Главная страница MolBiol.ru > Методы > PCR > Параметры реакции (температура, время) Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Параметры PCR реакции

 

Параметры обычной PCR реакции

  1. Td=95oC, 1';
  2. 25-30 циклов:
  3. Td=94oC, 10'',
    Ta=?, 30'',
    Te=?, ?;

  4. T=72oC, 45';
  5. T=4oC.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 24822


    Комментарии

    Общие

  • Следует обратить внимание на то, что под параметрами PCR (температура, время) можно понимать две, несколько различающиеся вещи:
  • а) те цифры, которые введены в PCR машину;
    б) те значения параметров, которые имеют место в пробирке.

    Мы не пытаемся намекнуть на то, что прибор может быть неисправным (хотя и это возможно). Мы, опять таки, не имеем ввиду различие между двумя приборами одного типа - обычно на них можно не обращать внимание.

    Мы хотим сказать, что для различных типов приборов связь между (а) и (б) может быть принципиально различна.

    Рассмотрим реализацию прибором двух шагов температурного цикла:

    Tа=44oС, 30'',
    Tc=72oC, 1'.

    Идеальная и реальная температурные кривые

    а) реальный цикл - гладкая кривая с конечными производными. На сколько близка эта кривая к идеальной определяется техническими возможностями прибора. Имеется принципиальная неопределенность (тем большая, чем дальше кривая от "идеальной") в том что же считать моментом начала и конца цикла. Создатели прибора определяют это, исходя из своих предпочтений.

    б) смена температур не происходит мгновенно. Разные приборы имеют разную скорость изменения температуры. Этот факт имеет принципиальное значение для PCR (если бы скачок между 44oС и 72oС происходил "мгновенно", отожженные праймеры просто свалились бы с матрицы. Именно благодаря тому, что Taq pol. успевает удлинить их во время нагрева, они удерживаются.)

    Как только речь заходит о "температуре в пробирке" появляются дополнительные сложности:

    1. распределение температуры неоднородно по площади нагреваемого элемента;
    2. вид температурной кривой зависит от объема реакционной смеси в пробирке;
    3. пластик пробирки - неплохой теплоизолятор. Различные типы пробирок (0.2ml, 0.5ml, 96-луночная плашка, 384-луночная плашка) имеют разные теплоизолирующие свойства.

    Нам кажется, что по "степени влияния" перечисленные выше факторы можно распределить в следующем порядке:

    1. Смена типа пробирок (0.5ml; 0.2ml; 96-луночная плашка, 384-луночная плашка) может потребовать очень существенных изменений параметров PCR.
    2. Смена типа прибора - могут понадобиться минорные изменения (главным образом, времени циклов).
    3. Смена объема реакции: обычно используются 0.5ml пробирки (25-100µl) и 0.2ml пробирки (5-100µl). Лучше не превышать 100µl, т.к. это может вызвать серьезные проблемы со временем разогрева и охлаждения.


    По пунктам


    Предварительный нагрев

  • Начальная денатурация матрицы. Если матрица одноцепочечная или PCR-продукт, этот этап лучше опустить.
  • Кольцевая pDNA - умеет ренатурировать после тепловой денатурации. 95oC, 1' - компромисс при котором, с одной стороны некоторая часть плазмид никуется и превращается в одноцепочечные продукты, а с другой стороны, не слишком большая часть матриц повреждается.


  • Количество циклов

  • Число циклов обычно 25-35. Слишком большое число циклов чревато насыщением PCR реакции:
    1. ограничение по праймерам: синтез длинных продуктов, образованных в результате использования в качестве праймера готового продукта,
    2. ограничение по нуклеотидам: большая доля одноцепочечных продуктов, синтез коротких продуктов.

    Td (denaturation)

  • Температура и время денатурации выбираются как компромисс между двумя желаниями:
  • * "хорошо" денатурировать матрицу,
    * не сильно повредить матрицу и Taq полимеразу.

    Проблема в том, что DNA разрушается при нагреве. Скорость разрушения зависит от буфера (при 96.5oC: H2O->2.5'; TE->7.5'; 20mM Tris, pH9.0->~10')

    Время "полураспада" Taq полимеразы в зависимости от температуры:

    92.5oС130'
    95.0oС40'
    97.5oС5-6'
  • Время денатурации сильно зависит от типа используемых пробирок. Для тонкостенных 0.2 ml достаточно 10-15'' на 94oС.


  • Ta (annealing)

  • Отжиг праймеров.
  • Более высокая температура - более высокая специфичность. Но как только она превышает некую критическую (для данной пары праймеров) количество продукта начинает резко снижаться.

    Обычно мы выбираем температуру отжига на 1-2oС меньше, чем температура плавления олигонуклеотидов. Хотим обратить внимание начинающих пользователей компьютерных программ, что хорошие программы требуют для определения Tm задания двух параметров:

    * концентрации праймеров;
    * концентрации соли.

    Концентрация соли = [Na+]+[K+]+0.7[Tris]. Для приведённого у нас буфера => 57mM.

  • В "серьезных" случаях (очень большое количество PCR с определённым праймером или реакции, в которых одна и та же пара праймеров амплифицирует сложный набор фрагментов) имеет смысл подобрать температуру экспериментально. Критерии подбора:
    1. Ta - слегка меньше (~1oC), чем температура, при которой начинает снижаться количество продукта;
    2. желательно, чтобы Taбыла чуть больше температуры, при которой уже не образуются праймер-димеры в реакции без матрицы.

    Тe (elongation)

  • Этап, на котором происходит основной синтез DNA. Широко распространено использование Те= 72oС, т.к. на этой температуре полимеразная активность максимальна (она определяется по включению метки в денатурированную и отожженную salmon sperm DNA, взятую в большом избытке). Однако, Те= 72oС приемлема не для всех случаев:
  • => В описании этого эксперимента есть важный момент, который нужно иметь ввиду: матрица взята в большом избытке, то есть, полимераза имеет возможность "пренебрегать" неудобными участками синтеза DNA. В реальном процессе полимеразе необходимо пройти все имеющиеся в наличии участки. Оказывается, что при температуре ~65oC синтез существенно меньше зависит от характера матрицы (но даже эта температура слишком велика для буфера с бетаином).
    => Матрицы с А-Т содержанием ~90% удаётся амплифицировать только снизив Те до ~60oС ( при этом скорость синтеза: 1kb/min).

  • Время синтеза определяется скоростью работы Taq-pol.
  • 75-80oС~150 нукл/сек~9 kb/min
    70oС>60 нукл/сек>3.6 kb/min
    55oС24 нукл/сек1.4 kb/min
    37oС1.5 нукл/сек190 нукл/min
    22oС0.25 нукл/сек15 нукл/min


    Пост-PCR

  • Считается, что циклы после PCR преследуют 2 цели:
    1. превращение некоторого остаточного количества одноцепочечных матриц (подвижность на форезе ниже) в двухцепочечные (более прямой способ решить эту задачу - провести несколько дополнительных (2-5) циклов без денатурации: только отжиг и удлинение);
    2. А-удлинение двухцепочечных PCR-продуктов (для клонирования в Т-вектор). Было показано, что этот процесс требует значительного времени (до 1h).

    В случае, если решаемая задача не зависит от названных пунктов, пост-PCR этап можно не проводить.


    4oC

  • По нашему мнению использовать PCR машину в качестве холодильника — не лучший способ ее применения (речь идет о постановке PCR ON). Кроме того, лучше сразу переходить к следующему этапу, если продукт реакции используется для клонирования или каких либо других "высоких" целей.


  • Проведение реакции

  • Ячейки PCR машины должны быть чистыми. Чистить хлопковой ватой, смоченной в 50% смеси изопропанол:вода.
  • 384- и 96-луночные ячейки PCR машины хорошо бы обработать Teflon-spray. Это позволит легко вынимать плашки из машины. Но! предостережение от Алексея Дронова: "Teflon spray не стоит злоупотреблять, а лучше его вообще не применять, так как через некоторое время он образует на плате плохо отмываемый и неприятный слой".

  • PCR-mix.
  • Удобно использовать смеси:

    1. все, кроме матрицы и Taq-pol.
    2. хранить при -20oС продолжительное время, при 4oС - несколько суток;

    3. все, кроме матрицы и праймеров.
    4. хранить при -70oС и -20oС продолжительное время, при 4oС несколько недель.

    5. все, кроме матрицы.
    6. Хранить при -70oС и -20oС продолжительное время, при 4oС не более суток. 1х замораживание-оттаивание не меняет эффективность работы Taq полимеразы.

  • Один из наиболее простых способов быстро проконтролировать прошёл или не прошёл PCR: добавить в реакционную смесь (без крезолового красного) EtBr до ~0.1 µg/ml (ещё до реакции). Если после PCR осветить пробирки UV, то светиться будут лишь те, в которых образовалось достаточное количество двухцепочечной DNA.


  • Удаление масла после PCR

    Мы применяем два способа:

    для 0.2-0.5ml пробирок.

    * заморозить на -20oС. Вода замёрзнет, масло – нет;
    * отсосать масло вакуумным насосом;
    * можно, дополнительно, сполоснуть охлаждённым (~4oС) хлороформом.

    для 96-луночных плашек фирмы "Techne".

    * положить плашку на поверхность жидкого азота, дать замёрзнуть и воде и маслу ~5' (масло при этом потрескается);
    * перевернуть плашку, постучать (масло высыпается, вода остаётся).



Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/
  • Необходимая концентрация компонентов PCR реакции обсуждаются на странице "Состав PCR реакции".
  • На сайте есть программа "Расчёт параметров PCR.", которая помогает оценить сбалансированность PCR реакции по нуклеотидам и праймерам и необходимое число циклов. Рассчитывается общее количество и концентрация полученного продукта. Оценивается, с какого цикла амплификация перестаёт быть экспоненциальной.


    Дополнения, комментарии, вопросы

    guest: Гость /20.09.2006 20:08/
    Тут вопрос возник. При работе на Gradient Palm Cycler стали плавиться рекомендованные стрипы! В чем дело?



    miniopticon /21.09.2006 11:45/
    Если Градиент 105 C- 135 C- то плавятся smile.gif)))



    Guest /21.09.2006 11:48/
    добав ь 2-4 пустух стрипа в колонки 1,2 и 11,12



    Guest /02.01.2007 14:42/
    у авторов кажется "концы с концами" того smile.gif
    сначала рисуют "быстрые " температурные переходы и учут -
    если быстро с 44 нагреть до 72 - то праймер свалится smile.gif
    потом пишут что активностъ Так полимеразы при 37 - 1.5 нуклеотида в секундуsmile.gif
    то есть ПРАЙМЕР уж ТОЧНО протянулся при 44 и не должен СВАЛИТСЯ smile.gif



    Guest /02.01.2007 14:55/
    еще одно "интересное" утверждение - если пробирка например 0.2 мл
    то переноси с циклера на циклер и программу не меняй smile.gif
    ну-ну smile.gif АБИ например работают тока в КАЛКУЛАТЕД ТУБЕ КОНТРОЛ
    то естъ ТАЙМЕР вклучается по температуре СМЕСИ
    а БИОМЕТРА - толъко по БЛОК КОНТРОЛ smile.gif
    и разница может бытъ 20 градусов в момент вклучения таймера!
    так напереносишся с АБИ на БИОМЕТРУ smile.gif что пцритъ бросиш навек frown.gif
    http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender...36&blobtype=pdf ( http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=1151936&blobtype=pdf )



    Guest /02.01.2007 17:22/
    (Guest @ 02.01.2007 13:55)
    Ссылка на исходное сообщение  еще одно "интересное" утверждение - если пробирка например 0.2 мл
    то переноси с циклера на циклер и программу не меняй smile.gif
    ну-ну smile.gif АБИ например работают тока в КАЛКУЛАТЕД ТУБЕ КОНТРОЛ
    то естъ ТАЙМЕР вклучается по температуре СМЕСИ
    а БИОМЕТРА - толъко по БЛОК КОНТРОЛ smile.gif
    и разница может бытъ 20 градусов в момент вклучения таймера!
    так напереносишся с АБИ на БИОМЕТРУ smile.gif что пцритъ бросиш навек frown.gif
    хттп://щщщ.пубмедцентрал.них.гов/пицрендер...36&блобтыпе=пдф ( http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=1151936&blobtype=pdf )


    а если Примусов поимееш - то ПЦРитъ не начнешь smile.gif)))))))))
    http://www.elite-genetix.ru/index.php?modu...page&pageid=132 ( http://www.elite-genetix.ru/index.php?module=CMpro&func=viewpage&pageid=132 )



    Гость /14.01.2008 19:31/
    Вопрос от не-биохимика: есть подозрение, что в нашей реакции образуются димеры праймеров (программка предсказывает довольно длинный участок димеризации - более 7-ми нуклеотидов, точно не помню); как я могу проверить, есть у меня димеры или нет? вВ противном случае, будем искать проблему в другом....



    Ъ /14.01.2008 20:57/
    (Гость @ 14.01.2008 18:31)
    Ссылка на исходное сообщение  Вопрос от не-биохимика: есть подозрение, что  в нашей реакции образуются димеры праймеров (программка предсказывает довольно длинный участок димеризации - более 7-ми нуклеотидов, точно не помню); как я могу проверить, есть у меня димеры или нет? вВ противном случае, будем искать проблему в другом....

    Если все семь букв GC, есть риск вляпаться. Однако, если реакция оптимизирована, проблемы с димеризацией может не будет.



    Ъ /15.01.2008 10:29/
    (Гость @ 14.01.2008 18:31)
    Ссылка на исходное сообщение  Вопрос от не-биохимика: есть подозрение, что  в нашей реакции образуются димеры праймеров (программка предсказывает довольно длинный участок димеризации - более 7-ми нуклеотидов, точно не помню); как я могу проверить, есть у меня димеры или нет? вВ противном случае, будем искать проблему в другом....

    Программа может возмущаться и отбраковать праймеры, но это не значит, что они плохие. Повторюсь, все зависит от того как все у Вас налажено в реакции - реактивы, циклер (циклер немаловажно, иначе от Гостя1 наслушаетесь такой критики eek.gif ). 7 букв по всему праймеру (если не CG и не подряд) - это обычное дело. А если 3-штрих конец торчит при этом, это даже хорошо. smile.gif



    Гость /15.01.2008 12:20/
    Спасибо за ответ.
    Да, реакция была оптимизирована и использовалась в нашей группе не менее 4-х лет (LCR-reaction, plasmid 3,6 kb). Но в руках нового человека с новыми праймерами она перестала работать вообще, даже со старыми "работавшими всегда" праймерами получили только по 1-3 колонии на чашку. Я ломаю голову, что же еще может быть причиной. Нет, не все Г-Ц подряд. Использовали разные полимеразы, разные оптимизированные протоколы для разных полимераз.



    Yuri K /15.01.2008 16:58/
    (Гость @ 15.01.2008 11:20)
    Ссылка на исходное сообщение  Спасибо за ответ.
    Да, реакция была оптимизирована и использовалась в нашей группе не менее 4-х лет (LCR-reaction, plasmid 3,6 kb). Но в руках нового человека с новыми праймерами она перестала работать вообще, даже со старыми "работавшими всегда" праймерами получили только по 1-3 колонии на чашку. Я ломаю голову, что же еще может быть причиной. Нет, не все Г-Ц подряд. Использовали разные полимеразы, разные оптимизированные протоколы для разных полимераз.

    When your PCR is shaky, a lot of hands-to hands pecularities become important. Among these, I would check the following:

    1. How reagents are mixed and kept, on ice or at RT? Adding primers on ice and keeping Master Mix on ice promotes primer-dimers.

    2. How long it takes to actually start PCR after the plate/tubes is ready? The longer you keep, the more P-D's you will get.

    3. Avoid old primer stocks.

    Also, whenever you can, even if you use hot-start polymerase, use "false hot start" method. I e, heat the block to 94 and only then place your plate into the block.



    Yuri K /15.01.2008 17:56/
    Also, check the basics. Some poorly trained individuals have no idea they have to shake and spin down anything that has been frozen after thawing. And make sure that after you explained them how to do this they won't start doing it with enzymes in 50% glycerol.



    Гость /28.11.2008 17:02/
    >Хотим обратить внимание начинающих пользователей компьютерных программ, что хорошие программы требуют для определения Tm задания двух параметров:
    * концентрации праймеров;
    * концентрации соли.

    Я обычно использую онлайн-инструмент
    http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ( http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ )



    Ъ /29.11.2008 14:05/
    (Гость @ 28.11.2008 16:02)
    Ссылка на исходное сообщение  >Хотим обратить внимание начинающих пользователей компьютерных программ, что хорошие программы требуют для определения Tm задания двух параметров:
    * концентрации праймеров;
    * концентрации соли.

    Я обычно использую онлайн-инструмент
    http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ( http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ )

    Халявная программа с дружественным предложением: синтезируйте олиги у нас!
    DNAstar и DNAsis надо покупать, и не за малые деньги. Но те не занимаются синтезом олигов.








       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler