую очередь "горячий старт", далее "кривизна" праймеров (сильные 5-торчащие шпильки, селф-и кроссдимеры) и и высокая концетрация Mg (напрмер, 5 вместо 2,5 mM) или очень низкая Т отж.



    Yuri K /21.07.2008 21:55/
    (Guest @ 21.07.2008 13:29)
    Ссылка на исходное сообщение  и высокая концетрация Mg (напрмер, 5 вместо 2,5 mM)

    With common PCR reagents/protocol, Mg2+ promotes P-Ds formation only up to 2.5-3 mM. At higher Mg2+ P-Ds are suppressed just as everything else is.



    The problem /23.07.2008 14:17/
    просто надо смотреть при дизайне олигов, чтоб не лип сам на себя и на парный олиг 3-концом (макс допустимый "залипон"- 4-5 букв, и то надо избегать). А высокая конц олигов вредна, но не критична. Что до магния, то прошли времена оптимизации его конц., сейчас везде 2,5, макс 3 мМ, многие полимеразы не очень чувствительны к вариациям магния



    Радимира /01.08.2008 09:59/
    Кто-нибудь!!! Объясните, пожалуйста, как подобрать праймеры на примере IL-2Ra (CD25)... confused.gif



    Гость /14.08.2008 13:22/
    Kuzminka: как увеличить выход продукта при ПЦР реакции с количеством циклов 45. Ведь до меня у людей получалось, а у меня нет? Еще один вопрос: "nested" ПЦР действительно помогает в таких случаях? Заранее спасибо! :)



    Гость /14.08.2008 13:23/
    Kuzminka: как увеличить выход продукта при ПЦР с количеством циклов 45. Ведь до меня у людей получалось, а у меня нет? Еще один вопрос: "nested" ПЦР действительно помогает в таких случаях? Заранее спасибо! :)



    phen /27.08.2008 12:38/
    Вообще такое количество циклов чревато громадной неспецификой. Что если снизить количество циклов и увеличить число вариантов одной и той же пробы?



    Гость /28.08.2008 10:40/
    Kuzminka: спасибо, конечно, но я уже пробовала таким образом, тоже ничего хорошего:полоски слабо видимые...



    akimovster /24.10.2008 04:50/
    Друзья! Подскажите каков состав буфера для разбавления Taq полимеразы.
    спасибо!!!



    Guest /24.10.2008 11:04/
    (akimovster @ 24.10.2008 03:50)
    Ссылка на исходное сообщение  Друзья! Подскажите каков состав буфера для разбавления Taq полимеразы.
    спасибо!!!

    http://york-bio.com/pcr%20related.htm ( http://york-bio.com/pcr%20related.htm )



    Ъ /24.10.2008 12:17/
    (akimovster @ 24.10.2008 03:50)
    Ссылка на исходное сообщение  Друзья! Подскажите каков состав буфера для разбавления Taq полимеразы.
    спасибо!!!

    Если разовая аликвотка - в 1-кратном ПЦР буфере, а если надо развести, например до 1 ед. на мкл, и хранить после использования - в буфере для хранения:50 mM Tris-Cl (pH 8.0 at 25 оC), 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 50% glycerol. Очень разбавленные ферменты плохо хранятся. umnik.gif



    Гость /03.03.2009 07:45/
    "Хранение: иногда при длительном хранении на 4oС (или после большого количества замораживаний-оттаиваний) праймер "портится" - PCR с его участием даёт очень низкий выход. Мы не знаем, что при этом происходит, но проблема вполне решается 3х минутным кипячением и резким охлаждением."
    реально кто нибудь это так делал? праймеры восстанавливаются? это правда? у меня праймеры по моему сдохли. им уже больше года. есть подозрение, что они где то сильно повалалялись без меня...



    D evgenii /03.03.2009 09:29/
    Реально, делали... Помогает, но не на долго!
    Вскоре они опять сдыхают...



    Ъ /03.03.2009 15:03/
    (D_evgenii @ 03.03.2009 08:29)
    Ссылка на исходное сообщение  Реально, делали... Помогает, но не на долго!
    Вскоре они опять сдыхают...

    Это как - оживают, но опять сдыхают? confused.gif confused.gif confused.gif



    Guest /03.03.2009 15:14/
    (Ъ @ 03.03.2009 14:03)
    Ссылка на исходное сообщение  Это как - оживают, но опять сдыхают? confused.gif  confused.gif  confused.gif


    ну что тут непонятного - обычная реинкарнация



    D evgenii /03.03.2009 17:46/
    Темная сторона праймеров: они вроде бы живые, но все-таки мертвые))))



    Guest /04.03.2009 07:02/
    (D_evgenii @ 03.03.2009 16:46)
    Ссылка на исходное сообщение  Темная сторона праймеров: они вроде бы живые, но все-таки мертвые))))

    а как это делается? у меня праймеры храняться на -20 в ддН2О. были разлиты на аликвоты в эпендорфы. как их кипятить. где ? в каких условиях? можно немного поподробней. пустьхоть не долго, но хоть еще поработают. а то прям бермудский треугольник - летом все было хорошо, а после отпуска случилось какое то чудо - и все сдохли. а их много.
    пожалуйста поподробней mol.gif



    D evgenii /04.03.2009 08:23/
    Можно пробирки с праймерами бросить в кипящую воду или нагреть при 99С на термостате (тоже помогало), минут 5-10 подержать. Затем или в лед, или в снег... Т.е. хорошо охладить, и продолжать юзать...



    natamat /11.03.2009 08:08/
    скажите, кто-нить что-нить слышал про ацетатный буффер для ПЦР, не для фореза - это ясно как божий день, а именно для ПЦР?



    Yuliya Khrunyk /14.03.2009 16:27/
    поставь в эпендорфах в термоблок на 99 градусов на две минуты, и потом - сразу на лед. Если есть возможность, делай gradient PCR



    Guest /01.04.2009 11:05/
    Подскажите, пожалуйста, есть ли какие то особенности амплификации кДНК.
    Дело в том, что имеется с десяток праймеров к кДНК одного гена ("садятся" на кДНК, ожидаемая длина продуктов от 1000 до 1600bp).
    Перепробовали различное сочетание концентраций Mg, dNTP, полимеразы, "сажали" праймеры на градиенте темеператур - результат - или полное отсутствие всякого присутствия, или масса неспецифики до 700bp, или шмеры от лунки (ближе к лунке ярче шмер). Может проблема в ингибировании ПЦР компонентами обратной транскрипции? Хотя выделение ДНК из RT-смеси с помощью колонок и glass milk не помогло (картина не отличалась от контрольных неочищенных образцов). Хелп frown.gif



    Ъ /01.04.2009 12:33/
    (Guest @ 01.04.2009 10:05)
    Ссылка на исходное сообщение  Подскажите, пожалуйста, есть ли какие то особенности амплификации кДНК.
    Дело в том, что имеется с десяток праймеров к кДНК одного гена ("садятся" на кДНК, ожидаемая длина продуктов от 1000 до 1600bp).
    Перепробовали различное сочетание концентраций Mg, dNTP, полимеразы, "сажали" праймеры на градиенте темеператур - результат - или полное отсутствие всякого присутствия, или масса неспецифики до 700bp, или шмеры от лунки (ближе к лунке ярче шмер). Может проблема в ингибировании ПЦР компонентами обратной транскрипции? Хотя выделение ДНК из RT-смеси с помощью колонок и glass milk не помогло (картина не отличалась от контрольных неочищенных образцов). Хелп frown.gif

    Возможно у вас дело до ПЦР не доходит, т.е. не идет обратная транскрипция нет в ПЦР кДНК.
    Нужно иметь под рукой всегда и на все контроли, контроли, контроли, контроли....



    Guest /01.04.2009 13:07/
    (Ъ @ 01.04.2009 11:33)
    Ссылка на исходное сообщение  Возможно у вас дело до ПЦР не доходит, т.е. не идет обратная транскрипция нет в ПЦР кДНК.
    Нужно иметь под рукой всегда и на все контроли, контроли, контроли, контроли....

    Спасибо за столь быстрый ответ smile.gif
    Дело в том, что эта же кДНК используется для постановки real-time PCR с TaqMan-зондами и там все ОК - кДНК искомого гена присутствует, амплифицируем же (точнее пытаемся) более длинный участок для последующего секвенирования.
    Может ли быть, что при очиске продуктов обр. транскрипции (колонки, силикатные частицы) вместе с кДНК остается значительное кол-во РНК которая и ингибирует амплификацию более длинных фрагментов или это ерунда?
    Я не молекулярный биолог, потому могу ляпнуть что-нибудь смешное smile.gif
    teapot.gif



    Ъ /01.04.2009 13:59/
    ОТ конечно может ингибировать ПЦР. но не настолько же. confused.gif
    http://genome.cshlp.org/content/4/1/62.full.pdf ( http://genome.cshlp.org/content/4/1/62.full.pdf )
    http://nar.oxfordjournals.org/cgi/reprint/33/20/e181.pdf ( http://nar.oxfordjournals.org/cgi/reprint/33/20/e181.pdf )
    Попробуйте без очистки кДНК, но добавьте ОТ смесь к ПЦР в количестве 10-20%. Но обязательное ингибирование ревертазы - 70-80 оС 10-15 мин.
    При очистки мизерных количеств возможны 100% потери umnik.gif



    Guest /02.04.2009 01:45/
    (Guest @ 01.04.2009 10:05)
    Ссылка на исходное сообщение  Подскажите, пожалуйста, есть ли какие то особенности амплификации кДНК.
    Дело в том, что имеется с десяток праймеров к кДНК одного гена ("садятся" на кДНК, ожидаемая длина продуктов от 1000 до 1600бп).
    Перепробовали различное сочетание концентраций Мг, дНТП, полимеразы, "сажали" праймеры на градиенте темеператур - результат - или полное отсутствие всякого присутствия, или масса неспецифики до 700бп, или шмеры от лунки (ближе к лунке ярче шмер). Может проблема в ингибировании ПЦР компонентами обратной транскрипции? Хотя выделение ДНК из РТ-смеси с помощью колонок и гласс милк не помогло (картина не отличалась от контрольных неочищенных образцов). Хелп frown.gif


    "Суперскрипту 3" возмите Инвитрогеновскую протянет вам кДНК в 11000 при 60 градусов ну а
    потом и пцрте



    Гость /10.04.2009 09:24/
    Вопрос от чайника. Сколько нужно взять праймера концентрацией 88 pmol/mkl, молярная масса 5530, чтобы финальная концентрация в 20 мкл была от 0,1 до 0,5 мкМ



    Ъ /10.04.2009 10:00/
    А проблема в чем? Не знаете мол.массу одного нуклеотида или ... нет калькулятора? confused.gif



    Гость /10.04.2009 10:11/
    Проблема в том, что нет знаний... Все остальное есть . Просто я никогда этим не занимался



    Гость /10.04.2009 10:12/
    Проблема в отсутствии нужных знаний... Все остальное есть



    Guest /10.04.2009 10:15/
    (Гость @ 10.04.2009 11:12)
    Ссылка на исходное сообщение  Проблема в отсутствии нужных знаний... Все остальное есть


    Начинать нужно с заучивания статьи Инниса и Гельфанда
    "Оптимизация ПЦР реакций" и повторять вслух утром и вечером ,
    как "Отче наш" smile.gif

    Innis MA and Gelfand DH (1990). Optimization of PCRs. pp. 3-12 in: PCR Protocols



    Ъ /10.04.2009 11:09/
    (Гость @ 10.04.2009 10:24)
    Ссылка на исходное сообщение  Вопрос от чайника. Сколько нужно взять праймера концентрацией 88 pmol/mkl, молярная масса 5530, чтобы финальная концентрация в 20 мкл была  от 0,1 до 0,5 мкМ

    88 pmol/mkl - надеюсь это выражение концентрации вы понимаете. А вот
    0,1 до 0,5 мкМ означает микромоли праймера в ЛИТРОВОМ объеме (большая буква М в мкМ на это указывает). Осталось пересчитать на ваши 20 мкл.



    Vovka Genetik /22.04.2009 20:07/
    [Подскажите, какие праймеры используют для ПЦР на объекте Linum ucitatissimum (лен). Заранее благодарен]



    Ъ /23.04.2009 17:24/
    (Vovka Genetik @ 22.04.2009 20:07)
    Ссылка на исходное сообщение  [Подскажите, какие праймеры используют для ПЦР на объекте Linum ucitatissimum (лен). Заранее благодарен]

    В переводе на русский: Доктор, ... у меня ... э-это... frown.gif confused.gif



    achiffa /08.07.2014 13:45/
    Здравствуйте!
    Вопрос такой: для обратной траскрипции и амплификации кДНК в одной пробирке (1 step RT-PCR) можно использовать смесь dNTP с dTTP? А то вот этой инструкции Applied Biosystems предлагает почему-то dUTP вместо dTTP.
    http://tools.lifetechnologies.com/content/.../cms_040930.pdf ( http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_040930.pdf )



    Alex2006 /08.07.2014 20:05/
    предлагает для того,чтобы в двухстадийной РТ-пцр можно было добавлять в мастермиксы урацил-днк-гликозилазу и избирательно элиминировать амплификацию с продукта предыдущих реакций, дабы избежать контаминации. dTTP в принципе использовать можно.



    achiffa /09.07.2014 13:26/
    Может, кто-то сможет прояснить, зачем тогда в АВ кладут в кит для 1 step RT-PCR всё тот же dUTP, если при этом нельзя использовать урацил-днк-гликозилазу?
    http://tools.lifetechnologies.com/content/...ls/4393463D.pdf ( http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/4393463D.pdf )



    Alex2006 /09.07.2014 16:10/
    Все просто - использование UDG имеет смысл только лишь в том случае, если ВСЕ пцр реакции данной лаборатории делаются на dUTP или на смеси dUTP/dTTP. Если где-то использовать , а где-то нет, то толку не будет, т.к. не всю левую днк от предыдущих амплификаций можно будет убрать из смеси перед пцр.



    -Ъ- /15.07.2014 12:25/
    (achiffa @ 08.07.2014 14:45)
    Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте!
    Вопрос такой: для обратной траскрипции и амплификации кДНК в одной пробирке (1 step RT-PCR) можно использовать смесь dNTP с dTTP? А то вот этой инструкции Applied Biosystems предлагает почему-то dUTP вместо dTTP.
    http://tools.lifetechnologies.com/content/.../cms_040930.pdf ( http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_040930.pdf )

    Значит, эту инструкцию читали невнимательно. Там есть ссылка на эту классику.
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2716852 ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2716852 )
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2227421 ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2227421 )
    (к сожалению у меня нет фултекста).
    Для расширения кругозора можете почитать:
    http://jcm.asm.org/content/31/9/2356.full.pdf ( http://jcm.asm.org/content/31/9/2356.full.pdf )
    На коротких GC-богатых ампликонах можно проколоться - основной недостаток UNG.








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler